Trombo-genomica Rosa Santacroce Genetica Medica Università di Foggia Malattie multifattoriali Sono il risultato di più fattori sia ambientali che genetici. L’importanza relativa dei fattori genetici è variabile. Esiste un’aggregazione familiare ma non segue il caratteristico pattern di segregazione delle malattie da singolo gene. Fattori di rischio acquisiti per trombosi Obesity Immobility Trauma or Surgery Contraceptives Who has an increased risk? Fattori di rischio per trombosi Obesity Immobility Trauma or Surgery Contraceptives Genetic Predisposition Fattori di rischio genetici per trombosi Factor V Leiden Factor II 20210A Gain of Function Coagulation Antithrombin Protein C Protein S Loss of Function ~35% of patients with thrombosis have one of these risk factors TEST PREDITTIVI Questi test identificano il rischio relativo : l'incremento o la riduzione del rischio di ammalarsi di una determinata malattia nel corso della vita rispetto al rischio medio di popolazione. Conferma o esclude, in un soggetto asintomatico, la propensione ad ammalarsi di una malattia comune e/o complessa. A role for additional common genetic variants (SNPs)? de HAAN et al. BLOOD 2012 A role for additional common genetic variants (SNPs)? ABO FII A20210 FV Leiden de HAAN et al. BLOOD 2012 La contemporanea esistenza all’interno di famiglie con trombosi di soggetti clinicamente non affetti ma genotipicamente portatori dei marcatori indagati rispecchia il lato multifattoriale della trombosi la coesistenza di difetti multipli ne modula la variabilita’ clinica. le alterazioni genetiche note giustificano soltanto il 60%delle condizioni trombofiliche di tipo ereditario altri polimorfismi o mutazioni rare non ancora individuati sono probabilmente responsabili dei casi ancora non chiari Other Inherited Risk Factors Hyperhomocysteinemia (?) Factor VIII ↑ (mixed) Dysfibrinogenemias Factor V mutations Factor II mutations Unique mutations Very rare ….dove eravamo… Pannello Trombofilia 4 mutazioni Valutazione genetica del rischio di patologie cardiovascolari mediante analisi di mutazione dei geni del Fattore V di Leiden, Fattore II (protrombina) e metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR), varianti C677T e 1298 A/C Pannello Trombofilia 13 mutazioni I geni in considerazione sono quelli relativi al fattore V di Leiden, al fattore II della coagulazione (protrombina) ed il gene MTHFR (Metilentetraidrofolatoreduttasi). Altri geni sono stati associati a stati trombotici, tra i quali: Fattore XIII, Beta Fibrinogeno, PAI-1, HPA, HFE, APO E, ACE, AGT. ….dove stiamo andando… NEXT GENERATION SEQUENCING La NGS è anche chiamata high-throughput sequencing (sequenziamento ad alta resa) perchè, a differenza del sequenziamento tradizionale col metodo Sanger, consente di sequenziare moltissimi frammenti in parallelo. Esistono diversi sistemi NGS, sviluppati da diverse compagnie. Tutti questi sistemi, tuttavia, condividono almeno tre passi fondamentali: la preparazione e immobilizzazione del DNA (cioè la preparazione della cosiddetta sequencing library), la reazione di amplificazione e la reazione di sequenziamento. NEXT GENERATION SEQUENCING Il principale vantaggio è la possibilità tecnica di produrre un volume enorme di dati a costi estremamente più bassi ed in tempi estremamente più rapidi Il potenziale dell’NGS è simile ai primi tempi della PCR con il limite principale dovuto all’immaginazione. “NEXT GENERATION SEQUENCING”…. AS054 Whole exome sequencing in patients with inherited thrombocytopenia and excessive bleeding is an efficient way to identify genetic variants in known and novel genes Johnson B AS132 Validation of a next generation DNA sequencing panel for haemostatic and platelet disorders Goodeve A AS196 Next-generation DNA sequencing approach to identify novel genetic risk factors underlying cerebral vein Thrombosis. Gorski MM Conclusion: We have successfully applied NGS-based analysis of 740 candidate hemostatic and proinflammatory genes in 469 Italian CVT patients and controls, identifying a common indel variant rs8176719 in the ABOgene that has been previously associated with deep vein thrombosis of the lower limbs and pulmonary embolism. OR176 Diagnosis of inherited bleeding, thrombotic and platelet diseases by next generation sequencing. Simeoni I Most monogenic inherited bleeding, thrombotic and platelet disorders (BTPD) except Haemophilia and von Willebrand’s diseases are extremely rare. Reaching a conclusive laboratory diagnosis remains challenging in the routine health care settings. Next generation sequencing (NGS) will change their laboratory diagnosis bringing benefits to patient care. PO543-MON Genetic variability of KNG1and F11genes using next generation sequencing Martin-Fernandez L1 Background: Venous thromboembolism (VTE) is a complex disease with a high heritability. However, only a portion of the genetic component is accounted for by genetic risk factors. From the GWAS of factor XI (FXI) performed in the GAIT-1 (Genetic Analysis of Idiopathic Thrombophilia) project significant associations were identified at KNG1andF11loci. Aims: We performed Next Generation Sequencing (NGS) of the KNG1and F11 genes to identify genetic variants that might be involved in the risk of thrombosis. Bleeding symptoms or bleeding disorder? That is the question Fasulo MR Conclusion: Our results show that the majority of patients with history of bleeding symptoms has not necessary a hemostatic defect. In patients with a severe bleeding diathesis further evaluation using next generation sequencing might help to understand the role of novel genes encoding for unknown proteins involved in haemostasis. OR394 Identification of new genetic risk factors for venous thrombosis by targeted sequencing: results of the MILES study de Haan HG Conclusion:Using a targeted sequencing strategy we were able to identify new genetic risk factors for venous thrombosis. Replication and functional studies are needed to confirm our findings and to unravel the biological mechanisms involved OR266 Meta-analysis of 65,734 individuals identifies TSPAN15andSLC44A2as two new susceptibility loci for venous thromboembolism Morange P-E Conclusion: We identified 2 loci (TSPAN15andSLC44A2) that had novel associations with VTE yet do not belong to canonical pathways leading to thrombosis and have not been associated with other cardiovascular endpoints. These findings may provide etiologic and mechanistic insights into VTE pathophysiology. PO653-MON The use of next-generation sequencing to screen for disorders of coagulation using a 24 gene panel Bignell P Aims: We sought to investigate the clinical utility of NGS for understanding haemostatic disease by sequencing 24 coagulation genes using a designed TruSeq Custom Amplicon (TSCA) panel. Methods:Samples were run on the Illumina MiSeq platform Sanger Sequencing Determining the nucleotide sequence (A, T, C and G) of a DNA of a gene Next generation sequencing (NGS) Next generation sequencing (NGS) is often referred to as massively parallel sequencing of clonally amplified or single DNA molecules that are spatially separated in a flow cell. NGS generates hundreds of megabases to gigabases of nucleotidesequence output in a single instrument run, depending on the platform. Next generation sequencing (NGS) ADVANTAGES OF NGS Revolutionary improvements in cost and speed of data generation Provides exquisite resolution for many types of experiments Next generation sequencing (NGS) DIS-ADVANTAGES OF NGS Shorter read lenght sequenced are produced Bioinformatics-based analysis File size traumatize IT infrastructures Next generation sequencing (NGS) Sanger vs Next Generation Sequencing Sequencing workflow NGS Data Analysis flowchart Immagini .TIFF Visualizzazione Intensità Filtraggio delle varianti Reads FASTQ Quality control: FastQC, FastXtoolkit Allineamento SAM BAM BED Bowtie BWA Maq Identificazione delle varianti .vcf GATK SAMtool Varscan Reads and coverage Quella dei test genetici è forse l’area in più rapida espansione e ricca di problematiche con un impatto pratico immediato sulla vita reale delle persone. L’informazione derivante dal test genetico è permanente in quanto non si modifica nell’arco di vita dell’individuo. Il test genetico fornisce informazioni non solo sull’individuo testato ma anche sui suoi familiari. Venous thrombosis is a multifactorial disease VTE Threshold Number of risk factors for VT GRAZIE PER L’ATTENZIONE!