poster n°:
CL97R53reT
Massimo Natale1, Dario Bonino1, Paolo Consoli1, Mauro Fasano2, Enrico M. Bucci1
1)
2)
BiodigitalValley Srl, Via Carlo Viola 78, 11026 Pont Saint Martin (AO)
Università dell’Insubria, Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, Via Alberto da Giussano 12, 21052 Busto Arsizio (VA)
La proteina DJ-1, nota anche come PARK7, è una proteina ubiquitaria descritta originariamente come oncogene (Nagakubo 1997). Tuttavia, a partire dall’individuazione di mutazioni di DJ-1 associate ad alcune forme familiari
recessive di Parkinson (Bonifati 2003) e alla successiva individuazione di altre mutazioni associate a forme sporadiche, si è accumulata una notevole quantità di dati a supporto del ruolo fisiopatologico che DJ-1 esercita in
tale malattia. In particolare, è emerso l’importante ruolo di DJ-1 nella protezione dallo stress ossidativo (Mitsumoto 2001), che si esplica attraverso la modifica ossidativa della stessa proteina, al fine da rimuovere radicali e
altre specie ossidanti potenzialmente tossiche.
A livello biochimico, questo meccanismo comporta la generazione di una notevole quantità di diverse forme modificate della proteina. Le modifiche che può subire DJ-1 includono l’ossidazione in diversi siti, legato al suo
ruolo di antiossidante (Mitsumoto et al., 2001, Kinumi et al., 2004, Choi et al., 2006),e altre modifiche come l’ubiquitinazione (Olzmann et al., 2004, Olzmann et al., 2007) e la SUMOilazione (Shinbo et al., 2006).
Per la caratterizzazione delle forme modificate della proteina viene generalmente utilizzata l’elettroforesi bidimenionale (2-DE), tecnica capace di separare le proteina in base alle caratteristiche di peso molecolare (MW) e di
punto isoelettrico (pI). La 2-DE è in capace separare le diverse forme modificate post-traduzionalente della proteina e di fornire preziose informazioni su quali forme vengono generate in determinati stati fisiopatologici.
In questo lavoro è stata sviluppata una robusta procedura di meta analisi di tutti gli esperimenti di 2-DE finora pubblicati in letteratura. Ciò ha permesso di descrivere esaustivamente la presenza di forme modificate di DJ-1
in variegate condizioni sperimentali e valutare quali profili di espressione sono associati alle differenti condizioni fisiopatologiche.
I dati ottenuti dalla meta-analisi mostrano che le forme modificate della proteine possono essere segregati in cluster associati a specifiche condizioni. In particolare quando la proteina DJ-1 proviene da tessuti neuronali le
diverse forme si distribuiscono in uno specifico e caratteristico pattern di MW e pI. Inoltre cambiamenti in questo pattern correlano in condizioni neurodegenerative o di invecchiamento. Questo risultato è stato
sperimentalmente validato analizzando successivamente la distribuzione di DJ-1 in cervelli umani di soggetti di controllo e affetti da Parkinson.
La meta analisi delle immagini di gel di 2-DE è stata condotta grazie all’uso del software ProteinQuest™. ProteinQuest™ è uno strumento di ricerca ed analisi, capace di raccogliere i dati provenienti dalla letteratura
scientifica indicizzata in PubMed, al fine di ottenere nuove informazioni o di trarre conclusioni statisticamente più robuste di quelle documentate sulla base di ogni singolo studio. ProteinQuest™ permette di eseguire in
modalità automatica tutti i passaggi che iniziano dalla ricerca delle pubblicazioni indicizzate in PubMed fino alla creazioni della tabella di contingenza.
I dati ottenuti dalla tabella di contingenza sono stati analizzati statisticamente mediante il software XLSTAT (Addinsoft, Parigi, Francia). La co-occorenza degli spot
è stata misurata in modo da raggruppare gli spot che più frequentemente si presentato simultaneamente nella stessa immagine, in accordo con il metodo di
correlazione di Pearson. Questa analisi restituisce l’informazione se due spot si presentato contemporaneamente sulla stessa immagine.
Per l’analisi dei gruppi è stata utilizzata la Agglomerative Hierarchical Clustering (AHC) allo scopo di raggruppare i diversi esperimenti sulla base della loro
similarità nella rappresentazione vettoriale della matrice di correlazione degli spot . Questa analisi ha permesso di identificare quali gruppi di esperimenti hanno
un profilo di spot simile.
Figura 1
Rappresentazione grafica la matrice di correlazione
degli spot. Le celle della matrice sono colorate
secondo il coefficiente di correlazione di Pearson, dal
blu (correlazione negativa degli spot) al rosso
(correlazione positiva). Il colore bianco rappresenta
l’assenza di correlazione tra i corrispondenti spot.
Figura 3
L’analisi di correlazione identifica due gruppi di
spot correlati positivamente e che sono
mutualmente esclusivi. Il primo gruppo di spot è
colorato in blu e mentre il secondo gruppo di spot
è colorato in rosso. I due gruppi di spot si
differenziano sia per peso molecolare sia per
punto isoelettrico.
Figura 5
Metagel di DJ-1, ottenuto sommando le 160
immagini dei gel 2-DE estratti dai lavori indicizzarti
un PubMed. Questo metagel rappresenta un pool
di espressione di tutte le forme possibili di DJ-1.
Gli spot identificati mediante algoritmo watershed
sono bordati di nero e numerati. La scala di colore
è riportata in basso a sinistra.
Figura 2
Cluster analisi di tutti gli esperimenti di 2-DE considerati,
basato sull’analisi della presenza o assenza degli spot
rappresentati in figura 5. É possibile identificare tre
diversi gruppi, 2 di questi gruppi contengono solamente
esperimenti eseguiti su DJ-1 estratta da campioni
neuronali.
Figura 4
Analisi di DJ-1 estratta esclusivamente da tessuto di
cervello umano. Nel pannello A e B vengono mostrati i
meta gel delle forme di DJ-1 presenti da immagini di
gel 2-DE estratti dalla letteratura. Il pannello A è
ottenuto dalle immagini di soggetti di controllo mentre
il pannello B è ottenuto da soggetti che presentano
patologie neurodegenerative.
Nei pannelli C e D vengono mostrati i metagel ottenuti
dagli esperimenti condotti su 3 individui di controllo e
3 pazienti di Parkinson.
Sia nel caso del metagel ottenuto dalle immagini di
letteratura sia in quello ottenuto sperimentalmente è
possibile evidenziare un aumento delle forme più
acide della proteina nei casi di neuro degenerazione.
La meta-analisi dei dati di proteomica può fornire preziose informazioni a riguardo dei diversi processi biologici (o meccanismi a loro legati) che altrimenti resterebbero nascoste valutando singolarmente le pubblicazioni. È
universalmente riconosciuta la necessità di adottare nuovi strumenti utili a valutare e filtrare i dati ottenuti dall’analisi proteomiche per evitare di identificare come marker di malattia proteine che sono invece connesse a
meccanismi generici di stress molecolare o alterate da limitazioni della tecnica 2-DE. Un recente e brillate lavoro sui “déjà-vu in proteomica “ (Petrak et al., 2008) riassume brillantemente i rischi legati alla tecniche
proteomiche. D’altro canto la comunità scientifica che lavora nel settore ha già cercato di definire diversi standard, il più conosciuto è certamente il MIAPE (Taylor et al., 2007), di documentazione e archiviazione per tutti i
dati prodotti in lavori proteomici. Però questi standard stentano ad essere utilizzati e ad oggi non è ancora disponibile uno strumento in grado di eseguire potenti ed automatiche meta analisi dei dati di 2-DE.
In questo lavoro abbiamo sviluppato un’innovativa ed automatica procedura (mediante l’utilizzo del software ProteinQuest™)per valutare gli stati di DJ-1, una proteina che presenta eterogenee modifiche post-traduzionali,
confrontando 160 differenti esperimenti ottenuti da 37 diversi lavori. Malgrado la presenza di diverse forme della proteina, con diverso peso molecolare e punto isoelettrico, abbiamo trovato che DJ-1 si presenta
coerentemente associata a due principali pool, con un differente MW e pI. Questi due pool sono mutualmente esclusivi ed il pool a circa 20kDa e con pI medio più acido mostra una forte specificità per i tessuti neuronali.
Inoltre risulta che questo pool di forme neuronali mostra un significativo spostamento verso un pI più acido quando la proteine DJ-1 è stata estratta da soggetti affetti da patologie neurodegenerative.
In conclusione è possibile ipotizzare che questo strumento potrà fornire supporto per ulteriori ricerche di meta-analisi condotte al fine di valutare la validità dei dati prodotti da studi proteoimici o aiutare la scoperta di nuovi
potenziali target di ricerca.
Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O, Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, Squitieri F, Ibanez P, Joosse M, van Dongen JW, Vanacore N, van Swieten JC, Brice A, Meco G, van Duijn CM, Oostra BA, Heutink P.
(2003) Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science 299: 256-259.
Choi J, Sullards MC, Olzmann JA, Rees HD, Weintraub ST, Bostwick DE, Gearing M, Levey AI, Chin LS, Li L (2006) Oxidative damage of DJ-1 is linked to sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. J Biol Chem 281:
10816-10824.
Kinumi T, Kimata J, Taira T, Ariga H, Niki E (2004) Cysteine-106 of DJ-1 is the most sensitive cysteine residue to hydrogen peroxide-mediated oxidation in vivo in human umbilical vein endothelial cells. Biochem
Biophys Res Commun 317: 722-728.
Mitsumoto, A., Nakagawa, Y., 2001. DJ-1 is an indicator for endogenous reactive oxygen species elicited by endotoxin. Free Radicals Research 35, 885-893.
Mitsumoto A, Nakagawa Y, Takeuchi A, Okawa K, Iwamatsu A, Takanezawa Y (2001) Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increased in response to sublethal levels of paraquat. Free
Radic Res. 35: 301-310.
Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, Tamai K, Iguchi-Ariga SM, Ariga H. (1997) DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras. Biochem Biophys Res Commun 231: 509513.
Olzmann JA, Brown K, Wilkinson KD, Rees HD, Huai Q, Ke H, Levey AI, Li L, Chin LS (2004) Familial Parkinson's disease-associated L166P mutation disrupts DJ-1 protein folding and function. J Biol Chem 279: 85068515.
Olzmann JA, Li L, Chudaev MV, Chen J, Perez FA, Palmiter RD, Chin LS. (2007) Parkin-mediated K63-linked polyubiquitination targets misfolded DJ-1 to aggresomes via binding to HDAC6. J Cell Biol 178: 1025-1038.
Petrak J, Ivanek R, Toman O, Cmejla R, Cmejlova J, Vyoral D, Zivny J, Vulpe CD (2008). Déjà vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified differentially expressed proteins. Proteomics , 8 (9), 1744-9.
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Chris F Taylor, Norman W Paton, Kathryn S Lilley, Pierre-Alain Binz, Randall K Julian, Jr, Andrew R Jones, Weimin Zhu, Rolf Apweiler, Ruedi Aebersold, Eric W Deutsch, Michael J Dunn, Albert J R Heck, Alexander
Leitner, Marcus Macht, Matthias Mann, Lennart Martens, Thomas A Neubert, Scott D Patterson, Peipei Ping, Sean L Seymour, Puneet Souda, Akira Tsugita, Joel Vandekerckhove, Thomas M Vondriska, Julian P
Whitelegge, Marc R Wilkins, Ioannnis Xenarios, John R Yates, III & Henning Hermjakob (2007) The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nature Biotechnology 25, 887 – 893.
Questo lavoro è il primo esempio di meta analisi dei dati di letteratura condotto
utilizzando le immagini presenti nelle pubblicazioni. ProteinQuestTM si è
dimostrato uno strumento potente ed indispensabile per ottenere le immagini
utilizzate nell’analisi. ProteinQuestTM verrà usato per nuove analisi ed è
attualmente disponibile in versione demo.
Schermate di esempio di ProteinQuestTM
