Modello matematico del pathway
biosintetico degli amminoacidi a
catena ramificata in E.coli K12
di Yang, Shapiro, Hung, Mjolsness, Hatfield
J Biol Chem. 2005 Mar 25;280(12):11224-32. Epub 2005 Jan 18
Pathway di sintesi degli amminoacidi a catena
laterale ramificata
Valina
Isoleucina
Leucina
Pathway di sintesi degli amminoacidi a catena
laterale ramificata
Treonina
TDA
-chetobutirrato
(KB)
TDA= treonina
deaminasi
Pyr
CO2
Pyr-TPP
Pyr AHAS=acetoidrossi
acido sintasi
AHAS
-acetoidrossibutirrato
(AHB)
-acetolattato
(AL)
IPMS=isopropil
malato sintasi
-chetoisovalerato
(KIV)
Isoleucina
Valina
IPMS
Leucina
Step necessari per la modellizzazione e la
simulazione
•
Identificazione delle specie chimiche e dei meccanismi degli
enzimi coinvolti
•
Approssimazione dei parametri non disponibili in letteratura
•
Creare un modello di calcolo per i meccanismi catalitici e di
controllo di ciascuna reazione enzimatica
•
Unire modelli pre-esistenti ai modelli appena creati
•
Generazione di equazioni differenziali relative all’attività
enzimatica
•
Ottimizzazione dei parametri per la simulazioni di concentrazioni
•
Confronto modello-realtà
Identificazione delle specie chimiche e dei
meccanismi degli enzimi coinvolti
• TDA (treonina deaminasi): è il primo enzima del pathway per la
sintesi dell’Ile, da cui è inibito. Produce α-chetobutirrato.
STATO
INATTIVO
[Val]
STATO
ATTIVO
T
[Thr] [Ile]
R
MODELLO MWC
Identificazione delle specie chimiche e dei
meccanismi degli enzimi coinvolti
• AHAS (α-acetoidrossiacido sintasi): coinvolto nella sintesi di Val
e Ile
AHAS
AHAS I:
• Condensa due pyr
•Inibito da Val
•Sintesi Val
AHAS II:
AHAS III:
• Condensa pyr + αKB
•Inibito da Ile
•Sintesi Ile
•Non presente in E.coli
• Minor specificità
•Inibito da Val (inib
non completa, 75%)
•Sintesi Val e Ile
Identificazione delle specie chimiche e dei
meccanismi degli enzimi coinvolti
• AHAS (α-acetoidrossiacido sintasi): coinvolto nella sintesi di Val
e Ile
MECCANISMO BI-BI PING-PONG
Pyr
E
CO2 α-KB
E-Pyr F-acetato
F-acetato-α-KB
aceto
lattato
E-acetatolattato
E
Identificazione delle specie chimiche e dei
meccanismi degli enzimi coinvolti
• TB (transaminasi B): enzima coinvolto nell’ultimo step di questi
pathway (in entrambe le direzioni)
MECCANISMO BI-BI PING-PONG
Glutammato
E
α-cheto
glutarato precurs
E-Glu F-NH2
F- NH2-precurs
Val
(ile-leu)
E-Val (Ile-Leu)
E
Approssimazione dei parametri non disponibili
in letteratura
Molte delle costanti relative agli enzimi (Km, Kcat, Kf, Kr)
necessarie alla modellazione, sono state identificate per via
sperimentale.
Modellizzazione
Il primo passo per la modellizzazione è l’identificazione delle
reazioni coinvolte, evitando ridondanze (es.AHAS).
+
=
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Operatore “unione”
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Prima reazione enzimatica
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Seconda reazione enzimatica
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Enzima e enzima “attivato”
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Substrati
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Prodotti
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Meccanismo (modello)
Modellizzazione
Le reazioni vanno poi introdotte con la corretta sintassi all’interno
del software kMech, usando modelli di meccanismo preesistenti..
Costanti
Modellizzazione
kMech analizza l’input e lo converte in reazioni elementari nel
linguaggio adatto per Cellerator.
L’output è sottoposto a Cellerator che genera equazioni
differenziali relative alle reazioni, che saranno risolte dal software
Mathematica.
Modellizzazione
Modellizzazione
Altri brevi esempi di modellizzazione di reazioni enzimatiche:
• La reazione catalizzata dalla transaminasi B è reversibile. Nel
modello è quindi necessario introdurre sia la reazione diretta che
quella inversa.
• La treonina deaminasi è un enzima che segue il modello MWC.
E’ perciò necessario impostare equazioni che leghino la frazione
di enzima attivo con diversi parametri
Un po’ di numeri
Il modello comprende:
• 3 metabolismi differenti
• 11 enzimi e 3 cofattori
• 18 intermedi metabolici
• 105 equazioni differenziali
• 110 rate constant di associazione e dissociazione
• 105 rate constant catalitici
• 3 differenti meccanismi enzimatici (semplice, Bi-Bi, Bi-Bi pingpong)
Risultati – pathway simulato
Risultati – pathway simulato
Risultati – pathway simulato
Risultati – pathway simulato
Risultati – pathway simulato
Risultati – pathway simulato
Risultati – Regolazione allosterica TDA
Risultati – Regolazione allosterica TDA
Effetto inibitore della Ile
Ki = 15 µM
Risultati – Regolazione allosterica TDA
Effetto inibitore della Ile
Effetto attivatore della Val
Ki = 15 µM
Ka = 550 µM
Risultati – Inibizione della crescita da Val
Dati sperimentali mostrano che E.coli K12 non cresce in presenza
di concentrazioni alte (>1 mM in terreno minimo) di Val, ma
questo effetto è annullato se al terreno si aggiunge Ile.
Ipotesi: La presenza massiccia di Val inibisce la sintesi di Ile,
impedendo la crescita
Tuttavia l’AHAS III seppur inibito è sempre attivo al 15-20% e
TDA è attivato dalla Valina. Infatti…
Pathway di sintesi degli amminoacidi a catena
laterale ramificata
Treonina
TDA
-chetobutirrato
(KB)
TDA= treonina
deaminasi
Pyr
CO2
Pyr-TPP
Pyr AHAS=acetoidrossi
acido sintasi
AHAS
-acetoidrossibutirrato
(AHB)
-acetolattato
(AL)
IPMS=isopropil
malato sintasi
-chetoisovalerato
(KIV)
Isoleucina
Valina
IPMS
Leucina
Risultati – Inibizione della crescita da Val
Quindi da cosa dipende il blocco della crescita?
La presenza di Valina stimola TDA che sintentizza KB. La
funzionalità ridotta di AHAS fa sì che si accumuli Kb che è un
composto tossico Æ blocco della crescita
Risultati – Simulazione di overproduzione di Ile
Per overprodurre Ile occorre de-regolare TDA. Per eliminare il
feedback negativo è possibile modificare il parametro Ki dell’Ile su
TDA.
Questo comporta un forte aumento della frazione di TDA attiva
(forma R); tuttavia l’aumento di Ile è minore del previsto (solo 6
volte). Come mai?
Risultati – Simulazione di overproduzione di Ile
Osservando la produzione di αKB…
… si nota che è presente in alte concentrazioni Æ overprodotto ma
non consumato Æ AHAS saturo
Risultati – Simulazione di overproduzione di Ile
Osservando la produzione di αKB…
… si nota che è presente in alte concentrazioni Æ overprodotto ma
non consumato Æ AHAS saturo
… e se riattivo
AHAS II e
overproduco gli
enzimi del
pathway?
Risultati – Simulazione di overproduzione di Ile
Osservando la produzione di αKB…
… si nota che è presente in alte concentrazioni Æ overprodotto ma
non consumato Æ AHAS saturo
… e se riattivo
AHAS II e
overproduco gli
enzimi del
pathway?
Risultati – Simulazione di overproduzione di Ile
Osservando la produzione di αKB…
… si nota che è presente in alte concentrazioni Æ overprodotto ma
non consumato Æ AHAS saturo
… e se riattivo
AHAS II e
overproduco gli
enzimi del
pathway?
… la produzione
cresce in modo
enorme!!
Risultati – Analisi del mutante ilvC
Il gene ilvC codifica per l’acetoidrossiacido isomeroreduttasi,
l’enzima che agisce dopo AHAS. Mutanti ilvC non possono
produrre Ile, Leu e Val, ma riescono a crescere in presenza di solo
2 di questi 3 aa (Ile e Val). Questo grazie alla reazione inversa di
TB (transaminasi B), che converte Val in Chetoisovalerato, il quale
entra nel pathway di sintesi della Leu. Ciò è confermato dal
modello.
Conclusioni
Conclusioni
•
Il modello matematico mostra degli output molto simili a ciò che
accade nella realtà biologica
Conclusioni
•
Il modello matematico mostra degli output molto simili a ciò che
accade nella realtà biologica
•
Ha inoltre permesso di capire la causa della mancata crescita di
E.coli K12 in presenza di un eccesso di Valina
Conclusioni
•
Il modello matematico mostra degli output molto simili a ciò che
accade nella realtà biologica
•
Ha inoltre permesso di capire la causa della mancata crescita di
E.coli K12 in presenza di un eccesso di Valina
•
Il modello è comunque ancora incompleto, in quanto manca tutto
il contesto cellulare e le altre regolazioni a cui questo
metabolismo è soggetto (regolazioni trascrizionali etc)
