Tecniche di isolamento

Tecniche di isolamento
Considerazioni generali
• Spesso il primo passo verso un isolamento di successo è
quello di imitare le condizioni ambientali in cui vive
l’organismo. Ad esempio per alghe marine che vivono
vicino alla costa temperatura and salinità sono
importanti, mentre la qualità delle acque ed i metalli
pesanti lo sono per le alghe oceaniche.
Considerazioni generali
• Le alghe di acqua dolce sono meno sensibili alla
temperatura, ma lo sono per quanto riguarda il pH.
All’opposto le alghe di ambienti polari sono sensibili alle
temperature medio-alte e quelle da ambienti termali caldi
alle temperature medio-basse.
• Le alghe da ambienti acidi o iperalini richiedono speciali
terreni di colture, mentre quelle che provengono dai suoli
o da altri ambienti terrestri sono poco sensibili ai fattori
ambientali, ma possono richiedere particolari
micronutrienti.
• Inoltre ci sono particolari requisiti richiesti
da alcune classi di alghe. Le Diatomee
richiedono silicio, le Euglenoidi ammonio,
alcuni generi (es., Chrysochromulina)
necessitano di selenio.
• Le specie mixotrofiche (per esempio alcuni
Dinoflagellati e Crisofite) spesso necessitano
di batteri per poter crescere.
• Il secondo passo necessario per un
isolamento di successo implica
l’eliminazione delle altre specie
presenti.
• Il passo finale consiste nella crescita di
subculture a partire da quella in cui l’organismo
è stato isolato.
• Non è raro che una specie non cresca più dopo
una prima serie di trasferimenti in terreno di
coltura nuovo.
• Questo di solito indica che il mezzo di coltura
manca di qualche sostanza, oppure che durante
la crescita l’alga rilasci nel terreno sostanze che
ne blocchino la crescita.
Metodi di campionamento
• La raccolta del campione è importante per il
successo dell’isolamento. Se nel campione sono
presenti predatori (es. zooplancton) bisognerà stare
attenti alla possibilità che la specie di interesse
scompaia dal campione a causa dei predatori, prima
che si sia fatto in tempo ad isolarla. Una filtrazione
delicata può servire ad allontanare gli invertebrati.
• La filtrazione può anche servire per separare alghe
di dimensioni diverse.
Camere di crescita per isolati
• Le celle climatiche sono molto usate per
incubare le cellule isolate. Qualità ed
intensità della luce sono molto
importanti
• Alcune alghe richiedono cicli luce-buio
e per questo è meglio usare sempre
questi cicli quando non si conoscano le
caratteristiche di un’alga.
Mezzi di coltura
• Come abbiamo visto la selezione del
mezzo di coltura è fondamentale. DI
solito singole cellule preferiscono
mezzi di coltura molto diluiti.
• Poi si possono aggiungere a poco alla volta
nutrienti adizionali per migliorare il tasso di
crescita. Una volta che si sono ottenute
colture dense, si può passare al re-inoculo
su terreni non diluiti.
Colture di arricchimento
• Per isolare con successo un’alga si
può effettuare sul campione raccolto
un pretrattamento usando terreno di
coltura o estratto di suolo per verificare
se questo non favorisca la crescita
dell’organismo di interesse. Questo
passaggio è la cosiddetta coltura di
arricchimento
Isolamento tramite micropipette
• Una volta che è stata ottenuta una coltura con un
numero soddisfacente di cellule dell’organismo da
isolare, si può provare a prelevare una singola
cellula con il sistema della micropipetta.
• Questo sistema prevede l’uso di pipette Pasteur che
vengono preparate secondo la seguente procedura
Estremità della pinzetta
Pipetta pasteur
Fiamma del Bunsen
• Il diametro della micropipetta così
ottenuta dovrebbe essere almeno il
doppio dell’organismo che si vuole
prelevare.
• Se è minore la cellula può essere
danneggiata, se è maggiore si rischia di
prelevare anche altre cellule.
• L’isolamento comincia prelevando con un capillare
una cellula dal campione di partenza.
• La gocciolina sterile contenente la cellula
interessata, insieme ad altre, viene trasferita poi in
un’altra gocciolina che viene esaminata al
microscopio.
• Il processo viene ripetuto tante volte fino a che non
si isola la cellula che vogliamo separare dalle altre.
• Il campione può essere posto in un
qualunque recipiente adatto. Le
goccioline di terreno sterile dovrebbero
esse pronte prima che cominci
l’isolamento. E’ meglio depositare la
gocciolina su agar, per ridurre
l’evaporazione.
• Le gocce possono essere di acqua
dolce o marina, sterili, o di un
appropriato terreno di coltura.
• La pipetta Pasteur deve prima essere
immersa in un punto della soluzione in
cui non c’è la cellula da prelevare e poi
spostata verso la cellula, in modo che
la residua azione capillare consenta un
prelievo delicato della cellula.
• L’operazione viene effettuata al
microscopio ottico invertito.
Microscopio
invertito
Isolamento mediante colture su
agar
• Per molte alghe del suolo o ad
organizzazione coccoide la tecnica
preferita è quella della striscio su agar.
• Se nel campione originario ci sono
funghi, diventa però molto difficile
separarli dalle alghe
• Alcune alghe vivono dentro l’agar. In questo
caso il campione naturale va posto in agar
non solidificato e poi distribuito in capsule
Petri. Bisogna usare Low-melting-point agar
• Le piastre vengono incubate alle condizioni
opportune e si attende fino a che sono visibili
le colonie.
• A quel punto una micropipetta viene immersa
nell’agar per prelevare la colonia interessata,
che poi viene trasferita in un mezzo di coltura
liquido.
Tecnica dello spray cell plate
• Un sottile spray di cellule può essere
usato per inoculare piastre Petri. Lo
spray si forma perché la sospensione
liquida viene spruzzata mediante aria
sterile che disperde le cellule lungo la
superficie della piastra.
Tecnica di isolamento tramite
diluizioni seriali
• La diluizione seriale è una delle più
antiche tecniche usate per isolare
alghe. Lo scopo è diluire una cultura
fino ad ottenere un isolato unicellulare.
• DI solito conviene avere più provette
per ogni punto di diluizione perché in
un caso le cellule possono morire, in
altre ci possono essere più cellule.
• La tecnica non consente di separare
batteri da alghe
Isolamenti tramite gravità e
centrifugazioni
• La separazione di cellule per gravità o
centrifugazione può servire per separare
CLASSI di organismi, sulla base delle loro
dimensioni, ma non singole cellule
Isolamento tramite fototassi
• La fototassia è stata usata per separare
flagellati dominanti in una cultura, che
siano anche forti nuotatori..