Microarrays

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LA TECNOLOGIA
DEI
MICROARRAYS
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8 anni dopo: 4162 riferimenti bibliografici sui microarrays
I microarrays misurano il
livello di espressione degli
mRNA trascritti dai geni del
sistema biologico di interesse
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USI ED APPLICAZIONI DEI MICROARRAYS
MARCATURA DIRETTA DEI cDNA
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Come funziona la fluorescenza
Misurazione della fluorescenza
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I fluorocromi più utilizzati nell’ibridazione dei
microarrays
Limiti di sensibilità dei diversi metodi di
marcatura dei cDNA target
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COME FUNZIONANO I MICROARRAYS
COME FUNZIONANO I MICROARRAYS
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COME FUNZIONANO I MICROARRAYS
ANALISI DEI MICROARRAYS DOPO IBRIDAZIONE
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ANALISI DEI MICROARRAYS DOPO IBRIDAZIONE
Key Steps nell’applicazione di
microarray
Design sperimentale
Esperimenti di Microarray
Ad esempio, identificazione dei
markers del carcinoma mammario
Raccogliere dati tramite microarray in
tessuto normale ed in tessuti affetti da
tumore
Image Processing
Normalizzazione dei dati
Analisi dei dati
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Microarray Gene Chips
Esistono due tipi di microarrays:
– full-length cDNA chips (ad esempio, chips creati in
laboratori attrezzati partendo da library di cloni)
– oligo chips (ad esempio Gene Chips Affymetrix)
Microarray Gene Chips
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Ibridazione specifica tra due molecole di
DNA
Ibridazione specifica tra due molecole di
DNA
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L’intensità della fluorescenza emessa dalle molecole
ibridizzate alle sonde riflette l’abbondanza delle molecole di
mRNA nel sistema biologico che si sta analizzando.
Esempio:
•L’intensità dello spot corrispondente al gene A è pari a 100
Unità nel tessuto normale
•L’intensità dello spot corrispondente al gene A è pari a 50
unità nel tessuto canceroso
Conclusione:
Il livello di espressione del gene A nel tessuto normale è
significativamente più elevato che nel tessuto canceroso.
Identificazione dei geni espressi a livelli differenti
nei due sistemi biologici in esame:
•
Vi sono diversi fattori non biologici che possono influenzare I
valori di intensità su un microarray, come ad esempio il
background.
•
I livelli di espressione genica sono spesso di natura stocastica, e
quindi possono variare anche in condizioni molto simili
• Per rilevare in maniera accurata quali geni sono espressi a
livelli diversi, sono necessarie misure multiple nelle stesse
condizioni
Esempio:
• GENE A {10, 20, 15, 25, 15} versus {18, 27, 15, 10, 15}
• GENE B {100, 120, 134, 90, 105} versus {40, 27, 32, 38, 41}
• Sono espressi in maniera differente nei due tessuti?
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Identificazione dei geni espressi a livelli differenti
nei due sistemi biologici in esame:
• Esistono diversi metodi matematici per determinae se un gene è
espresso in maniera differente in diverse condizioni.
• Il più semplice è calcolare la media dei valori risultanti da diversi
esperimenti ripetuti e poi calcolare il rapporto tra essi ed ottenere
il “fold-change”.
• Il metodo più preciso, anche se più complesso, consiste nel
calcolare non solo la media dei valori, ma anche la deviazione
standard nel contesto di processi stocastici (T-test).
Identificazione dei geni espressi a livelli differenti
nei due sistemi biologici in esame:
Esempio:
•GENE A {10, 20, 15, 25, 15} versus {18, 27, 15, 10, 15}
•Media ± s.d. : 17 ± 5,7 versus 17 ± 6,8
•GENE B {100, 120, 134, 90, 105} versus {40, 27, 32, 38, 41}
•Media ± s.d. : 109 ± 17,3 versus 35,6 ± 5,9
•Fold-change: 109 / 35,6 = 3
Il gene B è 3 volte più espresso in un sistema biologico rispetto
all’altro. La differenza di espressione è significativa.
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GeneChip Affymetrix
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GeneChip Affymetrix
Nei GeneChip Affymetrix viene utilizzato cRNA marcato con biotina. E’
quindi necessario utilizzare due diversi chips per i due campioni di RNA
da confrontare ed è necessaria una elevata quantità di RNA da marcare.
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Nei GeneChip Affymetrix la sintesi delle sonde
oligonucleotidiche avviene direttamente sul vetrino tramite
FOTOLITOGRAFIA e CHIMICA COMBINATORIALE
PROTOCOLLO DI
AMPLIFICAZIONE
DELL’mRNA SECONDO
IL METODO DI
J. EBERWINE PER
OTTENERNE UNA
QUANTITA’
SUFFICIENTE PER LA
MARCATURA E LA
SUCCESSIVA
IBRIDAZIONE DI
MICROARRAYS
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RELATIVE CHANGES IN GENE ONTOLOGY
CATEGORIES IN CAROTIDS HARVESTED
48 h AFTER ARTERIOTOMY
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UPREGULATION
GENE NUMBER
DOWNREGULATION
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Minimum fold-change: 1.5
p value < 0.01 e < 0.005
VALIDAZIONE DEI RISULTATI OTTENUTI
TRAMITE MICROARRAYS
I risultati significativi ottenuti tramite microarrays vanno
convalidati tramite altre tecniche.
La più utilizzata è la Reverse Transcription - Real Time PCR.
Poiché le due tecniche hanno una diversa sensibilità, i
valori di fold-change ottenuti possono essere diversi, ma,
affinchè il dato sia confermato, il trend ottenuto tramite
microarrays e Real Time PCR deve essere lo stesso.
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