Tesi di Dottorato

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UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE
FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA
DOTTORATO DI RICERCA IN NEUROSCIENZE
LOCALIZZAZIONE CELLULARE E SINAPTICA DI GAT-1 E
GAT-3 NELLA CORTECCIA CEREBRALE DI RATTO
Tesi di dottorato di
Relatore
Dott.ssa Silvia Ciappelloni
Prof. Fiorenzo Conti
Trienno 2010-2012
INDICE
Introduzione
3
Materiali e Metodi
6
Risultati
14
Discussione
27
Bibliografia
32
2
INTRODUZIONE
L’acido γ-aminobutirrico, GABA, è il maggior neurotrasmettitore inibitorio
nella corteccia umana, dove svolge un importante ruolo nel controllo dell’eccitabilità
(Krnjevic, 1997; Somogyi et al., 1998) e della plasticità neuronale (Jones, 1993) e nella
rete di sincronizzazione (Buszaki, 1995).
La maggior parte del GABA neocorticale origina da neuroni non piramidali i cui
terminali assonici formano contatti sinaptici simmetrici con neuroni piramidali e nonpiramidali (DeFelipe and Farinas, 1992; Kisvarday al., 1990). I neuroni GABAergici
corrispondono al 20-30% di tutti i neuroni corticali e sono presenti in tutti gli strati
corticali, mostrando una localizzazione preferenziale negli strati IV e II-III (Beaulieu,
1993).
Diversi fattori sono responsabili degli effetti postsinaptici del GABA: fattori
presinaptici (probabilità di rilascio e numero di siti di rilascio), fattori agenti nel vallo
sinaptico (diffusione e trasportatori) e fattori postsinaptici (localizzazione, numero e
stechiometria dei recettori) (Cherubini and Conti, 2001). Il GABA extracellulare viene
ricaptato da alcuni trasportatori di membrana ad alta affinità (GAT). Questo
meccanismo è essenziale al fine di controllare in maniera precisa la durata e l’intensità
dell’azione del GABA sui suoi recettori, modulando inoltre l’inibizione fasica e tonica
del GABA (Bragina et al., 2008).
Nel sistema nervoso sono stati identificati 4 trasportatori: tutti hanno un elevato
grado di omologia nella sequenza nucleotidica ed amminoacidica, trasportano GABA in
maniera Na+/Cl- dipendente e differiscono per la loro distribuzione tissutale (GAT-1,
GAT-2, GAT-3 e BGT-1) (Borden, 1996).
L’inibizione mediata dal GABA esercita un potente controllo su tutta l’attività
neuronale della corteccia e i trasportatori del GABA contribuiscono alla modulazione
3
della sua attività; di conseguenza alterazioni dell’attività o dell’espressione dei
trasportatori possono contribuire alla patogenesi di alcune malattie (Conti et al., 2004).
Tra i trasportatori del GABA, GAT-1 e GAT-3 sono quelli più espressi nella
corteccia cerebrale.
GAT-1 è il trasportatore più espresso nella corteccia; la sua distribuzione è stata
già descritta attraverso studi di mappatura (Durkin et al., 1995) e successivamente di
ibridizzazione in situ e tecniche di microscopia ottica ed elettronica. Gli studi di
ibridizzazione in situ nella neocorteccia di ratto hanno dimostrato che la maggior parte
delle cellule che esprimono GAT-1 sono neuroni ed alcuni sono astrociti (Minelli et al.,
1995). Tutti i neuroni che esprimono l’enzima GAD67 (acido glutammico
decarbossilasi, isoforma 67 kDa), un marker delle cellule GABAergiche, esprimono
anche GAT-1, al contrario non tutte le cellule in cui è presente RNAm di GAT-1,
esprimono GAD67; tra quest’ultime, alcune sono neuroni piramidali (glutammatergici),
suggerendo che anche i neuroni non GABAergici, esprimono GAT-1 (Minelli et al.,
1995). Precedentemente, alcuni studi di immunocitochimica (Minelli et al., 1995; Conti
et al., 2004) hanno dimostrato che l’ immunoreattività di GAT-1 è associata
esclusivamente a strutture puntate rappresentanti terminali assonici e fibre. Il pattern
ultrastrutturale di GAT-1 è composto da profili assonici e gliali; la marcatura a livello
assonico è intensa e sparsa nell’assoplasma di assoni mielinizzati ed in numerosi
terminali assonici che formano sinapsi simmetriche. Inoltre GAT-1 è stato trovato anche
in processi astrocitari sparsi nel neuropilo, a volte in stretta relazione con terminali
positivi per GAT-1; questi risultati sono in linea con quanto evidenziato da studi di
elettrofisiologia che mostrano la presenza di corrente mediata da GAT-1 negli astrociti
neocorticali (Kinney and Spain, 2002).
Contrariamente ai risultati di precedenti lavori (Durkin et al., 1995), la frazione
di GAT-3 nella corteccia cerebrale non è trascurabile (Minelli et al., 1996). GAT-3 si
4
presenta localizzato in piccole strutture puntate, molto difficili da risolvere al
microscopio ottico. GAT-3 è localizzato in processi astrocitari adiacenti a sinapsi
simmetriche, ma anche in alcuni prossimi a sinapsi asimmetriche (Minelli et al., 1996;
Conti et al., 2004). Inoltre è stata documentata la presenza di RNAm che codifica per
GAT-3 in alcuni neuroni (Clark et al., 1992; Durkin et al., 1995). Altri studi hanno
dimostrato che GAT-3 è presente a livello neuronale in particolari condizioni
patologiche, come l’ischemia cerebrale (Melone et al., 2003). Tuttavia nel lavoro di
Melone et al., 2005a, è stata messa in discussione l’espressione di GAT-3 nei neuroni e
proposto che questa possa essere un artefatto procedurale. In definitiva non è ancora
chiaro se, in condizioni fisiologiche basali, GAT-3 è espresso nelle cellule neuronali.
Sebbene in letteratura, siano già presenti studi sulla localizzazione di GAT-1 e
GAT-3, ad oggi mancano ancora dati quantitativi conclusivi sulla fine distribuzione dei
due trasportatori. In particolare, non sono note le proporzioni della distribuzione
neuronale e gliale di GAT-1 e di GAT-3, non è stata descritta l’organizzazione spaziale
di GAT-1 e GAT-3 in relazione alle sinapsi simmetriche e non sono noti i livelli di
espressione di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche corticali.
In virtù dell’importanza dei trasportatori del GABA nella trasmissione
GABAergica, la presente ricerca si pone l’obiettivo di studiare sistematicamente la
distribuzione sub-cellulare, l’organizzazione sinaptica e i livelli sinaptici di GAT-1 e
GAT-3 nella corteccia cerebrale di ratto mediante microscopia elettronica con tecniche
di pre- e post-embedding e microscopia confocale tridimensionale ad alta risoluzione.
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MATERIALI E METODI
Animali e preparazione del tessuto
In tutti gli esperimenti sono stati utilizzati ratti albini adulti (200-225 gr; n=10;
Sprague-Dawley; Charles River, Milan, Italy) e topi C57BL6 wild-type (WT) e
eterozigoti (HE) per GAT-1 (n=2, 1-4 mesi; Bragina et al., 2008). La gestione e la cura
degli animali sono state approvate dalla Commissione Etica per la Ricerca Animale
dell’Università Politecnica delle Marche. Gli esperimenti sono stati condotti in accordo
con la Direttiva 86/609 del Consiglio della Comunità Europea (24 Novembre, 1986) e
approvati dal servizio veterinario locale.
Gli animali sono stati anestetizzati con un’iniezione intraperitoneale di cloralio
idrato al 12% e perfusi per via transcardiaca con un getto di soluzione salina seguito da
una soluzione fresca di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato (TF) 0.1M.
Successivamente, i cervelli sono stati rimossi, post-fissati nella stessa soluzione per 2
ore e tagliati in sezioni coronali di 40 µm di spessore, con l’utilizzo di un Vibratomo. Le
sezioni sono state utilizzate per gli studi immunocitochimici (Melone et al., 2005b).
Anticorpi
Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati anticorpi policlonali del coniglio,
purificati per affinità, diretti contro le regioni C-terminali di GAT-1 (rGAT-1588-599;
Guastella et al., 1990) e di GAT-3 (rGAT-3607-627; Borden et al., 1992; Clark et al.,
1992). Entrambi gli anticorpi, GAT-1 (346-O; caratterizzato in Minelli et al., 1995 e
Guo et al., 2009) e GAT-3 (374-D; caratterizzato in Minelli et al., 1996 e Guo et al.,
2009), sono stati donati dal Dr. N.C. Brecha (Department of Neurobiology, UCLA, Los
Angeles, CA). In questo lavoro, gli esperimenti di controllo sono stati condotti
attraverso il pre-assorbimento degli anticorpi anti-GAT-1 e anti-GAT-3 con
rispettivamente i peptidi rGAT-1588-599 10-5 M e rGAT-3607-627 10-5 M.
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Inoltre, per gli studi di immunofluorescenza, è stato utilizzato un anticorpo
monoclonale, purificato per affinità, diretto contro VGAT (Synaptic System; catalog
number 131011; Witkovsky et al., 2008 e Burette et al., 2012).
Procedure
Immunoperossidasi. Le sezioni dei cervelli postfissati sono state trattate con H2O2
(1% in TF per 30 minuti) al fine di disattivare l’attività della perossidasi endogena,
lavate in TF, incubate per 1 ora in siero non immune di capra (NGS 10% in TF) e poi in
una soluzione contenente gli anticorpi primari (GAT-1, 1:400; GAT-3, 1:170) per 2 ore
a temperatura ambiente e per tutta la notte a 4°C. Il giorno seguente le sezioni sono state
lavate in TF, incubate in NGS 10% in TF per 15 minuti e poi per un’ora a temperatura
ambiente, in una soluzione contenente l’anticorpo secondario biotinilato anti coniglio
(1:150; Vector, Burlingame, CA, BA-1000). Le sezioni sono state successivamente
lavate in TF, incubate nella soluzione contenente il complesso avidina-biotina
perossidasi (ABC Elite PK6100; Vector, Burlingame, CA, USA; 1:100 in TF, 40
minuti), lavate di nuovo in TF e poi incubate con 3,3’tetraidro-cloro-diaminobenzidina
(DAB; 0,05% in Tris 0,05M con 0,03% di acqua ossigenata; 5 minuti). La specificità
della metodica è stata verificata sostituendo gli anticorpi primari con TF o NGS. Le
sezioni sono state poi lavate in TF, montate su vetrini cromallumati, lasciate asciugare
all’aria, disidratate in xilolo, coperte con vetrini coprioggetto e infine esaminate al
microscopio ottico Leitz Orthoplan (Wetzlar, Germany).
Al termine della procedura, le sezioni sono state postfissate in tetrossido di osmio
(1% in TF, 45 minuti) e colorate con acetato di uranile (1% in tampone tris-maleato; pH
6.0, un’ora). Dopo disidratazione in etanolo e ossido di propilene, le sezioni sono state
incluse nella resina Epon/Spurr, compresse tra fogli Aclar (Electron Microscopy
Sciences, Hatfield, PA, USA) e polimerizzate a 60°C per 48 ore. Sono stati tagliati
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blocchi di tessuto contenenti gli strati corticali II/III, selezionati dopo uno studio al
microscopio ottico, incollati su un pezzo di resina e sezionati all’ultramicrotomo (MTX;
Research and Manufactoring Company, Tucson, AZ, USA). Le sezioni ultrafini ottenute
(~60 nm), sono state raccolte e montante su griglie, incubate con acetato di uranile e
citrato di piombo ed esaminate al microscopio elettronico Philips EM 208 (Eindhoven,
The Netherlands) collegato ad una fotocamera CCD MegaView-II ad alta risoluzione
(Soft Imaging System; Munster, Germany). L’identificazione dei profili marcati è stata
condotta utilizzando criteri morfologici già noti (Peters et al., 1991).
Immunogold. Le sezioni di cervello sono state trattate per la procedura di
inclusione senza osmio (Phend et al., 1995). Le sezioni disidratate sono state immerse in
ossido di propilene, incluse in una miscela di resina Epon/Spurr, compresse tra fogli
Aclar e polimerizzate a 60°C per 48 ore. Sono stati tagliati dei blocchi comprendenti gli
strati corticali II/III, incollati su della resina e sezionati all’ultramicrotomo. Le sezioni
di circa 60-80 nm sono state poi montate su griglie, pronte per essere reagite (Phend et
al., 1992, 1995). In breve, dopo il trattamento con 4% parafenilendiammina in soluzione
salina di Tris [0.1 M di Tris, pH 7.6, 0.005% di Tergitol N P-10 (TBST)], le griglie sono
state lavate in TBST (pH 7.6), incubate prima in NGS 1% + TBST (pH 7.6) per 15
minuti, poi in una soluzione TBST (pH 7.6) contenente gli anticorpi primari GAT-1
(1:30) e GAT-3 (1:20), per tutta la notte. Il giorno seguente, le griglie sono state lavate
in TBST (pH 8.2) ed incubate dapprima in NGS 1% + TBST (pH 8.2), poi in una
soluzione TBST (pH 8.2) contenente l’anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con
una particella d’oro di 12 nm (1:20; 111-205-144, Jackson ImmunoResearch, West
Grove, PA, USA). Infine le griglie sono state lavate in acqua distillata ed incubate in
acetato di uranile e citrato di piombo. Come controllo, le sezioni non incubate con
l’anticorpo primario rivelano un assenza di marcatura; quando viene aggiunto del siero
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immune, sono state osservate alcune particelle d’oro, ma queste non mostrano alcuna
relazione con i terminali assonici o i processi astrocitari.
Le concentrazioni ottimali degli anticorpi anti-GAT-1 e anti-GAT-3 sono state
determinate testando diverse diluizioni e sono state scelte quelle aventi il minimo livello
di background caratterizzate ancora da elementi marcati. Le sezioni così trattate sono
state poi esaminate al microscopio elettronico.
Immunofluorescenza. Le sezioni dei cervelli post-fissati sono state esposte ad una
doppia marcatura con VGAT/GAT-1 e VGAT/GAT-3. Il tessuto è stato incubato
dapprima in NGS al 10% per 1 ora e successivamente in una soluzione contenente la
miscela di anticorpi primari diretti contro VGAT (1:70) e GAT-1 (1:400) e VGAT
(1:70) e GAT-3 (1:170) per due ore a temperatura ambiente e tutta la notte a 4°C. Il
giorno successivo, dopo i lavaggi in TF, le sezioni sono state incubate in NGS 10% per
15 minuti e poi in una soluzione contenente una miscela di anticorpi secondari coniugati
con due diversi fluorocromi, isotiocianato di fluoresceina (FITC, 1:250, Vector) e
isotiocianato di tetrametil-rodamina (TRITC, 1:250, Molecular Probes) per 90 minuti.
Le sezioni sono state infine lavate in TF, montate e coperte con Vectashield (H-1000,
Vector) ed esaminate al microscopio confocale Leica TCS-SP2.
Le concentrazioni finali degli anticorpi sono state definite testando diverse
diluizioni e scegliendo quelle aventi livelli di fluorescenza compresi in una proporzione
lineare. Inoltre la concentrazione finale dell’anticorpo anti GAT-1 è stata testata su topi
eterozigoti (HE) per GAT-1.
Gli esperimenti di controllo sono stati effettuati incubando le sezioni con i due
anticorpi primari ed un anticorpo secondario o con un anticorpo primario e due
secondari, rivelando un’assenza di cross-reattività.
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Raccolta dei dati
Microscopio elettronico: pre-embedding. Sono stati studiati i profili marcati con
GAT-1 e GAT-3 sulla superficie di sezioni ultrafini. I dati quantitativi ottenuti derivano
dall’analisi di 2500 µm2 di neuropilo corticale (2-4 griglie per animale; 2 animali). I
campi caratterizzati da profili positivi per GAT-1 e GAT-3 sono stati selezionati
casualmente ed acquisiti a 12,000 o 20,000 X. Al fine di valutare la localizzazione di
GAT-1 e GAT-3 a livello sinaptico, sono stati selezionati ed acquisiti campi a 30,000 o
50,000 X.
Microscopio elettronico: post-embedding. Sono state esaminate sezioni ultrafini
(4 griglie per animale; 2 animali) a 50,000-85,000X e sono stati selezionati campi aventi
almeno un terminale assonico e/o un processo astrocitario peri-sinaptico marcati
associati a sinapsi simmetriche, caratterizzate da una evidente zona attiva di densità
postsinaptica (AZ-PSD) (Peters et al., 1991; Tyler et al., 2001). Al fine di determinare la
densità di GAT-1 e GAT-3 nei compartimenti subcellulari, sono stati dapprima
identificati i profili astrocitari, i terminali assonici ed i nuclei di cellule piramidali, poi
sono state contate le particelle d’oro ed infine calcolate le aree degli elementi cellulari
marcati attraverso il software ImageJ versione 1.29 (NIH, Betheseda, MD, USA). Come
controllo è stata calcolata la densità delle particelle d’oro all’interno dei nuclei di cellule
piramidali (Racz and Weinberg, 2004; Melone et al., 2009;2011), la quale è stata poi
comparata alla densità delle particelle nei compartimenti subcellulari esaminati. Le
particelle d’oro vengono considerate associate alla membrana plasmatica se sono
comprese entro 15 nm di distanza dalla membrana, mentre sono considerate
citoplasmatiche se la loro distanza dalla membrana supera i 25 nm. La localizzazione
delle particelle d’oro associate alla membrana è stata definita misurando la distanza tra
il centro della particella stessa e la zona attiva (AZ) (Kharazia and Weinberg 1997;
Valtschanoff and Weinberg, 2001; Racz and Weinberg, 2004) attraverso il software
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ImageJ. In seguito, al fine di confrontare le distanze delle particelle codificanti per
GAT-1 e GAT-3 dai margini della zona attiva nei terminali assonici e processi
astrocitari, le misure delle distanze ottenute sono state normalizzate attraverso la
formula XN = 1 - |x1 – x2|/ x1 + x2, dove x1 e x2 corrispondono rispettivamente alla
distanza dall’estremità più vicina e più lontana della zona attiva (Racz and Weinberg,
2004). I risultati ottenuti sono stati poi oggetto di analisi statistica mediante il
programma GraphPrism.
Microscopio confocale. I dati sono stati raccolti dagli strati corticali II/III e V (2
sezioni per animale; 2 animali) utilizzando il microscopio confocale. La funzione
average è stata utilizzata per migliorare il rapporto segnale-rumore dell’immagine. Per
le immagini ad alto ingrandimento è stato usato un obiettivo ad immersione ad olio 63X
(apertura numerica 1.4), un pinhole di 1.0 unità Airy, dimensione dell’immagine
1024x1024 pixel e campi di 80 nm. L’acquisizione è stata effettuata sul piano Z (z-step
di 0.6 µm) per ciascun fluorescente; il gain e l’offset del fotomoltiplicatore sono stati
impostati in modo tale da non saturare i pixel più luminosi. Con lo scopo di ottenere
un’ottima risoluzione, ogni immagine è stata collezionata sulla superficie della sezione.
(Melone et al., 2005a). L’analisi delle immagini è stata effettuata tramite Imagesurfer 2,
un software 3D (www.imagesurfer.org; Feng et al., 2007) che permette di calcolare
l’intensità di entrambi i canali fluorescenti, quindi la quantità di GAT-1 e GAT-3,
tramite una visualizzazione tridimensionale dei terminali VGAT+. A tale scopo, i
terminali positivi per VGAT sono stati ricostruiti tramite la funzione Colored
Isosurface, la quale consente di colorare il terminale in base alle concentrazioni di
GAT-1 e GAT-3: questa tecnica proietta direttamente l’intensità di fluorescenza di
GAT-1 e GAT-3 sui terminali VGAT (il verde corrisponde a bassi valori di intensità
della marcatura, il giallo ad alti valori) (Figura 1A e B). L'utilizzo di un piano (slice
extractor) ha permesso di sezionare il volume di ciascun terminale (Figura 1A e B). Da
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questa funzione sono stati poi estrapolati i dati numerici relativi alle intensità lungo tutto
il diametro del terminale analizzato (Figura 1A’e B’). Al fine di ottenere valori di
intensità di GAT-1 e GAT-3 non influenzati da un possibile segnale di fondo
(background), le misure di intensità di GAT-1 e GAT-3 sono state normalizzate
dividendole per il valore medio di fluorescenza di ciascuna sequenza di immagini
allineate (stacks) (Marrs et al., 2001; De Vivo et al., 2010). Sono stati condotti degli
studi metodologici preliminari con lo scopo di verificare se nelle nostre condizioni
sperimentali, la tecnica 3-D della colored isosurface sia sensibile a variazioni del
segnale di fluorescenza di GAT-1 e GAT-3. Dapprima sono state testate concentrazioni
sequenziali degli anticorpi anti-GAT-1 e anti-GAT-3 (Figura 1C e D) confermando che
le concentrazioni di GAT-1 e GAT-3 nei terminali VGAT rispondono alle diverse
diluizioni degli anticorpi (Figura 1C’ e D’). In seguito è stato verificato che la reattività
di GAT-1 nei topi GAT-1 HE, i quali esprimono circa il 50% della proteina GAT-1
rispetto al WT (Bragina et al., 2008), risulta in circa il 50% dei terminali VGAT
ricostruiti tridimensionalmente, confermando che la tecnica è sensibile ai livelli di
proteina (Figura 1E e E’).
I risultati ottenuti sono stati poi oggetto di analisi statistica mediante il
programma GraphPrism v.4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA); α = 0.05.
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Figura 1. Microscopio confocale a tre dimensioni: analisi dei dati e studi metodologici
preliminari. A-B mostrano rappresentazioni in 3D della tecnica colored isosurface: la
superficie dei terminali VGAT è colorata sovrapponendo la marcatura di GAT-1 (A) o
GAT-3 (B). Questa tecnica rivela direttamente le concentrazioni di GAT-1 e GAT-3 nei
terminali VGAT ( il verde rappresenta bassi valori di intensità ed il giallo elevati valori;
la scala di intensità del colore è rappresentata in B). L'utilizzo di un piano (slice
extractor) (in A e B) posizionato interattivamente attraverso il terminale VGAT
permette di ottenere i valori di intensità lungo tutto il diametro del terminale analizzato,
A’e B’. C,-C’ e D-D’ mostrano come i segnali di GAT-1 e GAT-3 nei terminali VGAT,
siano sensibili a diluizioni seriali degli anticorpi. E-E’ mostrano la colored isosurface di
immagini derivanti da WT e GAT-1 HE: nei topi GAT-1 HE, i terminali VGAT colorati
con GAT-1 sono circa il 50% rispetto a WT. Questa analisi mostra che il rilevamento di
GAT-1 nei terminali VGAT in 3D è sensibile ai livelli di proteina presente. Taratura: 1
µm per A-B; 10 µm per E.
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RISULTATI
Immunoreattività per GAT-1 e GAT-3 nella corteccia cerebrale:
studi di pre-embedding
L’immunoreattività per GAT-1 e GAT-3 è concordante con studi già effettuati in
precedenza. L’analisi al microscopio ottico della corteccia cerebrale rivela infatti
numerose puncta per GAT-1 e GAT-3 (Figura 2A e E); nel caso di GAT-1 le cellule
positive comprendono neuroni e glia (Figura 2B e C) mentre per GAT-3 solo cellule
gliali (Figura 2F); sono inoltre evidenti profili perivascolari immunoreattivi per
entrambi i trasportatori (Figura 2D e G).
Figura 2. Immunoreattivtà di GAT-1 e GAT-3 nella corteccia cerebrale (strato V)
rilevata al microscopio ottico ad alto ingrandimento. A e E illustrano puncta marcate
con GAT-1 e GAT-3 disperse nel neuropilo (frecce); B, C e F sono esempi di cellule
immunopositive per GAT-1 e GAT-3; D e G sono profili perivascolari positivi per
GAT-1 e GAT-3 (punte di freccia). Taratura: 15 µm.
A livello subcellulare, gli studi di pre-embedding confermano che GAT-1 è
localizzato nel citoplasma di neuroni e astrociti (Figura 3A e B), mentre GAT-3 è
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confinato nel citoplasma dei soli astrociti (Figura 3G). Inoltre l’analisi al microscopio
elettronico del neuropilo rivela una marcatura di GAT-1 e GAT-3 anche in assoni
mielinizzati, dendriti e processi astrocitari prossimali, distali e perivascolari (Figura 3CF e H-K).
Sono stati quindi quantificati i profili positivi per GAT-1 o GAT-3: GAT-1
(n=300 profili; 126 campi) è presente per il 3.4 ± 0.7 % in profili non identificati, per il
54 ± 2.1% in assoni e dendriti e per il 42.5 ± 2.1% nei processi gliali (Figura 3L).
L’analisi statistica rivela che l’espressione di GAT-1 nei neuroni è significativamente
più alta (P<0.001) rispetto ai processi astrocitari (Figura 3L) e che negli stessi neuroni,
GAT-1 è localizzato preferenzialmente negli assoni (69.2 ± 3%) rispetto ai dendriti
(30.8 ± 3%; P<0.0001; Figura 3M).
Per quanto riguarda i profili positivi per GAT-3 (n=228 da 144 campi), il 2.9 ±
0.8% non sono identificabili, il 25.8 ± 3% ed il 71.2 ± 3.1% sono rispettivamente
neuroni e processi gliali. L’analisi statistica applicata a questi risultati evidenzia come
l’espressione di GAT-3 sia significativamente più alta (P<0.001) nei processi astrocitari
rispetto a quelli neuronali (Figura 3N) e che in riferimento ai processi neuronali,
l’espressione dendritica (60 ± 6.1%) è significativamente più alta rispetto a quella
assonica (40 ± 6.1%; P<0.05; Figura 3O).
Successivamente, sono stati quantificati i profili GAT-1+ e GAT-3+ in relazione
alle sinapsi corticali. I risultati ottenuti hanno dimostrato che GAT-1 è localizzato
principalmente a livello sinaptico (il 60.4 ± 2.2% dei profili si trova in stretta
associazione con le sinapsi, mentre il 39.6 ± 2.2% non lo è, P<0.001; Figura 4A); al
contrario GAT-3 non mostra una localizzazione preferenziale (il 51.5 ± 2.9% dei profili
si trova in prossimità di una sinapsi, il restante 48.5% è distante da essa; Figura 4B).
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Figura 3. Colorazione con immunoperossidasi rilevata al microscopio elettronico:
studio di pre-embedding. A, mostra il soma neuronale positivo per GAT-1; B e G,
astrociti corticali positivi rispettivamente per GAT-1 e GAT-3. C-F e H-K sono esempi
di profili GAT-1+ e GAT-3+ nel neuropilo (assoni, C e J; dendriti, D e I; processi
astrocitari, E, F e H, K). I grafici rappresentano l’analisi quantitativa dei profili GAT1+ e GAT-3+. Taratura: 1µm per A, B e G; 100 nm per C-F e H-K. Ax, assoni; Den,
dendriti; AsP, processi astrocitari; bv, vaso sanguigno. *P<0.05; ***P<0.001.
Figura 4. Analisi quantitativa della distribuzione dei profili GAT-1+ e GAT-3+ in
prossimità e non di una sinapsi corticale. Nei grafici A e B, extrasyn indica la quantità
dei profili GAT-1+ o GAT-3+ lontani dalle sinapsi e syn i profili GAT-1+ e GAT-3+
nelle vicinanze di una sinapsi (terminali assonici, dendriti postsinaptici o processi
astrocitari). C, mostra il confronto tra i profili sinaptici GAT-1+ e GAT-3+. **P<0.01;
***P<0.001.
L’attenzione è stata quindi rivolta alla quantificazione di GAT-1 e GAT-3 nei
differenti compartimenti sinaptici (terminali assonici, dendriti postsinaptici e processi
astrocitari perisinaptici).
Dallo studio di un campione di 121 sinapsi, GAT-1 risulta maggiormente
distribuito nei terminali assonici di sinapsi simmetriche (39.6 ± 3%; Figura 5A e G), nei
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processi astrocitari perisinaptici adiacenti sinapsi asimmetriche (29.7 ± 2.8%; Figura 5B
e G), nei processi astrocitari perisinaptici adiacenti sinapsi simmetriche (13.54 ± 2.0%;
Figura 5C e G), nei dendriti postsinaptici di sinapsi asimmetriche (10.25 ± 1.7%; Figura
5D e G), nei dendriti postsinaptici di sinapsi simmetriche (4.7 ± 1%; Figura 5E e G) e
nei terminali assonici di sinapsi asimmetriche (2.1 ± 0.78%; Figura 5F e G). L’analisi
con ANOVA ha dimostrato che la localizzazione di GAT-1 nei terminali assonici di
sinapsi simmetriche è significativamente predominante rispetto agli altri compartimenti
sinaptici (Figura 5G), inoltre esiste una frazione non trascurabile di GAT-1 distribuito
nei processi astrocitari di sinapsi asimmetriche e simmetriche (Figura 5G).
Per quanto riguarda GAT-3, i risultati di un campione di 113 sinapsi indicano
che è presente nei processi astrocitari adiacenti a sinapsi asimmetriche (32.5 ± 3.9%;
Figura 5H e N) e a sinapsi simmetriche (35 ± 3.9%; Figura 5I e N), nei dendriti
postsinaptici di sinapsi asimmetriche (16.5 ± 3.2%; Figura 5J e N), nei terminali
assonici di sinapsi simmetriche (10.1 ± 2.6%; Figura 5K e N), nei terminali assonici di
sinapsi asimmetriche (3.5 ± 1.6%; Figura 5L e N) e nei dendriti postsinaptici di sinapsi
simmetriche (2.2 ± 1.1%; Figura 5M e N). L’analisi con ANOVA ha evidenziato che la
localizzazione di GAT-3 nei processi astrocitari perisinaptici è significativamente
maggiore rispetto gli altri compartimenti sinaptici (Figura 5N), che non esistono
significative differenze nell’espressione gliale di GAT-3 tra sinapsi asimmetriche e
simmetriche e che è presente una quantità non trascurabile di GAT-3 nei dendriti
postsinaptici e nei terminali assonici di sinapsi simmetriche (Figura 5N).
In generale gli studi di pre-embedding hanno permesso di evidenziare una
complessa localizzazione di entrambi i trasportatori GAT-1 e GAT-3. Sebbene GAT-1
sia principalmente neuronale, è largamente espresso anche nei processi gliali, mentre
GAT-3 è prevalentemente gliale e solo una piccola frazione è presente anche nei
neuroni. L’espressione di GAT-1, e non di GAT-3, è polarizzata nelle sinapsi corticali.
17
A livello sinaptico, GAT-1 è prevalentemente espresso nei terminali assonici e in
diversi processi gliali di sinapsi simmetriche, seppure una frazione non trascurabile di
GAT-1
sia presente anche a livello di sinapsi asimmetriche (nei processi gliali
perisinaptici e dendriti postsinaptici). Al contrario, a livello sinaptico, GAT-3 è
maggiormente espresso nei processi perisinaptici ed è equamente distribuito tra sinapsi
simmetriche e asimmetriche.
18
Figura 5. Studio di pre-embedding di profili GAT-1+ e GAT-3+ in sinapsi simmetriche
ed asimmetriche. A-F e M-H illustrano esempi di terminali assonici, processi astrocitari
perisinaptici e dendriti postsinaptici positivi per GAT-1 e GAT-3 (le punte di freccia
indicano il contatto di sinapsi simmetriche; le frecce indicano i contatti sinaptici
asimmetrici). G e N, sono analisi quantitative dei profili sinaptici GAT-1 e GAT-3. AxT,
terminali assonici; AsP processi astrocitari; Den, dendriti. Taratura: 100 nm. *P<0.05;
**P<0.01; ***P<0.001.
19
Distribuzione di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi simmetriche:
studi di post-embedding
Gli studi di pre-embedding hanno evidenziato che nelle sinapsi simmetriche,
GAT-1 è preferenzialmente localizzato nei terminali assonici e in parte nei processi
astrocitari perisinaptici, mentre GAT-3 prevale nei processi gliali perisinaptici e
occasionalmente nei terminali assonici. La tecnica del post-embedding è stata utilizzata
per studiare la densità delle particelle codificanti per GAT-1 e GAT-3 e la loro
distribuzione nei terminali assonici e nei processi astrocitari perisinaptici di sinapsi
GABAergiche.
Nei terminali assonici e nei processi gliali perisinaptici, la densità delle
particelle di GAT-1 e GAT-3 è significativamente maggiore rispetto al background
(Tabella 1).
Tabella 1. Densità delle particelle d’oro di GAT-1 e GAT-3 nei terminali assonici
processi astrocitari perisinaptici di sinapsi simmetriche. Nella tabella compaiono i valori
medi ± SEM; n= numero dei profili. L’analisi statistica è stata effettuata mediante t-test
a due code. GAT-1: ° sia in terminali assonici sia in processi astrocitari di sinapsi
simmetriche, la densità delle particelle d’oro è significativamente più alta del
background (rispettivamente P<0.001 e P<0.01). Nei terminali assonici e nei processi
astrocitari, la densità delle particelle associate alla membrana (§) è significativamente
più alta rispetto ai livelli di background (P<0.001 per § di terminali assonici e per § di
processi astrocitari); al contrario, la densità delle particelle citoplasmatiche (°°) è
significativamente più alta nei terminali assonici (P<0.01), ma non nei processi
astrocitari. GAT-3: ° sia in terminali assonici sia in processi astrocitari, la densità delle
20
particelle d’oro è significativamente più alta del background (P<0.01). Nei terminali
assonici e nei processi astrocitari, la densità delle particelle associate alla membrana (§)
è significativamente più alta rispetto ai livelli del background (P<0.001 per § di
terminali assonici e per § di processi astrocitari); al contrario, la densità delle particelle
citoplasmatiche (°°) è significativamente più alta nei terminali assonici (P<0.01), ma
non nei processi astrocitari.
L’analisi della marcatura per GAT-1 nelle sinapsi simmetriche (n=276), mostra che le
particelle d’oro codificanti per GAT-1 sono distribuite nel 59.8 ± 2.9% dei casi solo nei
terminali assonici, nel 11.2 ± 1.9% sia nei terminali assonici sia nei processi astrocitari
perisinaptici ed infine nel 29 ± 2.7% solo nei processi astrocitari perisinaptici (Figura 6
A-D). Al contrario, le particelle codificanti per GAT-3 sono distribuite a livello delle
sinapsi simmetriche (n=108) nel 78.7 ± 3.9% dei casi solo nei processi astrocitari
perisinaptici, nel 3 ± 3.2% solo nei terminali assonici e nel 8.3 ± 2.6% sia nei terminali
assonici sia nei processi astrocitari perisinaptici (Figura 6E-F).
Successivamente è stato dimostrato che le particelle d’oro codificanti per GAT-1
e GAT-3 sono maggiormente espresse a livello della membrana plasmatica
confrontando il numero di particelle d’oro associate alla membrana e quelle non
associate, come descritto in Materiali e Metodi (Tabella 1). Quindi sono state
confrontate le densità stimate per GAT-1 e GAT-3, evidenziando che l’espressione di
GAT-1, assonale e gliale, è 1.9 volte più alta rispetto a quella di GAT-3 (Tabella 1).
Infine, sono state raccolte le misure delle distanze lungo la membrana plasmatica
tra le particelle d’oro codificanti per GAT-1 e GAT-3 e gli estremi della zona attiva
(ZA) di sinapsi simmetriche, sia nei terminali assonici sia nei processi astrocitari
perisinaptici (Figura 7A, B, D, F e H). Nei terminali assonici, le particelle d’oro
codificanti per GAT-1 (n=275) sono distribuite in un intervallo compreso tra -90 nm e
1480 nm (Figura 7C) e la maggior concentrazione è stata trovata tra 0 ed 1200 nm. Più
specificatamente la maggior quantità di particelle d’oro è stata trovata nell’area
perisinaptica (0-130 nm dalla ZA) con un picco a 30 nm, sebbene un’elevata densità di
21
particelle sia stata trovata anche nell’area extrasinaptica (510-600 nm) (Figura 7C). Nei
processi astrocitari (n=138), le particelle sono distribuite più o meno omogeneamente in
un intervallo compreso tra 90 e 1100 nm con un picco nella zona extrasinaptica a 960
nm (Figura 7E). Nei processi astrocitari, le particelle d’oro codificanti per GAT-3
(n=111) sono maggiormente concentrate tra 300 e 1380 nm con un picco extrasinaptico
a 780 nm (Figura 7G). Al contrario, nei terminali assonici, le particelle d’oro codificanti
per GAT-3 (n=21) sono rare e sparse, senza formare un vero e proprio agglomerato
lungo la membrana (Figura 7I).
Al fine di confrontare la distribuzione di GAT-1 nei terminali assonici con
quella di GAT-1 e GAT-3 nei processi astrocitari perisinaptici, le posizioni delle
particelle sono state normalizzate in modo che il punto 0 corrisponda al bordo della
zona attiva e 1.0 al punto lungo il perimetro equidistante da entrambi i bordi della ZA,
nel caso dei terminali assonici, o dal bordo ipsilaterale della ZA, nel caso di processi
astrocitari. I dati così normalizzati, indicano che GAT-1 è localizzato nei terminali
assonici ad una distanza media tangenziale di 0.41 ± 0.01 e 0.77 ± 0.01 nei processi
astrocitari; GAT-3 ad una distanza normalizzata di 0.73 ± 0.01. L’analisi ANOVA
applicata ai valori normalizzati rivela in modo interessante che la posizione di GAT-1
nel terminale assonico differisce dalla posizione astrocitaria sia di GAT-1 che di GAT-3
(P<0.001), mentre GAT-1 e GAT-3 mostrano una simile distribuzione negli elementi
gliali.
22
Figura 6. Studio di post-embedding di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi simmetriche. A-C
e E-G, mostrano le particelle d’oro codificanti per GAT-1 (A-C) e GAT-3 (E-G) nei
terminali assonici di contatti sinaptici simmetrici e nei processi astrocitari perisinaptici.
Le frecce indicano le particelle d’oro codificanti per GAT-1 e GAT-3 sia nel citoplasma
sia associate alla membrana. Le punte di freccia sono i contatti sinaptici simmetrici. D e
H, grafici che mostrano l’analisi quantitativa della distribuzione dei profili GAT-1+ e
GAT-3+ nelle sinapsi simmetriche. Taratura: 100 nm.
23
Figura 7. Studio di post-embedding: localizzazione di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi
simmetriche. A, B, D, F e H, mostrano la distribuzione delle particelle d’oro associate
alla membrana, codificanti per GAT-1 e GAT-3, nei terminali assonici (A,B e H) e nei
processi astrocitari (D e F) in relazione alla ZA ed alla densità postsinaptica. I grafici C,
E, G e I, mostrano la distanza delle particelle dalla ZA dei terminali formanti sinapsi
simmetriche, rilevate nei terminali assonici GAT-1+ (C) e GAT-3+ (I) e nei processi
astrocitari GAT-1+ (E) e GAT-3+ (G). L’asse y corrisponde alla densità delle particelle
misurate in un intervallo (bin) di 30 nm, ottenuta dividendo il numero delle particelle
contate per ciascun bin per il numero dei profili studiati. Le frecce indicano le particelle
d’oro associate alla membrana; le punte di freccia corrispondono alle estremità della
zona attiva di sinapsi simmetriche. AxT, terminali assonici; AsP, processi astrocitari
perisinaptici. Taratura: 100 nm.
24
Valutazione quantitativa dei livelli di GAT-1 e GAT-3 nei terminali VGAT:
studi di microscopia confocale-3D
Con lo scopo di confermare ed ampliare lo studio quantitativo dell’espressione
di GAT-1 e GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche, sono stati condotti degli studi di
microscopia confocale tridimensionale applicata a tecniche di co-localizzazione di
VGAT/GAT-1 e VGAT/GAT-3 nella corteccia (strati II-III e V). Come già noto
(Chaudhry et al., 1998; Minelli et al., 2003), la marcatura di VGAT, rappresentativa dei
terminali GABAergici, appare tipicamente sotto forma di puncta disperse nel neuropilo.
La tecnica colored isosurface (Feng et al., 2007) è stata utilizzata per quantificare le
concentrazioni di GAT-1 e GAT-3 nei terminali VGAT (per i dettagli vedere Materiali e
Metodi). Il segnale di GAT-1 nei terminali VGAT appare frequentemente più intenso
rispetto a quello di GAT-3 (Figura 8A-D). Il confronto dei dati ottenuti (n=147 per
GAT-1 e n=145 per GAT-3) mostra che l’espressione di GAT-1 nei terminali VGAT è
1.5 volte maggiore rispetto a GAT-3 (P<0.001; Figura 8E). Questi dati confermano che
nelle prossimità di una sinapsi GABAergica, la densità di GAT-1 è maggiore rispetto a
GAT-3.
25
Figura 8. Concentrazione di GAT-1 e GAT-3 nei terminali VGAT: studi di confocale
in 3D. A, B sono esempi di campi corticali nei quali i terminali VGAT sono stati
ricostruiti tridimensionalmente e colorati dalle concentrazioni di GAT-1 (A) e GAT-3
(B). C, D sono esempi rappresentativi di un terminale VGAT colorato con la relativa
quantità di GAT-1 (C) e GAT-3 (D). E, mostra il grafico dell’analisi quantitativa dei
livelli di GAT-1 e GAT-3 estratti dai terminali VGAT. ***P<0.001. Taratura: 5 µm per
A e B.
26
DISCUSSIONE
I risultati del presente studio possono essere così riassunti: a) GAT-1 mostra
un’espressione prevalentemente neuronale ma anche una non trascurabile espressione
astrocitaria; GAT-3 si manifesta prevalentemente negli astrociti, ma una lieve
espressione è presente anche nei neuroni; b) GAT-1 è preferenzialmente espresso nelle
sinapsi corticali, mentre GAT-3 è distribuito equamente tra i comparti sinaptici e non; c)
una frazione di GAT-1 e GAT-3 è nelle sinapsi glutammatergiche; d) la localizzazione
di GAT-1 nelle sinapsi GABAergiche, in relazione alla zona attiva, si estende nelle zone
perisinaptiche ed extrasinaptiche mentre la localizzazione di GAT-3 è esclusivamente
extrasinaptica; e) nelle sinapsi GABAergiche i livelli di GAT-1 sono significativamente
superiori a quelli di GAT-3.
Distribuzione sub-cellulare di GAT-1 e GAT-3:
confronto con studi precedenti e considerazioni metodologiche
Come già descritto in precedenza (Minelli et., 1995; Conti et al., 1998), anche in
questo studio è stata trovata una quota molto elevata di GAT-1 (~42%) negli astrociti.
Quindi l’identificazione di un elevato numero di astrociti esprimenti i trasportatori
GAT-1 e GAT-3, evidenzia come queste cellule possano apportare un contributo
maggiore nella regolazione dei livelli extracellulari di GABA.
La quantità di GAT-3 neuronale (~25%) indica che a livello basale i domini
dendritici e assonali hanno la possibilità di esprimere GAT-3. Questo risultato è in
conflitto con precedenti studi (Minelli et al., 1996) nei quali veniva dimostrata l’assenza
di espressione di GAT-3 da parte delle cellule neuronali. Tuttavia altri lavori hanno
evidenziato l’espressione neuronale di GAT-3 ad esempio durante lo sviluppo (Minelli
et al., 2003) ed in condizioni non fisiologiche (Melone et al., 2003; 2005a). Inoltre è
27
stata documentata la presenza di RNAm per GAT-3 in alcune cellule neuronali (Clark et
al., 1992; Durkin et al., 1995). La discrepanza nei risultati ottenuti in questo studio
rispetto al lavoro condotto nel 1996 (dove fu utilizzato lo stesso anticorpo) può essere
legata in primo luogo all’assenza, nel lavoro passato, di una quantificazione di GAT-3
tramite microscopia elettronica applicata alla tecnica di pre-embedding, mentre in
questo studio sono stati analizzati circa 2500 µm2 di corteccia; in secondo luogo, in
precedenza il tessuto era stato fissato con glutaraldeide, che come dimostrato per altri
antigeni (Chen et al., 2004), essendo un forte fissativo, può mascherare gli epitopi,
riducendo l’immunoreattività e quindi non rendendo visibili tutti i processi marcati.
Gli studi di pre-embedding hanno inoltre evidenziato che GAT-1 è più
frequentemente espresso nelle sinapsi (nell’ordine nei terminali, nei processi astrocitari
e nei dendriti) rispetto a GAT-3. Questo attribuisce un possibile maggior ruolo di GAT1 nella omeostasi della sinapsi GABAergica rispetto a GAT-3 (Conti et al., 2011), ma
non esclude che i due attori possano agire contemporaneamente.
Un risultato particolarmente originale è quello dell’espressione di GAT-1 e
GAT-3 nelle sinapsi glutammatergiche. In particolare, una frazione considerevole di
GAT-1 espresso nelle sinapsi si trova nella glia perisinaptica (~29%) e dendriti
postsinaptici (~10%) di sinapsi asimmetriche come anche una frazione non trascurabile
di GAT-3 nella glia (~32%) e dendriti postsinaptici (~16%). Questo dato depone per la
possibile attività dei trasportatori del GABA in siti sinaptici glutammatergici che, come
noto, sono dotati, specialmente a livello presinaptico, di eterorecettori metabotropici del
GABA (denominati GABAB; Cryan et al., 2005). Dunque, i trasportatori GAT-1 e
GAT3 in questa sede, potrebbero regolare, agendo sulla disponibilità di GABA, anche
la trasmissione glutammatergica.
28
Localizzazione ed espressione di GAT-1 e GAT-3 nelle
sinapsi GABAergiche: implicazioni funzionali
Nonostante il quadro di distribuzione subcelluare di GAT-1 e GAT-3 abbia
rivelato una localizzazione multiforme dei due trasportatori, GAT-1 presenta una forte
polarizzazione sinaptica GABAergica sotto forma di espressione nei terminali e nei
processi astrocitari perisinaptici, mentre GAT-3, nonostante sia equamente distribuito
tra siti sinaptici e non, è espresso alle sinapsi soprattutto nei processi astrocitari e in
alcuni terminali assonici.
Gli studi di post-embedding dimostrano che l’espressione di GAT-1 nelle sinapsi
GABAergiche è circa 60% dei casi nei terminali, 29% soli astrociti perisinaptici e 11%
in entrambi i comparti. Nel caso di GAT-3 è invece 78% negli astrociti perisinaptici,
13% nei terminali e 8% in entrambi. Questi dati indicano che il sistema di ricaptazione
del GABA nelle sinapsi GABAergiche può avvalersi sia dell’attività di GAT-1 presente
sui terminali presinaptici (per la maggior parte dei casi), sia della doppia attività di
GAT-1 nei terminali con frazioni astrocitarie sia di GAT-1 che di GAT-3 ed infine (per
percentuali molto basse) per la sola attività di GAT-1 e GAT-3 espressi nei processi
gliali.
In questo contesto, gli studi di quantificazione della concentrazione di GAT-1 e
GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche mediante l'analisi della densità di GAT-1 e GAT-3
con tecniche di post-embedding e di microscopia confocale tridimensionale, hanno
consentito di prevedere il contributo di GAT-1 e di GAT-3 nella ricaptazione di GABA
nelle sinapsi GABAergiche. Infatti, sia la concentrazione di GAT-1 e GAT-3 misurata
con la microscopia confocale sia la densità delle particelle codificanti per GAT-1 e
GAT-3 misurata con le tecniche di post-embedding, indicano che i livelli di espressione
di GAT-1 sono da ~1.5 a 1.9 volte superiori a quelli di GAT-3. Ciò indica che, per
quanto l'espressione di GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche non sia trascurabile, il suo
29
contributo nella regolazione della trasmissione GABAergica di tipo fasico (Farrant and
Nusser, 2005) è decisamente inferiore rispetto a GAT-1. A questo riguardo, numerosi
studi elettrofisiologici sull’attività di tipo tonico del GABA (Farrant and Nusser, 2005),
hanno evidenziato una maggiore influenza di GAT-3 in sedi extrasinaptiche (in sedi
dove le risposte mediate dai recettori del GABA sono dipendenti dai livelli
extracellulari di GABA e non dalla liberazione sinaptica del neurotrasmettitore; Kreos
and Hablitz, 2005; Kinney, 2005; Ortinski et al., 2006; Clarkon et al., 2010).
Inoltre, alle differenze quantitative di GAT-1 e GAT-3 presenti a livello
sinaptico, si affiancano ancora più distintamente quelle sulla posizione delle molecole di
GAT-1 e GAT-3 presenti sulla membrana plasmatica (dunque di quella frazione di
trasportatore disponibile per la ricaptazione di GABA) ottenute mediante tecniche di
post-embedding. La presenza di GAT-1 nei terminali assonici con picchi di
concentrazione ai margini della zona attiva di rilascio del GABA, cioè in posizione
perisinaptica (0-130 nm dai margini della zona attiva di rilascio delle sinapsi), spiega
l'insieme dei dati elettrofisiologici che dimostrano come cambiamenti dell’attività di
GAT-1 possano perturbare l'attività fasica della trasmissione GABAergica (Keros and
Hablitz, 2005; Bragina et al., 2008). Indubbiamente, la presenza di GAT-1 ai margini
della zona attiva permette al trasportatore di poter operare in una posizione di stretta
vicinanza alla zona di liberazione di GABA, di poter modulare quindi la quantità di
GABA nel vallo sinaptico e conseguentemente le risposte fasiche mediate dai recettori
GABAA (Farrant and Nusser., 2005; Keros and Hablitz, 2005; Bragina et al., 2008).
Inoltre, i risultati di post-embedding evidenziano che una parte di GAT-1 espresso nei
terminali, ma soprattutto GAT-1 e GAT-3 espressi nei processi astrocitari perisinaptici,
presentano picchi di concentrazioni in zone extrasinaptiche (rispettivamente a 510-600,
960 e 780 nm). Quindi la frazione di GAT-1 espresso negli stessi terminali e le frazioni
di GAT-1 e GAT-3 espresse nei processi astrocitari perisinaptici, potrebbero essere
30
implicate nell'attività tonica, probabilmente regolando il transito di GABA dai siti di
rilascio alle sedi extrasinaptiche nelle quali sono presenti recettori di tipo GABAA e
GABAB (Farrant and Nusser, 2005; Keros and Hablitz, 2005; Kinney, 2005, Ortinski et
al., 2006; Kasugai et al., 2010). La capacità di GAT-1 di regolare sia l'attività fasica sia
quella tonica, trova una particolare conferma negli studi elettrofisiologici condotti nei
topi GAT-1 knockout, nei quali per effetto dell'assenza del trasportatore, entrambe le
attività inibitorie risultano alterate (Bragina et al., 2008).
In conclusione, i risultati sull’espressione e sulla fine localizzazione di GAT-1 e
GAT-3 nelle sinapsi GABAergiche, consentono da un lato di chiarire il ruolo dei due
trasportatori nella regolazione dei fenomeni fasici e tonici del GABA e dall'altro di
suggerire la possibilità di un dualismo funzionale di GAT-1 (determinato dalla
regolazione dei livelli di GABA nei siti sinaptici ed extrasinaptici), mentre GAT-3
mostrerebbe una singola attività funzionale (regolazione dei livelli di GABA nei siti
extrasinaptici).
31
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