Manuale d`uso

l'amplificazione specifica del target Norovirus ed è misurata da
una sonda marcata con il fluoroforo VIC/HEX.
Norovirus real time RT-PCR Kit
Test di screening qualitativo per l’identificazione in piastre real
time PCR di Norovirus (genotipo I e II) compatibile con
strumenti Applied Biosystems, Roche LC480, Stratagene o
Qiagen/Corbett Research
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DESTINAZIONE D'USO
Il kit AnDiaTec® Norovirus real time RT-PCR (TaqMan) è un
test di screening qualitativo per l’identificazione in real time
PCR di Norovirus in feci usando un sistema a micropiastre
(Applied Biosystems, Roche LC480, Stratagene o Qiagen
/Corbett Research).
SOMMARIO
La Gastroenterite può essere causata da una varietà di virus
enterici. Anche nei paesi industrializzati le infezioni
gastrointestinali possono causare malattie potenzialmente
mortali. E’ stato recentemente dimostrato che il gruppo
genetico dei Norovirus (conosciuto formalmente come virus di
Norwalk) è la causa principale della gastroenterite non batterica
a livello mondiale. Il Centro di controllo delle malattie (CDC,
Atlanta, GA, USA) stima che i 23 miliardi di casi di
gastroenterite/anno possono essere attribuiti a alla famiglia dei
virus Caliciviridae umani (Mead et al. 1999). Il 66% di tutte le
malattie infettive alimentari e da acque infette sono associate ai
Norovirus. Al contrario, solo il 30,2% delle malattie infettive
sono di origine batterica (5,2 milioni), o il 2,6% derivanti da
parassiti (Mead et al.1999). I Norovirus umani sono piccoli,
sono virus privi di involucro con un genoma a singolo
filamento di RNA. I Noroviruss appartengono alla famiglia dei
virus Caliciviridae e sono divisi in genotipo I e II. Questi virus
sono resistenti alle alte temperature (60°C), a condizioni acide
(pH 3) e ai cloriti (10 mg/L). I virus vengono trasmessi
attraverso gli alimenti e l'acqua contaminata ma anche dal
contatto persona - persona e sono altamente contagiosi.
PRINCIPIO DEL TEST
Il kit AnDiaTec® Norovirus Kit RT-PCR (TaqMan) contiene
primer e sonde specifiche e materiale aggiuntivo per
l’identificazione di Norovirus I e II nelle feci. Il primo
passaggio per l’esecuzione del test e l’identificazione di
Norovirus è la trascrizione inversa (RT), l’RNA è trascritto in
cDNA. Successivamente, il cDNA attraverso una DNA
polimerasi termostabile è utilizzato come templato per
amplificare specifici frammenti di geni di Norovirus I e II.
L’identificazione specifica si ottiene mediante l’ibridazione
degli ampliconi prodotti con sonde specifiche per il genotipo I
e II. La fluorescenza emessa è misurata dal gruppo ottico della
PCR in tempo reale (strumenti compatibili: ABI PRISM SDS,
Roche LC480, Stratagene MxPro, Qiagen/Corbett Research
Rotor Gene software 3000/6000). Retrotrascrizione RT e PCR
vengono eseguite in un unico passaggio. La rilevazione della
fluorescenza è eseguita mediante monitoraggio degli ampliconi
sintetizzati marcati con il fluoroforo FAM. Per escludere una
possibile inibizione il kit contiene un controllo interno.
L'amplificazione di questo controllo interno non influenza
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REAGENTI FORNITI
Ciascun kit contiene i reagenti necessari per 96 reazioni.
Ref Tipo di Reagente
Contenitore
A1
A2
A3
A4
1 vial, 90μl
1 vial, 1.4ml
1 vial, 50μl
1 vial, 200μl
Enzima-Mix
Primer and Probe-Mix
Controllo positivo
Controllo negativo
Colore del
tappino
Blu
Giallo
Rosso
Verde
STOCCAGGIO E MOVIMENTAZIONE
Tutti i reagenti (da A1 a A4) devono essere conservati a -20°C.
Tutti i reagenti possono essere utilizzati fino alla data di
scadenza stampata sulle etichette. Evitare cicli multipli di gelo
e disgelo di reagenti (<2). Se il kit è usato sporadicamente,
preparare aliquote di reagenti. Durante la preparazione delle
reazioni mantenere i reagenti refrigerati. Evitare l'esposizione
alla luce di A2.
PROCEDURA DEL TEST
Materiale fornito

Reagenti di PCR

Istruzioni
Materiale richiesto ma non fornito
1. Sistema ABI o strumenti compatibili (Roche LC480,
Stratagene, Qiagen/Corbett Research).
2. Piastra di reazione TC II, 96 pozzetti (Applied
Biosystems) o compatibili o tubi di reazione ottici.
3. Adesivo ottico (Applied Biosystems) o compatible.
4. Kit per l’estrazione dell’RNA.
5. Micropipette (0.5μl - 1ml) con puntali con filtro
sterili.
6. Tubi sterili.
PRECAUZIONI

Questo test deve essere effettuato da personale
specializzato.

I campioni clinici devono essere considerati come
potenzialmente infetti.

Questo test deve essere eseguito secondo le GLP
(Good Laboratory Practice).
AMPLIFICAZIONE
La tecnologia PCR è altamente sensibile. L’amplificazione di
un singola molecola genera milioni di copie identiche. Per
evitare
contaminazioni
dei
campioni
con
RNA
precedentemente amplificato è molto importante dividere
fisicamente le zone di preparazione del campione da quelle di
amplificazione. Micropipette, tubi e altri materiali di lavoro
non dovrebbero circolare tra le due zone.
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza
• Impostare (se possibile) due aree di lavoro separate:
1. Isolamento del RNA
2.amplificazione/rilevazione
dei
prodotti
di
amplificazione
• Utilizzare sempre puntali sterili con filtro
• Indossare camici e guanti puliti in ogni area di lavoro
• Decontaminare le micropipette e le postazioni di lavoro con
appositi decontaminanti
• Evitare formazione di aerosol
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PROCEDIMENTO
La procedura completa è suddivisa in tre fasi:
1. Preparazione del campione ed estrazione dell’RNA.
2. Amplificazione e rilevazione combinata di frammenti
di RNA con trascrittasi inversa e sonde.
3. Interpretazione dei risultati utilizzando il software ABI
PRISM SDS (rispettivamente Roche: LC480, Stratagene:
MxPRO-, Qiagen/Corbett di ricerca: Rotor Gene
3000/6000).
1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ED ESTRAZIONE
DELL’RNA
1.1 Estrarre l’RNA genomico mediante l'uso di un kit
commerciale per l’isolamento dell'RNA da feci, secondo
le istruzioni del produttore.
1.2 Se la reazione di real time RT-PCR non viene eseguita
immediatamente conservare l’RNA estratto a -20°C.
2. PROTOCOLLO REAL TIME PCR PER NOROVIRUS
Leggere attentamente le istruzioni prima di eseguire il test.
Ciascun test deve includere un controllo positivo e uno
negativo. Usare sempre puntali con filtro.
3. ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
RT-PCR
L’amplificazione specifica per Norovirus è indentificata dalla
fluorescenza FAM, il controllo interno è identificato dalla
fluorescenza VIC/HEX.
Utilizzare i seguenti parametri per definire reporter e quencher
attraverso il software real time PCR.
Identificazione
Reporter
Quencher
Norovirus RNA
Controllo interno
Reference passive
FAM
VIC/HEX/JOE
nessuno
nessuno
nessuno
3.1 Se si rileva fluorescenza sul canale FAM
Il risultato è positivo.
Il campione contiene RNA di Norovirus
La fluorescenza VIC/HEX associata al controllo interno
non risulta fondamentale ad alte concentrazioni di RNA di
Norovirus, questa infatti si può ridurre o risultare inibita.
3.2 Se si rileva fluorescenza sul canale VIC/HEX, ma non
quella in FAM
2.1 Il volume della miscela di reazione deve essere un numero
multiplo rispetto al numero dei campioni da analizzare (n)
includendo i controlli A3 e A4. Per evitare problemi di
imprecisione nel prelievo con la miropipetta considerare
sempre un campione in più. Mantenere refrigerati i reagenti
durante le fasi di preparazione.
Il risultato è negativo.
Il campione non contiene RNA di Norovirus.
La fluorescenza VIC/HEX garantisce che non si è verificata
inibizione nel campione analizzato.
Volume di reazione
L’analisi diagnostica risulta nulla
È presente una inibizione della reazione di Real time PCR
Volume Master-Mix
0.8 μl Enzyme-Mix (A1)
14.2 μl Primer and Probe-Mix (A2)
0.8 µL x (n+1)
14.2 µL x (n+1)
3.3 Se non si rileva fluorescenza sul canale VIC/HEX e
neppure su quello FAM
Mescolare gentilmente, non vortexare, i seguenti reagenti in
tubo sterile: Enzyme-Mix (A1) and Primer and Probe-Mix
(A2). Questa miscela sarà la master mix. Spinare brevemente.
2.2 Prelevare 15 μl di master mix usando una micropipetta con
puntali con filtro e depositarli in ciascun pozzetto della
micropiastra. Aggiungere 5 μl di campione RNA o controllo
positivo o controllo negativo a ciascun pozzetto. Preparare il
controllo negativo per primo.
2.3 Sigillare la piastra con l’adesivo ottico.
Prodotti correlati
Norovirus real time RT-PCR Kit with Extraction Control ,
Cat. No. 942200:
Kit for the detection of Norovirus (genotype I and II) in real
time PCR microtiter plate systems (Applied Biosystems, Roche
LC 480, Stratagene or Qiagen/Corbett Research) including a
separate Extraction Control.
2.4 Avviare la RT-PCR con il seguente protocollo termico:
45°C for 15 min
95°C for 2 min
45 cicli di:
95°C for 20 sec
53°C for 60 sec (la misura della fluorescenza deve essere
fatta alla fine di questo passaggio)
72°C for 20 sec
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Quidel Germany GmbH
AnDiaTec division
Leibnizstr.11
D-70806 Kornwestheim
Tel.: ++49 (0)7154 806 23 0
Fax: ++49 (0)7154 806 23 24
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