G It Diabetol Metab 2013;33:176-181
Nuovi orizzonti
La “metabolomica”: che cos’è
e che cosa può dirci nel diabete
in gravidanza
RIASSUNTO
L’analisi del metaboloma permette, insieme ad altre valutazioni
omiche, cliniche e di imaging, di delineare il fenotipo metabolico
individuale. I dati provenienti dalle scienze omiche potrebbero
quindi consentirci di disegnare il fenotipo della malattia diabetica, nonché la sua progressione, permettendoci di comprendere
perché alcune pazienti sviluppano diabete in gravidanza e altre
no; inoltre sarà possibile capire perché alcuni pazienti sviluppano complicanze e quali sono gli indici prognostici di tipo
biochimico della malattia diabetica in gravidanza.
A. Ragusa1, A. Lapolla2
1
DPT Ostetricia, AO Ospedale di Niguarda, Milano;
DPT Medicina, Università degli Studi di Padova, Padova
2
Corrispondenza: dott. Antonio Ragusa, via Alfieri 9,
20092 Cinisello Balsamo (MI)
e-mail: [email protected]
G It Diabetol Metab 2013;33:176-181
SUMMARY
Metabolomics: what it is and what it can tell us about diabetes in pregnancy
Metabolomic analysis, along with other “-omics” assessments,
can outline an individual’s metabolic phenotype. The -omics
findings could then be used to depict the phenotype of diabetes
and its progression. Metabolomics will help us understand why
some patients develop diabetes in pregnancy and others do
not, and what are the main biochemical prognostic indicators of
diabetes in pregnancy. It should also give some ideas why certain patients develop complications.
La metabolomica o metabonomica è una delle più promettenti scienze “omiche”. Il neologismo metabolomica, derivato dal suffisso inglese omics, designa un comparto delle
scienze biologiche in grande sviluppo: metabolomica, genomica, mRNA-trascrittomica, proteomica. L’Oxford English
Dictionary riconosce tre diversi significati al suffisso omic, il
terzo significato è quello che ci interessa: all constituents
considered collectively, si tratta quindi di una tecnica di tipo
olistico, che tende a considerare una serie di fattori complessi, riunendoli in un insieme che afferisce alla cellula e infine
all’individuo.
La metabolomica è in grado di studiare la complessità metabolica delle cellule, dei tessuti, come anche di interi organi-
Pervenuto in Redazione l’11-10-2013
Accettato per la pubblicazione il 15-10-2013
Parole chiave: metabolomica, metabonomica,
gravidanza, diabete, fenotipo metabolico
Key words: metabolomics, metabonomics, pregnancy,
diabetes, metabolic phenotype
177
La “metabolomica”: che cos’è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza
smi. Le sue applicazioni, presenti e future, in ambito ostetrico sono molteplici. In termini pratici la metabolomica, attraverso l’analisi dei metaboliti, permette di analizzare il singolo
prodotto finale della attivazione/inattivazione genica, che a
sua volta comporta una attivazione/inattivazione del RNA
messaggero, che può mettere in moto la potente macchina
enzimatica analizzata dal proteoma. Si tratta quindi di valutare il prodotto finale del metabolismo. Questa analisi permette di comprendere ciò che è realmente successo a livello
metabolico e non ciò che potrebbe succedere (genomica) o
che forse succederà (trascrittomica/proteomica). In pratica
qualsiasi piccola molecola con una massa inferiore a 1 kDa
può essere rivelata dall’analisi metabolomica. Essendo il prodotto finale metabolico influenzato dall’ambiente, l’analisi
metabolomica consente un interessante incrocio di informazioni, essa permette di analizzare le relazioni tra genotipo e
fenotipo e di correlare queste informazioni tra loro. La malattia diabetica, in gravidanza o no, è caratterizzata da una
stretta correlazione tra eventi genotipici (ereditarietà) e comportamento fenotipico (ambiente, esercizio, alimentazione),
di conseguenza può trarre dallo studio metabolomico enormi vantaggi conoscitivi e terapeutici.
La moderna metabolomica sorge da un’intuizione di Arthur
Robinson. Nel 1970, mentre lavorava presso il dipartimento
di chimica all’Università della California di San Diego, somministrando vitamina B6 a esseri umani e analizzando gli esiti
dell’analisi cromatografica, Robinson si rese conto che nell’urina vi erano migliaia di costituenti chimici che contenevano informazioni potenzialmente utili. In realtà Robinson stava
cercando di comprendere meglio le conseguenze dell’idea di
Linus Pauling, che la variabilità biologica possa essere spiegata anche dall’analisi nutrizionale. Insieme Robinson e
Pauling pubblicarono nel 1971 su Proceedings of the
National Academy of Sciences, quello che può essere considerato il primo studio metabolomico: “Quantitative analysis
of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography”(1). Tuttavia il termine metabolomica fu usato per la
prima volta solo molti anni dopo, da SG Oliver et al. nel
1998(2).
La metabolomica oggi riconosce un’enorme diffusione e uno
sviluppo applicativo/pratico in vari ambiti come le scienze
mediche, la biologia sintetica, la medicina di sistemi microbici e di sistemi animali e le piante; la grande diffusione della
metabolomica e la sua applicazione negli ambiti sopra visti
dipendono dal fatto che esiste un’importante associazione
tra il metaboloma e la fisiologia cellulare; se da un lato il
genoma trascritto e il proteonoma possono essere visti
come una conseguenza dell’espressione genica, il metaboloma rappresenta il livello finale di tipo omico, in un sistema
biologico, esso riflette quindi anche i cambiamenti della funzione fenotipica(3). In definitiva l’analisi del metaboloma permette, insieme ad altre valutazioni omiche, cliniche e di imaging, di delineare il fenotipo metabolico individuale (Fig. 1).
La metabolomica si basa sullo studio sistematico di una
serie completa di metaboliti in un campione biologico; praticamente quasi tutti i campioni biologici possono essere sottoposti a questa analisi: urine, sangue, tessuti, cellule, pus,
liquido amniotico, feci ecc. Questa tecnologia si avvale di
due fasi sequenziali principali:
1) una fase sperimentale, basata su analisi effettuate con i
metodi spettroscopici di analisi metabolica. I principali
metodi spettroscopici sono: la risonanza magnetica
nucleare (nuclear magnetic resonance, NMR), progettata
per valutare composti a basso peso molecolare, la
gascromatografia spettrometrica di massa (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) e la cromato-
Metodi di misurazione
del fenotipo metabolico
Bioinformatica/
analisi statistica
dei dati
Clinica
Scienze
omiche
Tecniche
di imaging
Fenotipo
Stato globale
di salute
Genotipo
Database
Fenotipo
metabolico
Stato
mentale/
emozionale
Dieta acuta
Microflora
intestinale
Dieta cronica
Forma fisica
Figura 1 Il fenotipo metabolico individuale.
Stile di vita
Fattori che influenzano
il fenotipo metabolico
Danni
tessutali
Raccolta, analisi e interpretazione
dei dati biochimici e molecolari
178
A. Ragusa e A. Lapolla
grafia liquida spettrometrica di massa (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS);
2) l’analisi multivariata dei dati e la loro interpretazione; quest’ultima fase prevede anche la consultazione di apposite librerie di dati(4) (Fig. 2).
La spettrometria di massa accoppiata a diverse tecniche di
separazione cromatografica, come la liquido o la gascromatografia e la NMR, sono i principali strumenti per analizzare un gran numero di metaboliti contemporaneamente. A
causa dell’enorme diversità delle strutture chimiche e delle
loro grandi varietà e abbondanza, diversi approcci complementari devono essere utilizzati per estrarre, rilevare, quantificare e identificare i molti metaboliti possibili(5,6).
Dopo le due fasi sequenziali principali, la fase successiva è
rappresentata dall’estrazione e dall’interpretazione delle
informazioni in un contesto biologico complesso, caratterizzato dalla grande quantità di dati prodotta dalle tecnologie viste sopra. L’applicazione di sofisticate tecniche di
analisi statistica di tipo uni- e multivariato, che utilizza strumenti, tra cui l’analisi dei cluster, la mappatura, le sovrapposizioni comparative e le heatmap, ha rappresentato non
solo un emozionante e rapido processo di apprendimento
per i biochimici, ma ha anche dimostrato che la modalità di
pensiero dominante in biologia deve cambiare, per consentirci di affrontare grandi insiemi di dati e distinguere tra
rumore e reali informazioni correlate al campione. Non possiamo più pensare solamente alla singola via metabolica,
ma dobbiamo analizzare le interrelazioni complesse tra
questa e gli altri sistemi, un chiaro esempio è il rapporto
esistente tra il microbiota intestinale, l’obesità e l’omeostasi
glucidica.
In definitiva la metabolomica ha permesso di identificare e
quantificare migliaia di molecole a basso peso molecolare
simultaneamente, permettendoci di avere una fotografia
dello stato metabolico globale, a livello sia tessutale sia cellulare dell’organismo in toto; questo consente di correlare
dinamiche di tipo genetico con dinamiche fenotipiche.
I cataboliti, analizzati dalla metabolomica, possono essere
considerati come una lingua, uno scambio di segnali tra o da
l’architettura genetica e l’ambiente(7) pertanto, la metabolo-
mica consente di fornire una diretta “lettura funzionale dello
stato fisiologico/patologico di un organismo”(8).
Esistono almeno tre differenti approcci concettuali in
metabolomica: l’analisi target (target analysis) il profilo metabolico (metabolite profiling) e l’impronta metabolica (metabolic fingerprinting):
1) l’analisi target è applicata da molto tempo e comprende
la determinazione e la quantificazione di un piccolo insieme di metaboliti noti (obiettivi) utilizzando una particolare
tecnica analitica specifica;
2) il profilo metabolico mira all’analisi di un grande set di
composti, sia preidentificato sia sconosciuto rispetto alla
loro natura chimica. Questo approccio è stato applicato
per molti sistemi biologici diversi, tra cui piante(9), microbi(10), urine(11) e campioni di plasma(8);
3) l’impronta metabolica, la “firma” o il profilo di massa del
campione di interesse viene generata e quindi confrontata in un ampio campione di popolazione per valutare le
differenze tra i dati. Quando i segnali in grado di discriminare in modo significativo i campioni vengono rilevati, i
metaboliti sono identificati e la rilevanza biologica di tali
composti può essere chiarita notevolmente.
L’analisi dei metaboliti nei fluidi corporei, soprattutto sangue
e urine, è praticata in maniera ordinaria per valutare il rischio
di diabete(12,13).
La metabolomica è stata utilizzata per valutare le differenze
tra il plasma di soggetti sani e quello di soggetti diabetici,
con l’obiettivo di generare l’impronta metabolica e scoprire le
differenze tra le due differenti popolazioni. In questo modo
sono stati identificati cinque potenziali biomarcatori: glucosio, acido 2-idrssibutirrico, acido linoleico, acido palmitico e
fosfato, caratteristici della malattia diabetica. Questi risultati
evidenziano come l’aumento di concentrazione degli acidi
grassi liberi sia un fattore essenziale nella patofisiologia del
diabete mellito. I dati riflettono sia le iperglicemie sia la deregolazione del metabolismo degli acidi grassi. Questi marker
plasmatici potenziali, sopratutto l’acido palmitico, l’acido
linoleico e l’acido 2-idrossibutirrico, potrebbero rivelarsi utili,
non solo nella malattia diabetica, ma anche nella gravidanza
diabetica, per monitorare l’andamento della malattia(14).
Campione
bilogico:
Intrepretazione
e analisi
globale
dei dati
Sangue
Feci
Urine
ecc.
Acquisizione spettrale
del campione
Importazione e
immagazzinamento dati
Analisi statistica
Figura 2 Fasi sequenziali dell’analisi metabolomica (modificata da Nicholson et al., 2002(4)).
La “metabolomica”: che cos’è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza
È noto da tempo che i bambini che sviluppano il diabete di tipo
1 possono avere marcatori di rischio già nel sangue del cordone ombelicale. È stato ipotizzato che il rischio di diabete di tipo
1 in età precoce possa essere aumentato se si nasce da una
gravidanza patologica e questo potrebbe riflettersi nei metaboliti presenti nel cordone ombelicale alla nascita. Un gruppo di
studio della Lund University ha utilizzato la metabolomica per
testare se il lipidoma nel sangue del cordone ombelicale è differente nei bambini cui la diagnosi di diabete di tipo 1 era effettuata prima degli otto anni di età. Lo studio caso-controllo ha
coinvolto 76 bambini, con diagnosi di diabete di tipo 1 insorto
prima di otto anni di età e 76 controlli sani, appaiati per il
rischio, HLA, sesso e data di nascita, così come per l’età della
madre e l’età gestazionale alla nascita. Lo studio ha rivelato
che la concentrazione delle fosfatidilcoline e delle fosfatidiletanolammine ombelicali erano significativamente diminuite nei
bambini cui la diagnosi di diabete di tipo 1 era effettuata prima
dei quattro anni di età. Gli autori concludono sostenendo che
l’analisi metabolomica nel sangue del cordone ombelicale è in
grado di identificare i neonati ad aumentato rischio di sviluppare diabete di tipo 1. I bassi livelli di fosfolipidi alla nascita potrebbero rappresentare i mediatori chiave che, attraverso modificazioni del sistema immunitario, determinerebbero la precoce
comparsa di autoimmunità pancreatica(15). Questo studio, se
confermato, avrà importanti conseguenze, in quanto la capacità di previsione della malattia diabetica è vitale per consentire la messa in atto di strategie preventivo/terapeutiche.
Recentemente Connor et al., applicando un sistema integrato di analisi del metaboloma/trascrittoma al diabete di tipo 2,
nei topi db/db e db/+ (controlli) ha trovato 24 differenti vie
metaboliche correlate con il metabolismo lipidico, inclusa la
gluconeogenesi, le disfunzioni mitocondriali, lo stress ossidativo e la sintesi degli aminoacidi; tali vie esprimono significative differenze nei topi in studio rispetto ai topi di controllo(16). Questi dati, se confermati nell’uomo e nelle pazienti in
gravidanza, potrebbero aiutarci a indirizzare le ricerche su
particolari vie metaboliche.
Suhre et al., applicando una multipiattaforma metabolomica,
che utilizzava anche la risonanza magnetica insieme alla
spettrometria di massa, su campioni di plasma di soggetti
diabetici e di controllo, ha identificato 420 metaboliti presenti nel siero. Gli autori hanno trovato differenze significative
soprattutto nelle vie metaboliche che afferivano al funzionamento renale, al metabolismo lipidico e interessanti interazioni della microflora intestinale residente che passano attraverso il ciclo degli acidi biliari(17).Questo studio è molto promettente poiché, come sostengono gli autori: “Al di là della moltitudine di metaboliti misurati, quello che emerge dal nostro
studio è una visione olistica delle differenze che riflettono le
variazioni globali nella fisiopatologia della malattia”. Gli studi
sulla microflora intestinale sono particolarmente promettenti
se pensiamo alla gravidanza; potrebbero permettere di modificare l’alimentazione per contribuire sia alla riduzione della
prevalenza del diabete in gravidanza, come anche l’impostazione di diete specifiche, personalizzate e mirate alla
modificazione della microflora intestinale.
Da quanto detto finora appare chiaro che la metabolomica
può essere utilizzata nella malattia diabetica e in particolare
179
nel diabete in gravidanza sia per acquisire conoscenze sui
meccanismi patogenetici della malattia sia per trovare biomarcatori che possano essere utilizzati a fini diagnostici, e per
valutare gli effetti terapeutici dei farmaci e/o degli alimenti.
La gravidanza complicata da diabete pregestazionale è gravata da una serie di complicanze materne e fetali che possono essere ridotte se il controllo glicemico è ottimale(18-20).
Anche nelle pazienti affette da diabete gestazionale (gestational diabetes mellitus, GDM), la cui prevalenza è notevolmente aumentata negli ultimi anni in relazione all’aumento
dell’obesità nelle donne in età fertile(21), il trattamento si è
dimostrato utile nel prevenire gli esiti avversi(22). Il GDM inoltre, determina, per la madre, un notevole aumento del rischio
di sviluppare un diabete di tipo 2 dopo il parto, e nel nascituro un aumento del rischio di obesità e alterazioni della tolleranza ai carboidrati in età adulta(23).
In due gruppi di pazienti gravide che hanno partecipato
all’HAPO study, l’analisi metabolomica del siero di queste
pazienti eseguita con due differenti metodiche, la spettrometria di massa per la misurazione degli aminoacidi e la gascromatografia, ha rivelato che le pazienti con elevata glicemia
plasmatica a digiuno (> 90° percentile) rispetto alle pazienti
con bassi livelli glicemici a digiuno (< 10 ° percentile) avevano un profilo metabolico coerente con l’insulino-resistenza:
alti livelli di trigliceridi, 3-idrossibutirrato e aminoacidi, inclusi
alanina, prolina e aminoacidi a catena ramificata. In sostanza l’analisi metabolomica ha rivelato importanti alterazioni nel
metabolismo dei principali macronutrienti e degli aminoacidi
nelle madri con livelli di glucosio elevati a digiuno(24).
Il GDM è associato, inoltre, a una serie di modifiche del tessuto placentare quali l’aumento di peso, determinato da un
aumento della cellularità, l’aumento della vascolarizzazione e
dei livelli di insulina fetale, tutte cause ben note di ipossia
fetale. Recentemente la spettrometria di massa associata a
elettroforesi bidimensionale in gel è stata utilizzata per valutare l’espressione proteica della placenta di donne affette
da GDM(25). I risultati dello studio hanno evidenziato un’aumentata espressione a livello placentare di 15 proteine associate a insulino-resistenza, al trasporto transplacentare del
glucosio, alla coagulazione e alla fibrinolisi.
In un successivo lavoro, utilizzando un approccio di spettrometria di massa MALDI associato a elettroforesi bidimensionale in gel, l’espressione proteica placentare è stata studiata in donne affette da GDM in buon controllo glicemico(26). I
risultati dello studio hanno evidenziato modeste alterazioni dell’espressione di alcune proteine, suggerendo che se il GDM è
ben controllato il proteoma placentare è poco compromesso.
Un recente lavoro ha confrontato il profilo metabolico dei
neonati di madri affette da diabete gestazionale trattate in
modo intensivo, con quello dei nati da madri sane. I risultati
dello studio hanno evidenziato che i neonati da madri affette
da GDM hanno livelli di glucosio più bassi e più alti livelli di
piruvato, istidina, alanina, valina, metionina, arginina, lisina,
ipoxantina, lipoproteine e lipidi rispetto ai controlli, suggerendo che una prolungata esposizione del feto all’iperglicemia,
durante la gravidanza, può cambiare il suo profilo metabolico alla nascita(27).
Nell’ottica della prevenzione è lo studio di Diaz et al.(28); essi
180
A. Ragusa e A. Lapolla
Gene set enrichment
analysis
Genetic
data
Metabolomics
data
MetScape
Compound
network
Compound - Reaction Compound - Reaction
network
enzyme - Gene network
Gene - Compound
network
Figura 3 Funzionamento di MetScape.
hanno dimostrato che le urine di donne che successivamente svilupperanno diabete gestazionale presentano elevati livelli
di 3-idrossiisovalerato e 2-idrossiisobutirrato, probabilmente
a causa dello stato alterato della biotina e degli aminoacidi
e/o del metabolismo intestinale (quest’ultimo forse in relazione ai valori di BMI più elevati trovati in queste pazienti).
I dati provenienti dalle scienze omiche potrebbero quindi consentirci di disegnare il fenotipo della malattia diabetica, nonché
la sua progressione, consentendoci di comprendere perché
alcune pazienti sviluppano diabete in gravidanza e altre no;
inoltre sarà possibile comprendere perché alcuni pazienti sviluppano complicanze e quali sono gli indici prognostici di tipo
biochimico della malattia diabetica in gravidanza.
La sfida per il prossimo futuro consiste nel combinare strategie per identificare e quantificare i metaboliti cellulari e sistemici, utilizzando le sofisticate tecnologie analitiche sopradescritte, applicando successivamente, ai dati ottenuti, le tecniche della statistica uni- e multivariata, utilizzando infine
metodi per l’estrazione di informazioni e l’interpretazione dei
dati. Con questo obiettivo in mente, sono state create delle
piattaforme bioinformatiche come il Plugin MetScape per
Cytoscape che fornisce gli strumenti di bioinformatica per la
visualizzazione e l’interpretazione dei dati metabolomici e
inserisce questi dati nel contesto del metabolismo umano.
Questa piattaforma, gratuita, consente agli utenti di creare e
analizzare le reti di geni e di composti, individuare percorsi
arricchiti da dati di profili di espressione e di visualizzare le
modifiche nei dati del metabolita (Fig. 3)(29-31).
La speranza è che, utilizzando questi strumenti, i ricercatori
possano generare ipotesi sulle reti metaboliche principali utilizzate dalla malattia diabetica, reti che rispondano a partico-
lari tipi di intervento che possono successivamente essere
testati per il loro valore terapeutico(32).
Conflitto di interessi
Nessuno.
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