PROGETTO DI RICERCA SUI MECCANISMI

PROGETTO DI RICERCA SUI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA
FIBRODISPLASIA OSSIFICANTE PROGRESSIVA: aggiornamenti e proposte
Con il contributo dell’Associazione FOP Italia
Gruppo di Ricerca
Dott.ssa Renata Bocciardi, ricercatore universitario, Università di Genova
Dott.ssa Francesca Giacopelli, assegnista di ricerca, Università di Genova
Dott.ssa Laura Tonachini, assegnista di ricerca, Università di Genova
Serena Cappato, dottoranda, Università di Genova
DiNOGMI - Università di Genova e CEBR
U.O.C. Genetica Medica - Ist. G. Gaslini
Direttore Prof. Roberto Ravazzolo
Genova, 7/09/2013
Studio dei fattori e dei meccanismi molecolari che
intervengono nella regolazione dell'espressione del gene
ACVR1
Screening di composti con potenziale effetto farmacologico,
messa a punto saggi funzionali
FOP, infiammazione e sistema immunitario innato
Regolazione dell’espressione del gene ACVR1 nelle cellule del sistema immunitario
(sia in vitro in modelli cellulari selezionati che in vivo)
Studio del differenziamento delle cellule del sistema immunitario innato (iPS pz vs
cellule di controllo)
Studio della regolazione genica di ACVR1
ATG
Regione del promotore
5’UTR
Regolazione trascrizionale
•
Sequence 5’UTR
•
Promoter
•
Enhancers/silencers
STOP
Regione codificante la proteina
3’ UTR
trascrizione
mRNA 1
mRNA 2
traduzione
Regolazione Post-transcriptionale
Splicing
mRNA stabilità
Small RNA
Effetto sulla traduzione
proteina
Ruolo delle sequenze
5’UTR in corso
Ruolo del 3’UTR e dei microRNA
Identificazione del promotore & analisi funzionale
Progetto ENCODE
EGR1
HEY-1
PU.1/SPI1
ZBTB7A
UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu
Genova, 7 Settembre 2013 - Laura Tonachini
Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (luciferasi)
Abbiamo generato una linea cellulare stabilmente
trasfettata
esprimente il gene reporter della
luciferasi sotto il controllo dell’intera regione del
promotore di ACVR1.
Linea cellulare utilizzata: ATDC5 (topo).
Selezione di diversi cloni.
Sistema adattato alle piastre da 96.
Screening library Enzo-Life Sciences-The Screen-WellTM
Epigenetics Library (43 composti in 10mM DMSO – a 80°C)
“Allenamento tecnico” indispensabile per affrontare lo screening
su larga scala (Prestwick Chemical Library® 1200 composti)
Schema di lavoro :
Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attività luciferasica)
Molecole candidate
(curve dose- risposta)
Effetto sull’mRNA endogeno
di ACVR1 (RT-qPCR)
Effetto sul BRE-LUC reporter
gene (+/- BMP)
Saggi di secondo livello
(effetto sul differenziamento
cellulare in coltura e sulla
formazione di osso ectopico
in vivo in modelli murini)
PROTOCOLLO EPI LIBRARY : CLONI ATDC5-Pr2.9 ACVR1
Giorno 0 - Piastratura in terreno di deplezione
senza siero in piastra multi pozzetto da 96
Giorno 1 - Trattamento:
Dalla piastra della library (conservata -80°C) prelevo 2 µl per ciascun composto
(alla concentrazione scelta) e li aggiungo alla piastra da 96 pozzetti contenente
200 µl di terreno (diluizione 1:100).
Per ciascuna fila di composti preparo due file (ogni composto in doppio).
Rimuovo il terreno dalle cellule e lo sostituisco con quello fresco contenente i
composti della library alla diluizione scelta. Lascio incubare i composti con le
cellule per 24h.
Giorno 2 - Lavo con PBS e liso con “Cell culture Lysis Buffer” (Promega) per il
saggio luciferasico
Lettura luminometrica con Glomax
Come si presenta la piastra…
Pyridine
Trichost
Splitomi
carboxyl Garcinol
atinA
cin
ic acid
BML210
Suberoy
Aza
l bis- Scriptai Nullscri
Zebulari
Apicidin
deoxycy
hydroxa
d
pt
ne
tidine
mic acid
SAHA
Tranylcy
Phenylb
Isonicot
promine Valproic
Resvera
Nicotina BML- Piceata FluoroS
ITSA-1 utyrrate
EX-527
M-344
inamide
hemisul
acid
trol
AHA
mide
266
nnol
-Na
fat
Valproic
BIXacid
Salermi
MC- Anacard
Butyrola
Oxamfla
Suramin
AGK2
B2
01294CTPB
Sirtinol
ic Acid
ctone 3
tin
-6Na
hydroxa
de
1293
3HCl
mate
BML278
NCH-51 CI-994
NSC3852
Aminore
sveratro
l sulfate
BML281
Triacety
lresvera DMSO
trol
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
Grafico risultati
trattamento con
Epigenetic Library
(20 µM)
Lista dei composti aventi un effetto sul nostro promotore
Molecole candidate
(curve dose- risposta)
I composti da noi selezionati hanno un
effetto sulla vitalità cellulare?
Sono tossici o ben tollerati dalle cellule?
One Glo + Tox (Promega)
ONE GLO
Controllando effetto sulla vitalità cellulare, API e TSA non hanno confermato
effetto inibitorio mentre RESVERATROLO confermato sempre attivatorio :
Ci siamo concentrati su quest’ultima sostanza!
Schema di lavoro :
Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attività luciferasica)
TOSSICITA’
Molecole candidate
(curve dose- risposta)
Effetto sull’mRNA endogeno
di ACVR1 (RT-qPCR)
RESVERATROLO
Effetto sul BRE-LUC reporter
gene (+/- BMP)
Saggi di secondo livello
(effetto sul differenziamento
cellulare in coltura e sulla
formazione di osso ectopico
in vivo in modelli murini)
Curva dose risposta resveratrolo 3 cloni promotore (ONEGLO+Tox)
I tre cloni mostrano massimo effetto del resveratrolo sull’attività del promotore a
20µ
µM
Schema di lavoro :
Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attività
luciferasica)
Molecole candidate
(curve doserisposta)
Effetto sull’mRNA endogeno
di ACVR1 (RT-qPCR)
Effetto sul BRE-LUC reporter
gene (+/- BMP)
Saggi di secondo livello
(effetto sul differenziamento
cellulare in coltura e sulla
formazione di osso ectopico
in vivo in modelli murini)
Effetto del trattamento del RESVERATROLO sull’mRNA di
ACVR1
Riassunto esperimenti RT/qPCR
In media 100µM attiva 3 volte, 10µM attiva 5/6 volte.
Anche il T-resveratrolo sembra promettente :
curva dose risposta 3 cloni promotore (Kit ONEGLO+Tox)
Attivatorio da 10 a 200µM di circa 2 volte :
proveremo l’effetto sull’endogeno
Resveratrol
A Phytochemical With Health Benefits
Found in Red Wine
Antoxidant activity
Cancer inhibition
Cholestrol regulation
AntiAnti-inflammatory
Osteogenic effects of resveratrol in vitro: potential for
the prevention and treatment of osteoporosis
BRE : CASCATA DI SEGNALAZIONE DELLE BMP
Inibitori
extracellulari
Sono state generate ATDC5 stabilmente
trasfettate con l’elemento BRE (Bone
Responsive element) a monte del gene
Luciferasico.(Serena)
Pseudo
recettori
Dei 52 cloni generati, 5 sono stati selezionati
per:
L’attività luciferasica in condizioni
basali
Il livello di attivazione in seguito a
trattamento
con BMP2 (50 ng/ml)
Segnale stabile nel tempo
Inibitori
intracellulari
BRE
LUCIFERASE
BRE-Luc clones
14
13
12
11
I cloni H13 e B3 sono
stati utilizzati per gli
esperimenti successivi
10
9
8
NT
+ BMP2
7
6
5
4
3
2
1
0
NT
+ BMP2
H13
F2
H7
B3
g9
1
1
1
1
1
E7
1
3,59033831
6,01812938
2,91624767
9,39345709
4,74670565
6,09387091
Effetto sul BRE-LUC reporter gene (+/- BMP)
Anche con il “sistema BRE”
si conferma realmente
attivatorio (kit ONEGLO)
solo il RESVERATROLO !
Le modulazioni inibitorie o attivatorie che
osserviamo sul promotore di ACVR1 corrispondono
ad effetti biologici sul differenziamento
condrogenico?
Necessario avvalersi di test di secondo livello per
verificare una correlazione tra la modulazione del
promotore del nostro gene e una reale modifica
del pattern differenziativo atteso.
Saggi di secondo livello
(effetto sul differenziamento cellulare in coltura e sulla
formazione di osso ectopico in vivo in modelli murini
Differenziamento condrogenico
Da provare : Pellet (tridimensionale)
Cellule coltivate in adesione, si
staccano con tripsina e si trasferiscono
in provette da 15ml.
Si centrifugano per favorire la
formazione del pellet.
Si coltivano in 1 ml di terreno
condrogenico : DMEM/αMEM, 5%FCS,
TGFβ3, dexametasone, ac.ascorbico,
ITS per 21/28 giorni (in
presenza/assenza sostanze
selezionate)
Estrazione RNA e valutazione
espressione marker condrogenici
COLORAZIONI
ISTOLOGICHE/
IMMUNOISTOCHIMICA
TEST
Blu di
toluidina
REAL TIME PCR :
espressione mRNA
marker condrogenesi
COLLAGENO II
SOX9
ALP
Collageno
tipo II
Serena Cappato
Screening di composti con potenziale effetto farmacologico
FOP e sistema immunitario innato: generazione di cellule
iPS da pazienti affetti da FOP e individui di controllo
Dottorato di Ricerca in Genetica, Indirizzo: Clinica, genetica e Immunologia delle Malattie dell’Età Evolutiva
Progetto
“Fibrodisplasia Ossificante Progressiva: meccanismi di regolazione del gene ACVR1 e approccio terapeutico”
Obiettivo:
Individuare composti chimici con potenziale effetto farmacologico
sull’espressione di ACVR1
Prestwick Chemical Library - 200 composti approvati dalla FDA
(15 piastre da 96 pz alla concentrazione di 10 mM in un volume di 100 µl)
Obiettivo:
Individuare composti chimici con potenziale effetto farmacologico
sull’espressione di ACVR1
COME ABBIAMO LAVORATO?
- Screening su cellule ATDC5 trasfettate stabilmente con il
promotore di ACVR1 (PromACVR1/Luc)
- Analisi effettuata a due concentrazioni (20 µM e 2 µM)
- Valutazione della tossicità dei composti
Schema di lavoro
DIPYRIDAMOLE
DMSO
DMSO
RESVERATROLO
2µ
µM
20µ
µM
Luc + Fluo
Z’ Factor
Lo Z’ factor è un parametro statistico utilizzato per valutare la
qualità di un test HTS.
z’= 1- (3σc+ + 3σc- )
|µc+ - µc-|
σ=
µ=
Nel nostro test abbiamo utilizzato il Resveratrolo come
controllo positivo e il Dipyridamole come controllo negativo
Z’ factor
Resveratrol (c+)
z’ factor 0.631±0.104
Dipyridamole (c-)
z’ factor: 0,650 ± 0,127
Normalizzazione
• Tutti i composti della libreria sono stati
normalizzati con questa formula:
Attività Luciferasica normalizzata su DMSO
Fluorescenza (AFC) normalizzata su DMSO
Parametri scelti:
≤ 50
≤ 75
≥ 190
Composti inibitori
Composti attivatori
≥ 130
Composti individuati:
208 inibitori
61 attivatori
* 100
Classi farmacologiche
25 ≥25%
9 ≥30%
0 ≥40%
0 ≥50%
19 ≥25%
8 ≥30%
1 ≥40%
0 ≥50%
Cortisonici
35 ≥25%
28 ≥30%
8 ≥40%
4 ≥50%
Classi farmacologiche a confronto
Gli inibitori più forti
20 uM
4 cortisonici
1 vasodilatatore
1 antibatterico
Dexamethasone acetate 66.7490
Halcinonide
55.23587
Fluticasone propionate 68.79206
Medrysone
55.07056
Dypiridamole
42.07355
Chloroxine
52.39477
SD
2 uM
SD
7.247298
2.478615
0.426305
3.362713
2.510112
5.534526
55.67851
70.17471
53.8373
68.5204
62.41078
117.7919
5.448318
8.591271
3.466701
6.504571
4.868173
2.669508
Dexamethasone e i suoi derivati, dexamethasone sodium phosphate e dexamethasone
acetate, sono glucocorticoidi di sintesi che vengono utilizzati per le loro proprietà
antiinfiammatorie o immunosoppressive.
Halcinonide viene utilizzato per uso topico nel trattamento di patologie cutanee.
Fluticasone propionate è un derivato corticosteroideo del fluticasone utilizzato per il
trattamento di asma, riniti allergiche ed esofagiti eosinofiliche.
Medrysone è un corticosteroide utilizzato in optometria e oftamologia .
Dipyridamole è un medicinale che usato cronicamente inibisce la formazione di trombi e
usato ad alte dosi ma per brevi periodi determina vasodilatazione (Persantine).
Chloroxine è un antibatterico utilizzato per patologie infiammatorie intestinali, diarrea,
giardiasi. E’ utile anche per il trattamento della dermatite seborroica .
Gli Attivatori più forti
Nabumetone
Rabeprazole Sodium salt
Niclosamide
Methiazole
Nocodazole
Tenatoprazole
Nalmefene hydrochloride
Analgesic/FANS
Antiulcerative
Anthelmintic
Antiparasitic
Antineoplastic
Reflux oesophagitis and
peptic ulcer treatment
Narcotic antagonist
20 uM
240,0790
177,0269
265,1190
290,5379
242,5110
SD
86,8879
38,6214
177,2035
5,2073
33,7128
2 uM
169,8117
197,0995
196,1296
194,4665
127,1633
SD
13,8166
15,2066
47,4797
40,4670
14,8248
204,7247
294,4446
8,1037
237,0054
151,5978
99,0473
16,0624
33,6878
Nabumetone è un farmaco antiinfiammatorio non steroideo che viene utilizzato come in processi infiammatori
di rilevante entità, soprattutto di origine articolare: ad esempio nella artrite reumatoide, nell'osteoartrosi, nella
spondilite anchilosante, nella artropatia gottosa e nel reumatismo extrarticolare.
Rabeprazole Sodium salt è un inibitore delle pompe protoniche e viene utilizzato per il trattamento di ulcere
gasstriche, duodenali e reflusso gastroesofageo.
Niclosamide è il farmaco di scelta per la maggior parte di infezioni da cestodi (tenie). La sua azione è stata
attribuita alla capacità di inibire la fosforilazione mitocondriale anerobia dell'ADP che fornisce energia
disponibile sotto forma di ATP.
Methiazole è un antielmintico ad ampio spettro efficace nei casi di poliinvasione, soprattutto contro
Echinococcus.
Nocodaziole è un farmaco antineoplastico che a livello cellulare interferisce con la polimerizzazione dei
microtubuli.
Tenatoprazole è un inibitore di pompa protonica non ancora in commercio con un’emivita 5/7 volte superiore
agli altri PPI, utilizzato nel trattamento del reflusso esofageo e ulcera peptica .
Analisi degli inibitori individuati
I composti emersi dall’analisi HTS sono i candidati per analisi successive
1. Analisi dose-risposta
2. Analisi dell’effetto del trattamento sull’intera cascata di segnalazione delle BMP
3. Analisi dell’effetto dei trattamenti sull’espressione del gene ACVR1 endogeno
4. Analisi dell’effetto del trattamento sulla capacità differenziative delle cellule
(saggi secondari ATDC5/condrogenesi; C2C12/osteogenesi)
Un esempio………….. il DIPYRIDAMOLE
Dipyridamole: curva dose-risposta
120
Dipyridamole
Effect on Prom2.9
100
80
60
40
20
0
DMSO 0.5
120
1
2
5
10
20
50
70
150
200
µM
Il Dipyridamole ha un’azione inibitoria
sia sul Promotore di ACVR1 che
sull’intera cascata BMP (BRE-Luc)
Dipyridamole
100
Effect on BRE-Luc
100
80
Seguiranno i saggi funzionali di
secondo livello (saggi differenziativi)
60
40
20
0
DMSO 0.5
1
2
5
10
20
50
µM
Serena Cappato
Screening di composti con potenziale effetto farmacologico
FOP e sistema immunitario innato: generazione di cellule
iPS da pazienti affetti da FOP e individui di controllo
Dottorato di Ricerca in Genetica, Indirizzo: Clinica, genetica e Immunologia delle Malattie dell’Età Evolutiva
Progetto
“Fibrodisplasia Ossificante Progressiva: meccanismi di regolazione del gene ACVR1 e approccio terapeutico”
Cellule iPS
Cellule staminali pluritpotenti indotte o “Induced pluripotent stem cells ( iPS cells
or iPSCs)” sono cellule pluripotenti derivate artificialmente da cellule di tessuti adulti
(cellue somatiche, es. Fibroblasti cutanei, cellule del sangue etc) mediante diverse
metodiche basate sulla Ri-espressione forzata di alcuni specifici geni
Le iPS sono simili per alcuni aspetti alle cellule staminali vere e proprie (staminali
embrionali)
Espressione di geni e proteine cosiddetti di “staminalità”
Profilo di metilazione della cromatina
Tempo di replicazione
Capacità di formare teratomi
Capacità differenziative in tipi cellulari diversi
Serena ha presentato un progetto ad hoc e ottenuto una Borsa di studio EFIS
Dr G. Uzan – M.C. LeBrousse
INSERM U972
Hôpital Paul Brousse
Villejuif (France)
iPS cells for Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:
a tool towards understanding the role of the innate
immune system
Oct3/4
yc Klf4
M
cSox2
Cellule iPS
possono essere coltivate
espanse indefinitamente
differenziate verso diversi tipi cellulari
Cellule midollo osseo
Neuroni
Riprogrammazione cellule
somatiche
Osteoblasti
Adipociti
Fibroblasti cutanei
2 pz affetti da FOP
3 individui di controllo
Studio del differenziamento mono/macrofagico
a partire da iPS dei pazienti
Congresso Annuale della Società Europea
di Genetica Umana - ESHG 2013
8- 11 Giugno 2013, Parigi
Study of ACVR1 gene expression regulation:
a way to discover a “druggable” target
towards Fibrodiysplasia Ossificans
Progressiva (FOP) treatment (Poster)
Congresso Annuale della Società Italiana
di Genetica Umana - SIGU2013
25-27 Settembre 2013, Roma
Transcriptional regulation of the ACVR1
gene: a target to drug discovery for
Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
(FOP)
Comunicazione orale
Identification and characterization of regulatory elements in the
promoter of ACVR1, the gene mutated in Fibrodysplasia Ossificans
Progressiva
Francesca Giacopelli1, Serena Cappato1, Laura Tonachini1, Marzia
Mura1, Simona Di Lascio2, Diego Fornasari2,3, Roberto Ravazzolo1,4
and Renata Bocciardi1,4
1Università
degli Studi di Genova
2Università di Milano
3CNR- Istituto di Neuroscienze, Milano
4Istituto Giannina Gaslini, Laboratorio Genetica Molecolare, Genova
Journal: Orphanet Journal of Rare Diseases
Che cosa abbiamo capito?
Una regione genica nel DNA , definita promotore, regola
l’espressione del gene e della proteina ACVR1
Nella regione promotore esistono elementi che legano
proteine il cui legame al DNA potrebbe essere modificato da
eventuali farmaci
Il sistema HTS (Laura, Serena) di ricerca di composti chimici che
è stato messo a punto sulla regione genica regolatrice è
assolutamente valido e promettente
Le proteine capaci di regolare l’espressione di ACVR1 sono
altresì interessate nella regolazione di diversi processi:
infiammazione differenziamento osteogenesi
Quale sarà il nostro prossimo obiettivo?
Le conoscenze acquisite ci consentono di approcciare
altri aspetti importanti nella FOP, mediante:
•L’analisi dell’espressione di ACVR1 e delle proteine
regolatrici durante i processi di infiammazione e
osteogenesi
•La verifica dell’effetto dei composti ottenuti dallo
screening su questi processi
FOP -Infiammazione-Risposta Immunitaria
Domanda:
Quali stimoli causano i flare-up e la conseguente
ossificazione eterotopica nei pazienti che portano la
mutazione di ACVR1?
Risposta: infiammazione e risposta immunitaria
Numerose evidenze suggeriscono che l’infiammazione e la
risposta immunitaria hanno un ruolo determinante nella
progressione della malattia scatenando le riacutizzazioni post
natali.
Analisi tissutale delle lesioni di pazienti FOP
• Comparsa di gonfiori dolorosi
•Fase 1 infiammazione e distruzione del tessuto
•Fase 2 formazione nuovo tessuto (osso eterotopico)of
•
Le riacutizzazioni episodiche della malattia possono essere innescate da traumi, infezioni virali ed
immunizzazioni.
•
Compaiono segni influenzali durante I processi di riacutizzazione (Flare Up) della malattia.
•
Gonfiori, edemi sono presenti nella regione del flare-up.
•
Presenza di infiltrati leucocitari ( Linfociti B, T, mastociti, macrofagi) nel muscolo affetto durante le
fasi precosi della malattia.
•
Distruzione tissutale del muscolo scheletrico durante il flare-up
•
Intensa risposta clinica ai corticosteroidi nelle prime 24-36 ore dall’insorgenza del flare-up
•
Variazione stagionale della progressione della malattia.
•
Lunghi periodi di quiescienza tra I flare-up, reminescenti dei cicli di esacerbazione-remissione dei
pazienti con sclerosi multipla.
Lunghi periodi di quiescienza in presenza di agenti immunosoppressivi usati in seguito a trapianto
del midoloo osseo.
EMATOPOIESI
Infiammazione e monociti-macrofagi
I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il
2-10% della popolazione leucocitaria.
I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie
naturali e specifiche. La loro funzione principale è la fagocitosi cioè la capacità
di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i microrganismi, e
di distruggerle.
La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule ematiche, è la cellula staminale
multipotente. Nel midollo osseo questa cellula si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al
monoblasto; maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio sotto forma di
monocita.
I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione o nel tessuto leso, dove
differenziano (polarizzazione) seguendo un processo specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li
espone.
Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, definiti attivati classicamente o alternativamente, M1 o M2 con
funzioni biologiche differenti.
Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di fagocitare.
Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la
componente staminale.
L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno sbilanciamento tra le due differenti
popolazioni, la loro attivazione e un differenza temporale nella loro comparsa.
Infiammazione e monociti-macrofagi
I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il 2-10% della popolazione
leucocitaria.
I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie naturali e specifiche. La loro funzione
principale è la fagocitosi cioè la capacità di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i
microrganismi, e di distruggerle.
La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule
ematiche, è la cellula staminale multipotente. Nel midollo osseo questa cellula
si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al monoblasto;
maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio
sotto forma di monocita.
I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione o nel tessuto leso, dove
differenziano (polarizzazione) seguendo un processo specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li
espone.
Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, definiti attivati classicamente o alternativamente, M1 o M2 con
funzioni biologiche differenti.
Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di fagocitare.
Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la
componente staminale.
L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno sbilanciamento tra le due differenti
popolazioni, la loro attivazione e un differenza temporale nella loro comparsa.
EMATOPOIESI
Infiammazione e monociti-macrofagi
I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il 2-10% della popolazione
leucocitaria.
I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie naturali e specifiche. La loro funzione
principale è la fagocitosi cioè la capacità di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i
microrganismi, e di distruggerle.
La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule ematiche, è la cellula staminale
multipotente. Nel midollo osseo questa cellula si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al
monoblasto; maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio sotto forma di
monocita.
I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione
o nel tessuto leso, dove differenziano (polarizzazione) seguendo un processo
specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li espone.
Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, gli M1 o M2 con funzioni
biologiche differenti.
Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di
fagocitare.
Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine
antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la componente staminale.
L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno sbilanciamento tra le due differenti
popolazioni, la loro attivazione e un differenza temporale nella loro comparsa.
Monocita
Macrofago
Infiammazione e monociti-macrofagi
I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il 2-10% della popolazione
leucocitaria.
I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie naturali e specifiche. La loro funzione
principale è la fagocitosi cioè la capacità di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i
microrganismi, e di distruggerle.
La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule ematiche, è la cellula staminale
multipotente. Nel midollo osseo questa cellula si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al
monoblasto; maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio sotto forma di
monocita.
I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione o nel tessuto leso, dove
differenziano (polarizzazione) seguendo un processo specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li
espone.
Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, gli M1 e M2 con funzioni biologiche differenti.
Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di fagocitare.
Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la
componente staminale.
L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno
sbilanciamento tra le due differenti popolazioni, la loro attivazione e un
differenza temporale nella loro comparsa.
L’infiammazione, attraverso l’attivazione dei macrofagi può :
• determinare il destino delle cellule staminali
• coordinare il riparo tissutale
• favorire il coinvolgimento dei macrofagi nel processo di ossificazione
Nostra ipotesi:
La proteina recettrice ALK2 mutata sulla superficie dei
monociti/macrofagi può
1.determinare una diversa risposta a citochine o fattori di
crescita secreti inizialmente nel sito dell’infiammazione?
2.influenzare la polarizzazione dei macrofagi e
conseguentemente la formazione di osso eterotopico.?
Esperimenti suggestivi…
Gli esperimenti della Dottoressa Brunelli e Zordan, del
Dipartimento di Scienze della Salute,Università di MilanoBicocca di deplezione di monociti sono a tal proposito molto
indicativi.
In breve……Effetto del clodronato sulla formazione di osso in un modello
murino
Il clodronato riduce la popolazione circolante di monociti (70% ca) determinando uno
sbilanciamento delle due popolazioni M1-M2
In seguito a deplezione la formazione di
osso nel muscolo in presenza di BMP2 è >
nei topi trattati.
Nostri prossimi obiettivi
1) Esperimenti in vitro, su monociti umani ottenuti da donatori e pazienti FOP
Scopo:
verificare il differenziamento a macrofagi (M1/M2)
analisi espressione ACVR1 e delle sue proteine regolatrici
2) Esperimenti in vitro, su linee cellulari stabili monocitarie (THP1, U937)
Scopo:
analisi funzionale della regione regolatrice di ACVR1
analisi espressione ACVR1 e delle sue proteine regolatrici
analisi di espressione in seguito a differenziamento
3)Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP
Scopo:
analisi delle popolazioni leucocitarie coinvolte nella risposta immunitaria
correlazione tra la popolazione leucocitaria e le diverse fasi della patologia
identificazione di marcatori cellulari
1 Donatori e Pazienti
2 Selezione Monociti
3 Coltura Monociti
4 Differenziamento M1-M2
5 Analisi popolazione differenziata e profilo espressione
Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP
Dott.ssa Genny Del Zotto Dott.ssa Francesca Antonini Dott.
Andrea Petretto
Dipartimento di Medicina Sperimentale
Core Facilities
Direttore Lorenzo Moretta
Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP
Cosa è?
Immunofenotipo : insieme di molecole espresse sulla superficie delle cellule appartenenti al
comparto emopoietico.
Ogni tipo di cellula del sangue (es: linfociti T, linfociti B, monociti, etc.) può essere riconosciuto e
distinto dagli altri proprio in base al suo corredo caratteristico di molecole di superficie (fenotipo).
Il codice che permette di identificare univocamente ognuna di queste molecole è chiamato “Cluster
Differentiation” (abbreviato in CD seguito da un numero progressivo che identifica ogni molecola).
Come si determina?
Mediante anticorpi diretti contro le molecole sopra citate che servono per distinguere in modo
inequivocabile le popolazioni cellulari.
Su quali campioni si esegue?
L’immunofenotipizzazione può essere effettuata su: sangue, midollo, tessuti. E’ una tecnica che ha
permesso di compiere notevoli passi avanti nella diagnosi e terapia di molte malattie e attualmente
rappresenta la metodica d’elezione per la diagnosi di malattie ematologiche e autoimmuni.
ESEMPIO DI IMMUNOFENOTIPO
I linfociti sono divisibili in tre filiere (popolazioni) principali:
LinfocitiT
Linfociti B
Natural Killer
Ognuna di queste filiere è riconoscibile per l’espressione unica di molecole di superficie:
TIPO CELLULARE
SOTTOPOPOLAZIONI
Linfociti T
Citotossici
MOLECOLE
CARATTERIZZANTI
CD3 e CD8
Helper
CD3 e CD4
Linfociti B
CD19 CD20
Natural Killer
CD56 e CD235
Esempio: i linfociti T sono tutti caratterizzati dall’espressione del CD3 .
Le due sottopopolazioni di T , i T helper e i T citotossici si distinguono in base
all’espressione di CD4 o CD8.
Scopo
Poiché la tipizzazione completa della popolazione leucocitarie nei pazienti
FOP ad oggi non è stata mai fatta, si intende verificare :
1) se le caratteristiche delle cellule dell’immunità dei pazienti hanno o meno
caratteristiche diverse da quelle dei controlli
2) se esistono variazioni del fenotipo in relazione alle diverse fasi della
malattia (quiescienza-riacutizzazione)
Metodo sperimentale
Se possibile, la tipizzazione andrà effettuata a cadenze regolari, (per esempio
3 volte all’anno) per:
• correlare le variazioni del fenotipo a fasi di quiescienza e riacutizzazione
• rendere le variazioni del fenotipo il più possibile indipendenti dalla terapia
effettuata
Prelievo di un campione di sangue (circa 5ml in EDTA) di pazienti - donatori
Marcatura del campione con anticorpi fluorescenti (previsti nel nostro studio
l’uso combinato di anticorpi >30!!)
Lettura al citofluorimetro
Strumenti e Reagenti in maggior dettaglio
Le cellule presenti nel sangue vengono marcate con anticorpi (legati a molecole
fluorescenti) diretti contro le varie molecole presenti sulla superficie cellulare.
La lettura del campione viene effettuata mediante un citofluorimetro, in grado di analizzare
le cellule sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo.
Lo strumento presente in Istituto è in grado di studiare in contemporanea la presenza sulla
superficie di una cellula di 10 molecole (legate a dieci diversi anticorpi con diverse
fluorescenze) più le caratteristiche fisiche delle cellule (dimensioni e granulosità)
Esempio di studio fenotipico effettuato al citometro:
i risultati di un analisi compaiono in un piano cartesiano come quello sottoriportato dove
sono evidenziate le percentuali delle diverse popolazioni.