C3 - clonaggio

C3 - Clonaggio del gene EGFP – Purificazione GFP – DNA Fingerprinting
Clonaggio del gene EGFP
Difficoltà
Obiettivi didattici
Clonare un gene in un plasmide per ottenere un vettore di clonaggio con cui
trasformare un ceppo di E. coli che consenta l’espressione nel batterio di una proteina
verde fluorescente che potrà essere di seguito purificata.
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi, funzione della DNA polimerasi e enzimi di restrizione.
Descrizione
Il gene egfp (enhanced green fluorescent protein) viene isolato dal plasmide pEGFP in
cui è contenuto mediante la tecnica della PCR ed inserito nel vettore (pBluescript SK +),
in grado di esprimersi in un ceppo batterico di E. coli, reso competente alla
trasformazione. Sia il gene egfp che il vettore (pBluescript SK +) vengono tagliati con
opportuni enzimi di restrizione, purificati e uniti tra loro dall’enzima ligasi. Il nuovo
costrutto prodotto viene quindi utilizzato per trasformare un ceppo batterico di E. coli.
La prova dell’avvenuto clonaggio si ottiene trasformando un ceppo di E. coli con il
vettore costruito.
Purificazione della Green Fluorescent Protein (GFP)
Difficoltà
Obiettivi didattici
Purificare la Green Fluorescent Protein (GFP) precedentemente estratta da cellule
batteriche trasformate con il plasmide pGLO.
Prerequisiti
Amminoacidi, struttura proteine, comportamento delle sostanze idrofobe e idrofile e
interazioni intermolecolari.
Descrizione
L'esperienza prevede la purificazione della proteina GFP prodotta all’interno di
Escherichia Coli dal resto delle proteine del batterio. A tale scopo l’estratto batterico
totale verrà purificato mediante cromatografia ad interazione idrofobica.
Il risultato dell'esperimento viene verificato mediante l'osservazione alla lampada UV
della soluzione eluita dalla colonna. Le varie frazioni raccolte durante l’eluizione
avranno una diversa fluorescenza dovuta ad una diversa concentrazione della proteina
GFP.
DNA fingerprinting
Difficoltà
Obiettivi didattici
Confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA generati dalla digestione enzimatica
di plasmidi diversi, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli
organismi (fingerprinting).
Prerequisiti
Struttura del DNA, plasmidi e enzimi di restrizione.
Descrizione
La tecnica del fingerprinting, proprio per la sua peculiarità di consentire il confronto fra
genomi appartenenti ad individui diversi, trova applicazione in un vasto numero di
campi: medico, forense e genetico, solo per citarne alcuni. Questa esperienza,
condotta a scopo didattico, utilizza DNA batterico quale fonte di materiale da
analizzare. La prova riproduce i passaggi chiave dei primi test di fingerprinting eseguiti
nei laboratori di ricerca: digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e
visualizzazione delle bande di DNA.
L'osservazione delle bande prodotte dalla migrazione dei frammenti di DNA durante la
corsa elettroforetica, permette di confrontare e discriminare i diversi profili genetici e
comprendere le varie applicazioni della tecnica in ambito forense, medico ed
evoluzionistico.