CV 0459 - Sekisui Diagnostics

Duplica RealTime CHLAMYDIA
PNEUMONIAE DETECTION KIT
hEBR006032- 32 test
CV
0459
INTENDED USE
DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae Detection kit is a qualitative assay for DNA detection of Chlamydia pneumoniae in respiratory
samples.
PRINCIPLE OF THE TEST
DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae Detection kit is designed to identify the sequence of Chlamydia pneumoniae MOMP (Major
Outer Membrane Protein) gene. The reagents for the amplification are ready to use and provided with 3 reactions mix:
 AMPLIFICATION MIX with Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotides, MgCl2 e buffer.
 OLIGO MIX with primers and fluorogenic probes.
 INTERNAL CONTROL OF AMPLIFICATION it allows to value the success of the reaction of amplification, it is identified by a hydrolysis
probe.
In the PCR procedure trace amounts of DNA can be quickly and repeatedly copied to produce a quantity sufficient to investigate using
conventional laboratory methods. There are three basic steps involved in the PCR process: denaturation, annealing, extension. Denaturation
to promote single-strandedness of the template DNA is achieved by heating to approximately 94°C. The temperature is then lowered
significantly to promote base-pairing (annealing) of the primer to the template.
The kit DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae Detection kit allows to find out bacterical DNA by using specific fluorogenic sequence
probes. With the kit is used a probe dyed with a different fluoride for each investigated sequence; in particular one probe detects the allele
target that bound covalently as a fluorophore at the 5’-end the FAM molecule (6-carboxyfluorescein) while the other probe detects the
internal control (IC) bound as a fluorophore at 5’-end the HEX molecule (hexa-chloro-fluoresceine). The two probes have at their 3’-ends a
quencher called BHQ-1.
REAGENTS PROVIDED
Each kit contains enough reagents to perform 32 tests and includes an internal control that must be co-amplified with any sample that
identifies any inhibitions in the amplification reaction. The kit allows to set up 4 assays, each of them include: 6 samples, 1 control and 1
reaction blank.
For Real Time PCR
Reagents
Amplification mix (400 ml)
Oligo Mix* (400 ml)
Colour Code
Blue Cap
Green Cap
Control 1 (Positive C. of amplification) (>50 ml)
Red Cap
Control 2 (Internal C. of amplification) (>50 ml)
Yellow Cap
Reaction blank (B) (50 ml)
White Cap
*store the tube away from light
STORAGE AND HANDLING
All reagents have to be stored at -22/-18°C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. EuroClone Diagnostica
recommends freezing and thawing the products at most six times.
Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to
resuspend them by pipetting 3 times.
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
• Micropipette 1-10 ml
• Micropipette 10-100 ml
• Sterile filter tips
• Rack for 0.2 ml tubes
• Optical tubes or microplate for Real Time PCR
• Thermal cycler for Real Time PCR
PRECAUTIONS AND WARNINGS
• Do not use the reagents after the date of expiration.
• Mix the reagents of the kit before use.
• Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation.
• Change gloves frequently.
• Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another.
• Periodically wash the working area with hypochlorite 5%
• Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may cause an interference with
fluorescence detection.
OPERATING PROCEDURE
a) DNA extraction
Any commercial bacterial DNA extraction kit could be used.
b) Thermal Cycler set up
Refer to the specific handbook of the equipment used but be sure to set the following thermal profile.
We recommend to switch on the instrument, setting the thermal profile and having the plate ready, before preparing the reaction mix.
Thermal Profile:
Time
Temperature
Cycles
5 min
95°C
1
15 sec
95°C
45
62°C
Fluorescent
Acquisition
60 sec
c) Preparation of PCR mix
For each experiment prepare a PCR mix for the 1 control (Control 1), 1 reaction blank, n+1 samples. The reagents of PCR mix have to
mixed under this ratio:
REAGENT
VOLUME (ml)
Amplification mix
10
Oligo mix
10
Control 2 (Internal C.)
1
Once the mix is ready, aliquot 21ul of Master Mix in the tubes or in the microplates for PCR and add in each tube 4ul of extracted DNA
and of controls; set the tubes inside the instrument and start the program of amplification you had set before.
Remember that at the end of the program remove the tubes from the thermal cycler.
d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS
The fluorescence signal registered by the instrument detects the presence of the DNA, in particular the fluorescence detected in the FAM
channel reveals the target DNA, while the fluorescence detected in the HEX channel reveals the amplification of the internal control
(Control 2). Results are interpreted by analyzing the threshold Cycle (Ct) value for each sample.
The Ct is defined as the cycle at which the amplification curve crosses the threshold line. The threshold line is calculated by the mean of
fluorescence background multiply by three times standard deviation during the initial cycles of PCR, prior to significant accumulation of
the target amplicon. During these early PCR cycles, the background signal is used to determine the “baseline fluorescence”.
When a signal at fluorophore FAM (Ct > 0) is detected, the sample is surely positive and the signal detected by HEX fluorophore (Ct³
0) is not relevant. When no signal at fluorophore FAM (Ct = 0) is detected, to confirm the negativeness of the result, the completed
amplification of internal control, and therefore the appearance of a fluorescent signal at HEX (Ct > 0) fluorophore level, must be verified.
Only in this case we can state that the sample is definitely negative. The absence of amplification signal at level of the two FAM-HEX
(Ct=0) fluorophores indicates the presence of inhibition of the PCR. The sample must be repeated and a dilution 1:10 of the target DNA
is suggested.
FAM
HEX
RESULT
Ct > 0
Not relevant (Ct ≥ 0)
POSITIVE
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIVE
Ct = 0
Ct = 0
INHIBITION
Warning:
The run is valid only if:
• The Blank is positive in the HEX channel, but negative in the FAM channel.
• The Positive Control is positive in both the FAM and for the HEX channel.
If these two conditions have been met, the run is valid and it’s possible to analyse the data. Otherwise the run is not valid.
It is responsibility of the user to validate the run checking that these conditions have been met.
TROUBLESHOOTING
Problem 1: No signal
1. Wrong channel/filter was chosen.
2. Pipetting error due to omitted reagents or samples.
3. Inhibitory effect of the sample: genomic DNA with a insufficient purification and/or insufficient extraction.
4. Check the kit was stored correctly.
5. Assess the performance of the thermal cycler.
Problem 2: Fluorescence intensity too low
1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to unsuitable storage conditions.
2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA.
Problem 3: Fluorescence intensity varies
1. The prepared PCR master mix is not well mixed.
2. Air bubbles trapped in the PCR tubes.
“THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER
CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO
DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND
OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY”
Rev0 - 01-2013
Duplica RealTime CHLAMYDIA
PNEUMONIAE DETECTION KIT
hEBR006032- 32 test
CV 0459
FINALITA’ D’USO
DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae kit è un test qualitativo, impiegato per la ricerca del DNA batterico di Chlamydia pneumoniae
in campioni clinici.
PRINCIPIO DEL TEST
DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae kit é un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Chlamydia pneumoniae. E’
stato sviluppato per amplificare la sequenza del gene MOMP (Major Outer Membrane Protein). I reagenti per la reazione di amplificazione
sono pronti all’uso e suddivisi in tre mix di reazione:
 AMPLIFICATION MIX: contenente Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotidi, MgCl2 e
buffer.
 OLIGO MIX contenente i primers e le sonde fluorogeniche.
 CONTROLLO INTERNO DI AMPLIFICAZIONE: permette di valutare il successo della reazione di amplificazione, ed è identificato da
una specifica sonda a idrolisi.
La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie
di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers)
ed estensione. Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore,
rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di miliardi di frammenti del DNA
in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature segue l’appaiamento di specifici primers al DNA target: l’enzima
Taq polymerase riconosce le estremità 3’ di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dNTPs) polimerizza il DNA, creando in
questo modo numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR real-time la rivelazione dell’ amplificato avviene utilizzando un marcatore
fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato “reporter”.
Il kit DUPLICaRealTime Chlamydia pneumoniae kit permette di rilevare il DNA batterico mediante l’impiego di sonde fluorogeniche
sequenza specifiche. Le sonde fluorogeniche sono costituite da una sequenza oligonucleotica che presenta all’estremità 5’ un marcatore
fluorescente chiamato «reporter », mentre all’estremità 3’ legano un secondo marcatore chiamato « quencher ». Il saggio è in grado di
rilevare il prodotto specifico di amplificazione andando a monitorare l’incremento del segnale di fluorescenza che risulta essere direttamente
proporzionale alla quantità di prodotto amplificato; l’elevata specificità del sistema consente alla sonda di discriminare tra frammenti che
differiscono di un solo nucleotide.
Nel kit viene usata una sonda marcata con un differente fluoroforo per ogni sequenza investigata; in particolare una sonda che va a
rilevare l’allele target e ha legato in modo covalente come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola FAM (6-carbossi-fluoresceina) mentre
l’altra sonda che va a rilevare il controllo interno (IC) ha legato come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola HEX (Esa-cloro-fluoresceina).
Le due sonde hanno all’estremità 3’ un quencher chiamato BHQ-1. Se eccitata, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la
vicinanza del quencher al reporter, impedisce a quest’ ultimo l’emissione della fluorescenza (effetto di quenching).
COMPOSIZIONE DEL KIT
Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni, è incluso un controllo interno di amplificazione che deve essere coamplificato
insieme ad ogni campione e che permette di identificare inibizioni nelle reazioni di amplificazione. Il kit permette di effettuare 4 corse,
ciascuna delle quali include: 6 campioni, 1 controllo e 1 bianco di reazione.
Real Time PCR
Reagenti
Codice colore
Amplification mix (400 ml)
Tappo Blu
Oligo Mix* (400 ml)
Tappo Verde
Control 1 (Positive C. of amplification) (>50 ml)
Tappo Rosso
Control 2 (Internal C. of amplification) (>50 ml)
Tappo Giallo
Reaction blank (B) (50 ml)
*proteggere la provetta dalla luce
Tappo Bianco
Conservazione e Stabilità
Tutti i reagenti devono essere conservati a -22/-18°C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone Diagnostica
raccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte.
Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell’utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti
e risospenderli pipettandoli 3 volte.
MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
• Micropipette 1-10 ul
• Micropipette 10-100 ul
• Puntali con filtro
• Rack per tubi da 0.2 ml
• Micropiastra ottica per real time PCR
• Tubi per PCR da 0. 2 ml con tappi ottici
• Termociclatore per Real Time PCR
PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO
• La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all’altra.
• Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza.
• Miscelare i reagenti del kit prima dell’utilizzo.
• Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della strumentazione.
• Cambiare spesso i guanti.
• Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 5%.
• Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella
rivelazione della fluorescenza.
PROTOCOLLO OPERATIVO
a) Estrazione DNA
Qualsiasi kit commerciale.
b) Programmazione del termociclatore
Riferirsi allo specifico manuale dello strumento ma assicurarsi di impostare il seguente profilo termico:
Profilo Termico:
Tempo
Temperatura
Cicli
5 min
95°C
1
15 sec
95°C
45
60 sec
62°C
Acquisire Fluorescenza
Si suggerisce, prima di allestire la miscela di reazione, di accendere e programmare il termociclatore per Real Time PCR.
c) Preparazione della PCR mix
Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 1 controllo (Controllo 1), 1 bianco di reazione, n campioni più uno. La mix deve essere
preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati:
REAGENTI
VOLUME (ml)
Amplification mix
10
Oligo mix
10
Controllo 2 (C. Interno)
1
Terminata la preparazione della mix, aliquotare 21ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per PCR e aggiungere in ogni tubo
4ul di DNA estratto e dei controlli; disporre i tubi all’interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente
impostato.
Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore.
d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI
Il segnale di fluorescenza registrato dalla strumentazione identifica la presenza del DNA, in particolare la fluorescenza rilevata dal CANALE
FAM identifica il DNA target, mentre la fluorescenza rilevata dal CANALE HEX identifica l’amplificazione del Controllo Interno
(Controllo 2). I risultati sono interpretati attraverso l’analisi del ciclo soglia Ct (Threshold Cycle Ct) per ciascun campione.
Il ciclo soglia è definito come il ciclo, a livello del quale, la curva di amplificazione interseca la linea soglia (Threshold line). La linea soglia
viene calcolata dalla media della fluorescenza di background per tre volte la deviazione standard; durante i cicli iniziali di amplificazione,
prima di un significativo accumulo di DNA target. Durante i primi cicli di amplificazione della PCR viene calcolata la fluorescenza di
background utilizzata per il calcolo della fluorescenza basale.
Quando si registra un segnale a livello di fluoroforo FAM (Ct > 0), il campione è sicuramente positivo, ed il segnale rilevato dal fluoroforo
HEX (Ct³ 0) non è rilevante. Quando non si registra segnale a livello di Fluoroforo FAM (Ct = 0), per confermare la negatività del risultato,
si deve verificare l’avvenuta amplificazione del controllo interno e quindi la comparsa di un segnale di fluorescenza a livello di Fluoroforo
HEX (Ct>0). Solo in questo caso si può affermare che il campione è sicuramente negativo. L’assenza di segnale di amplificazione a livello
dei due fluorofori FAM-HEX (Ct=0) indica la presenza di inibizione della PCR. Il campione deve essere ripetuto, si suggerisce di effettuare
una diluizione 1:10 del DNA target.
FAM
HEX
RISULTATO
Ct > 0
Non Rilevante (Ct ≥ 0)
POSITIVO
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIVO
Ct = 0
Ct = 0
INIBITO
Attenzione:
La corsa é valida solo se:
• Il Bianco é positivo nel canale HEX e negativo nel canale FAM.
• Il Controllo Positivo é positivo sia nel canale FAM che nel canale HEX.
Se si verificano queste due condizioni la corsa risulta valida ed é possibile analizzare I dati, altrimenti la corsa non é valida.
É responsabilità dell’operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si siano verificate.
TROUBLESHOOTING
Problema 1: Mancanza completa di segnale
1. E’ stato scelto il canale/filtro sbagliato.
2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione.
3. Effetti inibitori del campione: DNA genomico con purificazione insufficiente e/o estrazione insufficiente.
4. Controllare la corretta conservazione del kit.
5. Controllare le prestazioni del termociclatore.
Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa
1. Deterioramento del fluoroforo e/o dei primer dovuto ad una cattiva condizione di conservazione del Kit.
2. Quantità di DNA troppo inferiore e/o di bassa purezza.
Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile
1. La PCR Master Mix non è stata miscelata in modo corretto.
2. Ci sono bolle d’aria intrappolate nei tubi di PCR.
“L’acquisto di questo prodotto assicura all’acquirente i diritti coperti da alcuni
brevetti Roche allo scopo unico di offrire servizi di diagnostica umana in vitro.
L’acquisto di questo prodotto non concede nessun altro brevetto generale, diritto
o licenza di alcun tipo, al di fuori dello specifico diritto di utilizzo.“
Rev 0 EBR006032 – 01 -2013
PI_EBR006032/E0/0113/1_ENITA