Regolazione dell`espressione genica in eucarioti

Regolazione
dell’espressione
genica in eucarioti
-Regolazione spaziale
e temporale dei
geni eucariotici
-Regolazione a livello
trascrizionale
-Regolazione a livello
traduzionale
Alcuni elementi per la regolazione
genica negli eucarioti:
• Promotori: fattori di trascrizione e
repressori
• Enhancer
• Stabilita’ dell’RNA
• Splicing alternativo
• Risposta ormonale
• Rimodulazione della cromatina
• Metilazione del DNA
Stabilita’ dell’RNA: più è stabile e più cicli
di traduzione effettua
• Assicurata dal CAP5’ e dalla
polyA
• La lunghezza del polyA può
determinare la stabilità
dell’mRNA (mRNA per gli istoni
non hanno il polyA ed hanno una
breve emivita)
•La struttura della
regione 3’UTR non
tradotta influenza la
stabilita’ dell’mRNA
(sequenze AUUUA
ripetute nella 3’UTR
determinano breve
emivita dell’mRNA)
Se si trasferisce la
sequenza AUUUA ad un
mRNA stabile, questo
diventa instabile
SPLICING ALTERNATIVO
determinazione del sesso in
Drosophila: gene Sex-lethal
Esone incluso
Proteina non funzionale
Proteina funzionale per lo
sviluppo femminile
Esone rimosso
Risposta ormonale
Ormone steroideo
Ormone peptidico
L’espressione genica indotta da un ormone è mediata da specifiche sequenze
sul DNA, chiamate elementi HRE (elementi di risposta all’ormone)
ENHANCER
Enhancer: vi si legano
fattori di
trascrizione
speciali, che a loro
volta interagiscono
con i fattori di
trascrizione posti
sul promotore e con
la RNA polimerasi
-agiscono a distanze
molto ampie
-agiscono in entrambi
gli orientamenti
-effetti indipendenti
dalla posizione (a
monte o a valle del
gene)
L’enhancer UAS di lievito
Attivazione
dei geni del
metabolismo
del galattosio
Gal10 GAL4, fattore di trascrizione
che si lega all’enhancer UAS
(Upstream activating sequence)
Gal4
zincfinger è
espressa
costituti
vamente
Struttura Gal4
AD
DBD
TWO-HYBRID SYSTEM
COME DETERMINARE L’INTERAZIONE
TRA 2 PROTEINE
E’ BASATO SULLA COSTRUZIONE DI 2 TIPI DI IBRIDI:
1-DBD-BYTE
2-AD-PREY
BYTE (PROTEINA
NOTA)
DBD
AD
PREY (PROTEINA
INCOGNITA LEGANTE)
PROTEINA
NOTA
PROTEINA
INTERAGENTE
La cellula in cui c’e’ interazione tra le 2 proteine
sopravvive su terreno in cui l’aminoacido che viene
espresso o esprime il marcatore LacZ
Saccaromyces Cerevisiae
Attivazione
del reporter
essenziale x
la
sopravviven
za della
cellula
L’attivazione di un gene richiede
cambiamenti nello stato della cromatina
per avere accesso al DNA
Geni attivi ⇒ eucromatina
Geni inattivi ⇒ eterocromatina
Alcuni attivatori trascrizionali
modificano gli istoni acetilandoli
Alcuni repressori trascrizionali li
deacetilano
Una volta stabiliti, i cambiamenti
cromatinici possono persistere
attraverso le divisioni cellulari,
creando uno stato epigenetico
Eredita’ della condizione di inattivazione
2 tipi di condizioni in cui si trova
un promotore eucariotico
Se si legano
prima gli
istoni al
promotore la
trascrizione è
bloccata; se si
legano prima i
fattori di
trascrizione la
trascrizione è
attiva
Stato
inattivo del
promotore
Stato attivo
Transcription factors or nucleosomes may form stable
structures that cannot be changed merely by changing
the equilibrium with free components.
Chromatin remodeling
Il complesso SWI/SNF
permette il
rimodellamento della
struttura cromatinica e
lo slittamento dei
nucleosomi lungo il
DNA rendendolo
accessibile da parte
della RNA polimerasi II
e dei fattori di
trascrizione
I cambiamenti cromatinici possono
compromettere la funzionalità del
promotore, di un intero gene, o di
un intero cromosoma
I cambiamenti nella struttura della
cromatina iniziano attraverso la
modificazione degli istoni, nella coda
N-terminale, soprattutto degli istoni
H3 e H4.
Tipi di modificazione degli istoni
Tutti gli istoni possono essere acetilati:
l’acetilazione è incrementata nei geni
trascrizionalmente attivi e la cromatina
acetilata è più sensibile alla DNA-asi I
L’acetilazione è un fenomeno
reversibile
• Enzimi HAT (acetiltransferasi)
• Enzimi HDAC (deacetiltransferasi)
MODULAZIONE DELLA CROMATINA
•La struttura dei nucleosomi influenza la trascrizione
•Il dna più trascritto è più facilmente attaccato dalle
nucleasi
Acetilazione
attivazione
Acetilazione degli istoni
da parte di HAT
Apertura della
cromatina accessibile
alla trascrizione
La metilazione è associata ad
inattivita’ trascrizionale
• La metilazione avviene sugli istoni
(lisina 9 dell’istone H3) ad opera di
metiltransferasi
• Avviene sul DNA a livello delle isole
CpG sia di promotori sia di sequenze
geniche codificanti, ad opera di
metilasi
METILAZIONE DEGLI ISTONI
BLOCCO DELLA TRASCRIZIONE
AD OPERA DELLE METILTRASFERASI (DNMT)
L’attivazione
del promotore
richiede il
legame di
diversi fattori
La formazione di eterocromatina
non è rigorosamente definita dalla
sequenza
Quando un gene è trasferito, per traslocazione,
trasfezione o integrazione, in una posizione
adiacente all’eterocromatina, può diventare
inattivo, eterocromatinizzandosi
Effetto epigenetico o variegazione per
effetto da posizione
-L’inattivazione si diffonde dall’eterocromatina alle
regioni adiacenti per una distanza variabile
-In genere l’inattivazione di un gene avviene
durante le prime fasi dello sviluppo embrionale e
successivamente il gene è ereditato come tale dalle
cellule discendenti
Fasi dell’
eterocromatinizzazione:
-nucleazione (inizia in
sequenze specifiche)
-propagazione imprecisa
lungo il cromosoma
Le proteine leganti la cromatina
hanno domini comuni
• Cromo-domini
• Bromo-domini
HP1, hanno come target
l’eterocromatina
Presente in una varietà
di proteine che
interagiscono con la
cromatina aperta, in
particolare con le istone
acetilasi e fattori di
trascrizione
La proteina HP1
H3 →
deacetilato
→ metilato
→ legato ad
HP1
Inattivazione del cromosoma X
femminile:compensazione da dosaggio
Si riattiva
durante
l’oogenesi
Inattivazione
Aumenta
I 2 X degli
random di un l’espressione
X, ereditata dell’X maschile ermafroditi
esprimono in
dalle cellule
cromosomi
modo ridotto
discendenti
politenici
iperattivi
Il cromosoma X
• Elementi LINE
• Sequenze Alu ricche di GC
• Sequenze ripetute invertite e LTR
• Ricco di geni sesso-specifici, come geni
espressi nel muscolo, nel cervello, e geni della
prima spermatogenesi
Inattivazione dell’X nei mammiferi
-Il centro dell’inattivazione
di uno dei 2 cromosomi X è il
locus
XIC
o
centro
dell’inattivazione dell’X
-Se questo locus viene
inserito in un autosoma,
questo viene inattivato
-Xic è un locus cis-agente da
cui
parte
l’eterocromatinizzazione
che si estende su tutto il
cromosoma in entrambe le
direzioni
-Di tutto il cromosoma X
inattivo c’è il gene Xist (X
inactive specific transcript)
che è attivo solo nel
cromosoma inattivo
-Xist codifica un trascritto privo di
schemi di lettura, quindi un RNA che
non produce proteina (ncRNA)
-L’Rna di Xist si
cromosoma inattivo
trova
solo
sul
-Studi condotti sulle cellule di topo,
hanno dimostrato che Xist e’ prodotto
precocemente
da
entrambi
i
cromosomi, ma essendo l’RNA molto
instabile, viene facilmente degradato,e
solo sul cromosoma in cui viene
stabilizzato,
va
a
ricoprire
il
cromosoma poi inattivato
-Il cromosoma inattivo e’ visibile
durante l’interfase come corpuscolo
scuro
associato
alla
membrana
nucleare, detto Corpo di Barr
- Il cromosoma X inattivo si replica piu’
lentamente degli altri a causa della sua
cromatina molto condensata, ricca di
istoni H3 e H4 ipoacetilati
-Il locus XIST da solo non basta, ma servono elementi che
percepiscono il numero dei cromosomi X e della scelta
del cromosoma da inattivare
- L’elemento della conta sembra essere
localizzato a valle di Xist (3’)
- L’elemento della scelta sembra risiedere nel locus XIC
- E’ veramente random la scelta dell’X da inattivare?
Sembra che nei marsupiali e nei tessuti extraembrionali
di topo l’inattivazione dell’X e’ imprinted (o paterno o
materno), Importante un elemento a valle di Xist, che
modifica il rapporto 50:50 dell’inattivazione
Geni che sfuggono
all’inattivazione dell’X
• Sono geni che hanno dei loro omologhi
nel cromosoma Y
• Il loro escape dipende dalla sequenza
genica e non dalla loro posizione
• I geni che sfuggono all’inattivazione
dell’X hanno una regione 5’ meno ricca
di CpG
• I geni attivi nell’X inattivo sono
circondati da INSULATORS
Insulator
Sequenza di DNA agente in cis, che
previene il passaggio di effetti
attivanti o inattivanti
Le isole CpG
-Lo 0.7% del genoma umano
contiene
doppietti
CpG
-Il 2-7% delle citosine del DNA
dei mammiferi sono metilate
-La maggior parte dei gruppi
metile si trovano nelle isole CpG
- La metilazione avviene ad
opera di Metilasi e demetilasi
del DNA
La metilazione ha vari tipi di
targets
• CpG di promotori, che sono metilati
quando il gene e’ inattivo o
demetilati nel gene attivo
• CpG di DNA satellite, che, metilato,
stabilizza il DNA centromerico
Le metilazioni
responsabili di:
del
DNA
sono
-IMPRINTING
-patologie
-espressione tessuto-specifica
-Differenziamento cellulare
-Vecchiaia
-Carcinogenesi (ipometilazione di promotori di
oncogeni o ipermetilazione di promotori di
oncosoppressori → riprogrammazione dello
stato cromatinico)
-Inattivazione dell’X
IMPRINTING
• Alleli materni o paterni sono ereditati
metilati o no ⇒ differente comportamento
tra gli alleli ereditati da ogni genitore
Se l’allele
paterno attivo
porta una
mutazione
l’embrione
presenta il
fenotipo malato
Se l’embrione e’
femmina il gene
viene metilato nei
gameti durante la
gametogenesi
Se l’embrione e’
maschio il gene
materno deve
essere demetilato
L’IMPRINTING e’ regolato dallo stato di metilazione
di una sequenza cis-agente vicina al gene, chiamata
DMD o ICR (imprinting control region); la sua
delezione rimuove l’imprinting
Geni con opposto
imprinting regolati dallo
stesso ICR, che funziona da
insulator
IL REPRESSORE Kox1 che porta il dominio
KRAB
Proteine che contengono domini zinc-finger e
Domini di
Kruppel-associated boxes
repressione
trascrizionale
Domini di
legame al
DNA
Come funziona la repressione
Domini di
trascrizionale
operata
da
repressione
Krab?
trascrizionale
attivi sulle RNA
polimerasi I,II e II
Condensazione
reversibile della
cromatina
Sistemi ibridi TetR-KRAB
per accendere e spegnere
l’espressione genica eucariotica
La tetraciclina
stacca il
repressore da
TetO e attiva
l’operone
Repressore TetR che
blocca l’espressione
dell’operone Tet
TetO
TetA
TetR
Proteina di
efflusso della
tetraciclina
Proteina
repressore
Proteina di fusione KRAB-TetR
Geni eucariotici inducibili e reprimibili
basati sul repressore procariotico TetR-TetO
Repressore KRAB
KRAB
KRAB
tTR
tTR
Repressore della
tetraciclina tetR
QUALI SONO LE MUTAZIONI
GENICHE RILEVANTI
NELLO SVILUPPO E
MANTENIMENTO DEL
TUMORE?
STUDIO DELLA GENESI DEL
MELANOMA DIPENDENTE
DALL’ESPRESSIONE DI
H-RasV12G IN TOPI INK4a -/-,
QUINDI PRIVI
DELL’ATTIVITA’ DI
SOPPRESSIONE DEL
TUMORE
MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
ANIMALE
TRANSGENICO →
tutte le cellule
nucleate contengono
il transgene
ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI
a
b
Progenie con
cellule
germinali
portatrici del
transgene
Eredita’ mendeliana
del transgene
Cellule germinali aploidi
50% +
50% -
KRA
KRA
B
B
tTR
tTR
TetO
P
RasV12G
RISOMMINISTRAZIONE DI
DOXICICLINA