Colorazioni e test biochimici
in microbiologia
Le colorazioni in Microbiologia
Perché colorare ?
• La cellula batterica è trasparente
contrasto insufficiente tra cellula batterica ed
ambiente circostante.
• I coloranti debbono consentire:
– forte contrasto tra i microrganismi ed il fondo
– differenziazione di vari tipi morfologici (forma,
organizzazione, colorazione Gram)
– evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule,
endospore)
Le colorazioni in Microbiologia
I coloranti
• I coloranti constano di ioni (positivi o negativi).
Al riguardo, essi possono essere suddivisi in:
– Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica,
violetto di genziana, cristalvioletto, tionina):
• Carica positiva
Affinità per le strutture acide
(superficie cellulare, proteine, acidi nucleici)
colorazione diretta
– Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo):
• Carica negativa
Affinità per le strutture basiche, si
depositano attorno al microrganismo
colorazione indiretta o negativa
Le colorazioni in Microbiologia
Preparativa
• Preparazione di soluzioni coloranti
– Soluzione alcoolica (colorante come sale):
• 10 g sostanza colorante + 100 ml alcool assoluto
– Soluzione idroalcoolica 10% (colorante subisce
dissociazione elettrolitica):
• 10 ml soluzione alcoolica madre colorante + 90 ml H2O
distillata
• Reagenti per colorazioni
– Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od
amplificano l’ingombro del campione: fenolo,
soluzione iodo-iodurata (LUGOL)
– Differenziatori, sostanze decoloranti: alcoolacetone, acido solforico al 20%
Le colorazioni in Microbiologia
Tipologie di colorazione
• Colorazioni PROGRESSIVE: si eseguono con
soluzioni molto diluite di colorante,
interrompendo tempestivamente la
colorazione
• Colorazioni REGRESSIVE: si eseguono con
una ipercolorazione e si usa poi un
differenziatore la cui azione decolorante va
interrotta tempestivamente
Le colorazioni in Microbiologia
Tecniche di colorazione
• Colorazioni SEMPLICI:
– un colorante basico (blu di metilene, fucsina fenicata)
viene applicato al campione fissato per un tempo
variabile. L’eccesso di colorante viene eliminato tramite
risciacquo con acqua
– Consente di rilevare la morfologia e l’organizzazione
cellulare
• Colorazioni DIFFERENZIALI:
– due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti,
differenziatori)
– consente di distinguere due differenti tipologie di
microrganismi o 2 differenti strutture di un
microrganismo
Tecniche di colorazione
Colorazioni DIFFERENZIALI
– Colorazione di Gram
– Colorazioni per bacilli acido-resistenti:
• Metodo di Ziehl-Neelsen
• Metodo a freddo di Kinyoun (carbolfucsina a
freddo)
• Metodo della fluorescenza con auramina
– Colorazione della capsula (inchiostro di china)
– Colorazione di flagelli (Leifson)
– Colorazione di spore
– Colorazione di lieviti e funghi
– Colorazione di spirochete
Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (1 di 2)
Porre un’ansata di colonia
(o sospensione) batterica
al centro di un vetrino
pulito
Se si preleva il materiale
da terreno agarizzato,
aggiungere una goccia di
acqua distillata al
campione
Le colorazioni in microbiologia
Allestimento di un preparato (2 di 2)
Aiutandosi con un’ansa,
stemperare il campione
nell’acqua e stendere il
preparato a coprire circa la
metà della superficie del
vetrino (preparazione dello
smear)
Lasciare asciugare il
preparato all’aria o tramite
calore (Bunsen). Fissare il
preparato passando il
vetrino 4-5 volte
direttamente sulla fiamma
Colorazione
Hans Christian Joachim
Gram
• Batteriologo danese ed
inventore della
colorazione di Gram (nel
tentativo di
differenziare Klebsiella
pneumoniae dagli
pneumococchi)
• Nato a Copenhagen il 13
Settembre1853.
Colorazione di Gram
Tecnica
Colorazione di Gram
Principio
•
•
Nei batteri Gram+ il cristalvioletto
e lo iodio si combinano a formare un
complesso
(CV-I)
di
grosse
dimensioni che precipita all’interno
della
cellula.
Il
decolorante
condensa per disidratazione la
struttura petidoglicanica. In questo
modo, il complesso CV-I viene
“catturato” dalla parete cellulare
Nei batteri Gram- il decolorante,
agendo come solvente lipidico,
dissolve la membrana esterna alla
parete cellulare così permettendo
il rilascio del complesso CV-I e,
quindi, la decolorazione della cellula
batterica.
Colorazione di Gram
Osservazione microscopica
• I batteri Gram+ appaiono blu
(Staphylococcus epidermidis)
• I batteri Gram- appaiono
rossi
(Escherichia coli)
Colorazione di Gram
Utilità clinica
(1 di 2)
• Idoneità del campione da sottoporre a coltura
• Diagnosi eziologica presuntiva
– meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea
ed infezioni piogene
• Suggerire la necessità di attuare tecniche non
routinarie
– anaerobi, funghi
• Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale
– angina di Vincent (spirochete, fusobatteri)
– paziente antibiotizzato
• Informazioni sulla natura dell’infezione
– infezioni poli-microbiche
Colorazione di Gram
Utilità clinica
(2 di 2)
Quindi:
• La conoscenza del risultato di una
colorazione di Gram può salvare una vita !
Tuttavia:
• La colorazione di Gram non deve essere effettuata su
campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena
non può essere differenziata da quella commensale
• La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:
– Legionella spp. (immunofluorescenza)
– bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (ZiehlNeelsen)
Colorazione di Gram:
l’eccezione
• La colorazione di Gram non è applicabile
a tutti i batteri.
• Esempi consistono nel Mycobacterium
tuberculosis e Mycobacterium leprae
• Incapacità di colorare per la natura
“cerosa” dell’involucro esterno,
altamente impermeabile ai coloranti
• Colorazione di Ziehl-Nielsen
Mycobacterium spp.
Parete cellulare
• Composizione:
– Grosse quantità di
glicolipidi:
• acido micolico (60%)
• complessi lipidiarabinogalattani
• lipoarabinomannani
– Scarso petidoglicano
Mycobacterium spp.
Parete cellulare
• Funzioni:
– Forma e prevenzione lisi
osmotica (peptidoglicano)
– Inibizione ingresso composti
chimici
• Crescita lenta
• Maggiore resistenza agli
agenti chimici
• Maggiore resistenza alla
fagocitosi
– Induzione sintesi citochine
(TNF-) da parte dell’acido
micolico
Le colorazioni in microbiologia
Colorazione di Ziehl-Neelsen
• Presenza caratteristica di ceramidi e fosfolipidi
sulla superficie cellulare di Mycobacterium spp. e
Nocardia spp.
• I coloranti ordinari non possono superare lo strato
cerato.
• Colorazioni con la tecnica per l’acido-resistenza:
– Kinyoun
– Ziehl-Neelsen
Colorazione di Ziehl-Neelsen
(carbolfucsina a caldo)
Tecnica (1 di 2)
Step 1:
• Versare la fucsina basica
Step 2:
• Fare evaporare scaldando il
colorante alla fiamma per 5 min
• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica
(2 di 2)
Step 3:
• Decolorare con alcool-acido fino
alla scomparsa del colorante
(circa 2 min)
• Lavare con acqua
Step 4:
• Contrastare con blu di metilene
per 1-2 min
• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Osservazione microscopica
• Gli organismi acido-resistenti (AFB=acid fast
bacilli) appaiono colorati in rosso
• Gli organismi non acido-resistenti risulteranno
colorati in blu
Colorazione per bacilli alcool-acido resistenti (BAAR)
Fotografia al microscopio di un campione polmonare colorato
mediante Ziehl-Neelsen che dimostra
la presenza di cellule di Mycobacterium tubercolosis.
Nell’immagine i micobatteri si presentano
come bacilli rossi alcool-acido resistenti (BAAR)
Le colorazioni in Microbiologia
Colorazioni speciali
La colorazione negativa viene usata
quando un organismo od una sua
struttura non viene colorata
facilmente come, ad esempio, in
presenza di capsula.
La colorazione delle spore richiede
calore per facilitare la penetrazione
del colorante
La colorazione dei flagelli richiede un
mordenzante per ispessire la struttura
flagellare
La colorazione negativa
Dimostrazione della presenza di
capsula in Acinetobacter sp.
mediante contrasto negativo con
inchiostro
di
china
ed
osservazione al microscopio a
contrasto di fase.
Bacterial capsules visualized by various techniques
Left. Streptococcus pneumoniae -India ink (A black pigment) capsule outline ; S.
pneumoniae capsular material is composed of polysaccharide. The capsule is the
pathogen's most important determinant of virulence because it allows the
bacterial cells to escape phagocytes in the lung. Middle. Bacillus anthracis fluorescent-tagged antibody (CDC); the B.anthracis capsule is composed
of poly-D-glutamic acid. Its capsule is antiphagocytic, and it protects the
bacteria from complement- mediated lysis in serum or blood. Rigth. Negative
stain (India Ink outline) of the capsule of Bacillus anthracis. CDC.
Flagellar stains of three bacteria
a. Bacillus cereus b. Vibrio cholerae c. Bacillus brevis
Since the bacterial flagellum is below the resolving power of the light
microscope, although bacteria can be seen swimming in a microscope field,
the organelles of movenent cannot be detected. Staining techniques such
as Leifson's method utilize dyes and other components that precipitate
along the protein filament and hence increase its effective diameter.
Flagellar distribution is occasionally used to differentiate between
morphologically related bacteria. For example, among the Gram-negative
motile rod-shaped bacteria, the enterics have peritrichous flagella while
the pseudomonas have polar flagella.
Le colorazioni in Microbiologia
Colorazione di flagelli
Colorazione di Leifson. Cellule di Helicobacter pylori
Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)
(da:
In this study, using the Leifson tannic acid-fuchsin method, we
performed touch cytology on smears obtained from gastric biopsies to
demonstrate H. pylori flagella
Tecnica di Schaeffer-Fulton
per la colorazione delle Endospore
Le spore sono impermeabili ai coloranti e possono essere
colorate solo con tecniche specifiche.
Colorante principale: verde malachite
Secondo colorante (di contrasto): safranina
La penetrazione del colorante principale nelle
spore è facilitata bollendo il campione per 4-5
minuti
Dopo aver lavato con acqua:
le spore trattengono il colorante principale e rimangono colorate di
verde
le cellule vegetative invece non trattengono il colorante e rimangono
incolori; vengono evidenziate aggiungendo il secondo colorante che le
colora di rosso
Spore di Bacillus species colorate
con la tecnica di Schaeffer-Fulton
Mature spores stain green whether free or still inside the
vegetative sporangium. Vegetative cells and sporangia stain
red. The Schaeffer-Fulton stain technique was applied. The
primary stain, malachite green, is forced into the spores by
heating the prepared slide to boiling for 4-5 minutes. After
washing, the vegetative cells are counterstained with
safranine.
Bacillus subtilis - Endospore stain
Principle: Spores have a durable outer coating that is composed of the
protein keratin. This keratin coat resists staining so in order to stain a spore
the primary stain, malchite green, must be heated to drive the stain into the
spores. Vegatative cells are then decolorized with water and 0.5% safranin is
used to counterstain. Thus endospores are stained green, while vegetative
cells are stained red.
Colorazione spirochete
Borrelia osservata al mo
in campo oscuro
Treponema pallidum, the spirochete
that causes syphilis. Silver stain. CDC.
Due spirochete al microscopio
a fluorescenza.
L'evidenziazione
dei
microrganismi nel campione di
sangue
è
resa
possibile
dall'arancio di acridina contenuto
nel capillare che li colora in
modo
caratteristico
ed
inequivocabile
durante
l'osservazione del capillare al
microscopio a fluorescenza.
Le spirochete possono essere visualizzate mediante esame in campo oscuro o tramite
colorazione di Giemsa o di Wright su goccia spessa e su striscio di sangue (metodi
batterioscopici x sangue). (L'esame del sangue e dei tessuti con arancio di acridina è più
sensibile degli strisci di sangue periferico colorati con Wright o con Giemsa.)
Tests biochimici
In microbiologia saggiando i prodotti chimici finali di processi
enzimatici e rivelando la scomparsa di alcune sostanze dal terreno
di coltura è possibile stabilire il profilo enzimatico di una
specie microbica, ed è possibile identificare e differenziare il
microrganismo
da
specie
affini.
I microrganismi si possono diversificare sia in base al tipo di
zucchero che fermentano, ma soprattutto in base ai diversi
prodotti finali che formano tra i quali: acidi organici (acido
lattico, acetico, e butirrico), composti neutri (alcol etilico,
acetone, alcol butilico) e diversi gas (metano, H2, CO2).
Le specie batteriche possono essere differenziate anche in
base alle loro capacità proteolitiche, cioè in base alla capacità
di degradare proteine, come ad esempio la gelatina, e di utilizzare
amminoacidi e peptidi che ne derivano per produrre energia.
TEST della CATALASI
sospetta colonia
di Stafilococco
Catalasi
+ H 2O 2
effervescenza
Alcuni batteri posseggono l'enzima catalasi, che scinde il perossido di idrogeno (H2O2) in
O2 e H2O. Il perossido di idrogeno è comunemente formato per via biochimica durante i
processi respiratori per mezzo della riduzione dell'ossigeno con due elettroni mediata
dalle flavoproteine. Quasi tutti i microrganismi che crescono aerobicamente producono
piccole quantità di perossido. Essi sono però capaci di neutralizzarlo mediante l'intervento
della catalasi.
Risposta di alcuni batteri: Bacillus, Micrococcus/Staphylococcus = +; Clostridium,
Streptococcus = -.
TEST della CATALASI
Test di attività della COAGULASI
Per l’identificazione di S. aureus
I batteri che producono questo enzima
lo utilizzano come meccanismo di
difesa;
In presenza di un fattore plasmatico le
coagulasi convertono il fibrinogeno in
fibrina, coagulano l’area di plasma
intorno ad essi, proteggendo cosi il
batterio dalla fagocitosi
Il test è effettuato inoculando i
batteri, in presenza di plasma, a 37°C
per qualche ora, la formazione di un
coagulo indica la positività al test
A sin. S. aureus
A dx: Altri Staphylococcus spp.
PROVA della COAGULASI
Test su vetrino
Test in provetta
Coagulasi legata
Coagulasi libera
e legata
TEST dell’OSSIDASI
•
•
un altro enzima respiratorio utilizzato spesso per l’identificazione di specie di
Neisseria e Pseudomonas è l’OSSIDASI, questo enzima è in grado di ossidare
ammine-aromatiche con produzione di composti colorati.
Il test si effettua facendo cadere su una colonia ben isolata su terreno solido, o
su di un’ansata di batteri posta su carta da filtro il reattivo contenente le
ammine-aromatiche, la comparsa di un colore porpora indica la positività della
reazione.
…….. ALTRI TESTS BIOCHIMICI
ß-emolisi
DNasi (Desossiribonucleasi)
Alone chiaro per depolimerizzazione del DNA contenuto nel terreno
Termonucleasi (DNAsi termoresistente)
Test del citrato su agar citrato di Simmons
Scissione del citrato in
acido organico e CO2
Viraggio da verde a blu
per formazione di sodio
carbonato
Synthetic test agar proposed by SIMMONS (1926) for the
identification
of
microorganisms
(particularly
of
Enterobacteriaceae and certain fungi) on the basis of their
metabolism of citrate, being the sole carbohydrate source.
Il terreno è particolarmente indicato per differenziare le salmonelle citrato positive (S. enteritidis e
salmonelle dei sottogeneri II, III, IV) dalle salmonelle citrato negative (S. typhi, S. paratyphi, S.
pullorum, S. gallinarum).
E.coli e Shigella : -
Test ureasi
Il test dell'ureasi avviene su terreni di Christensen.
Si fa un pesante inoculo.
Il terreno vira al rosa in tempi fissi a seconda della specie.
B. abortus vira rapidamente
test di determinazione
dell’attività b-galattosidasica
La b-galattosidasi è un enzima intracellulare che idrolizza il
legame b-glicosidico che unisce glucosio e galattosio in una
molecola di lattosio, il quale entra nella cellula ad opera della
galattosio-permeasi.
L’attività b-galattosidasica è legata ad enzimi
inducibili, cioè prodotti solo in presenza di un
substrato specifico.
test di determinazione
dell’attività b-galattosidasica
I batteri che fermentano il lattosio posseggono entrambi gli
enzimi ed idrolizzano rapidamente il lattosio.
I batteri non fermentanti il lattosio ne sono sprovvisti.
I batteri tardo-fermentanti il lattosio mancano della permeasi, ma
posseggono la b-galattosidasi che essendo inducibile può essere
svelata addizionando al terreno di coltura un substrato analogo al
lattosio come l’ONPG: o-nitrofenil b-d-galattopiranoside; se il
batterio ha attività b-galattosidica l’ONPG incolore verrà
idrolizzato e libererà un composto di colore giallo. L’ONPG è un
composto simile al lattosio che passa però nella cellula per
diffusione osmotica, in presenza di b-galattosidasi viene scisso
producendo l’ONP di colore giallo.
I batteri non fermentanti il lattosio sono privi di entrambi gli
enzimi e non idrolizzano l’ONPG.
Test ONPG
•
•
•
•
1. Positive Colony (Enterobacter, Escherichia)
2. Negative Colony (Proteus)
3. Negative Colony (Salmonella)
4. Negative Control
Identificazione di batteri e lieviti:
Sistemi automatici e semiautomatici
Vitek
Enterotube
Lettura computerizzata
API
I sistemi miniaturizzati, forniti da diverse case produttrici (es. Roche,
Biomerieux, Minitek, ecc.) hanno il vantaggio di fornire una serie di
terreni, in cui si evidenziano differenti attività biochimiche, in un'unica
soluzione che possono essere inoculati tutti in una volta e letti in un
tempo molto breve (circa 24h).
ENTEROTUBE: METODICA
OBIETTIVO:
L’enterotube è un sistema pronto all’impiego per l’identificazione rapida delle Enterobacteriacae che
consente l’esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche dei batteri.
PRINCIPIO: Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati di diverse
prove biochimiche:
- fermentazione del destrosio e produzione di gas
- decarbossilazione della lisina
- decarbossilazione dell’ornitina
- fermentazione del triptofano e produzione di H2S
- fermentazione dell’adonitolo
- fermentazione del lattosio
- fermentazione dell’arabinosio
- fermentazione del sorbitolo
- fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer)
- fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina
- idrolisi dell’urea
- utilizzazione del citrato
MATERIALI E STRUMENTI:
MATERIALI BIOLOGICI
Colture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes, ...
MATERIALI CHIMICI
Reattivo di Kovacs, alfa-naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml di acqua)
TERRENI DI COLTURA
Kit enterotube
VETRERIA, ...
Portaprovette, siringhe sterili
STRUMENTI
Termostato, bunsen
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 1
Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappucci dell’enterotube e
con la punta dell’ago prelevare una colonia isolata.
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 2, 3 e 4
Inoculare l’enterotube ruotando ed
estraendo l’ago
attraverso tutti gli scomparti del tubo.
Reinserire l’ago fino alla tacca e poi spezzarlo
piegandolo. La parte di ago che rimane all’interno
assicura l’anaerobiosi.
Con lo spezzone dell’ago perforare la pellicola di
plastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8
scomparti al fine di creare un ambiente aerobio.
Riavvitare i tappi.
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 5
Incubare a 35-37°C per 20-24 h possibilmente
in posizione verticale su un portaprovette
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 6
Registrare le reazioni (+ o -) e riportarle nella tabella
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 7
Eseguire il test dell’indolo iniettando con una
siringa 4 gocce di reattivo di Kovacs
direttamente sotto la pellicola di plastica
dello scomparto H2S/indolo (il reattivo vira
al rosso se la prova è positiva).
Un importante test che consente di differenziare tra specie di
Enterobatteri come, E. coli (+), Klebsiella ed Enterobacter (-),
è il test di produzione dell’INDOLO.
L’indolo è un prodotto del metabolismo del triptofano, alcuni
microrganismi sono capaci di ossidare il triptofano presente nel
terreno di coltura per bisogni nutrizionali grazie all’enzima
triptofanasi producendo un benzopirrolo detto indolo.
Test in provetta
ENTEROTUBE: METODICA
STEP 8
Eseguire il test di Voges-Proskauer
iniettando con una siringa 3 gocce di
soluzione di alfa-naftolo e 2 gocce di
KOH direttamente sotto la pellicola di
plastica dello scomparto VP (il reattivo
vira al rosso entro 10 minuti se la prova
è positiva).
Discrimina tra Klebsiella e Enterobacter (+) da Escherichia (-).
Caratterizza i ceppi di Bacillus.
Terreno di coltura costituito da acqua peptonata, fosfati e glucosio;a
crescita avvenuta, aggiunta di alfa-naftolo e KOH;
l’ acetilmetilcarbinolo, in presenza di KOH e aria, si ossida a
diacetile; questo reagisce con l’alfa-naftolo e con un prodotto di
rottura dell’ arginina presente nel peptone e dà origine ad un
composto di colore rosso.
ENTEROTUBE: RISULTATI
