carta intestata

VERATOX AFLATOXIN HS (COD. VX 8031)
1. INDICAZIONI
Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di AFLATOSSINE nei cereali.
I campioni risultati positivi con il kit vanno confermati con le metodiche ufficiali.
Ditta produttrice:
Neogen Corporation (U.S.A.)
Preparazione del campione:
estrazione in 70% METANOLO/ACQUA
Tempo richiesto:
Preparazione del campione: 5 min.
Esecuzione del test: 20 min.
N° determinazioni effettuabili:
48
N° di analisi effettuabili:
Dipende da quante volte si utilizza il kit: ogni volta
che si allestisce un test si utilizzano 5 pozzetti per la
curva standard.
Limite di rilevabilità:
0.5 ppb di AFLATOSSINE
Range di quantificazione:
1-8 ppb
Valori di cross-reattività:
AFLATOSSINA
AFLATOSSINA
AFLATOSSINA
AFLATOSSINA
Validità del kit:
9 mesi dalla data di produzione
B1 100 %
B2 18 %
G1 13 %
G2
1%
2. PRINCIPIO DEL METODO
Saggio competitivo diretto su fase solida (ELISA).
Nel kit vengono forniti due set di strip: strip con pozzetti marcati in rosso (mixing wells) e strip
sensibilizzate con anticorpi.
Il campione dopo l’estrazione in metanolo, viene miscelato con il coniugato nei “mixing wells”.
La miscela campione + coniugato viene quindi trasferita nei pozzetti sensibilizzati con gli
anticorpi
anti- AFLATOSSINA.
Lo stesso procedimento viene eseguito per gli standard.
Durante l’incubazione il coniugato AFLATOSSINA-perossidasi compete con la AFLATOSSINA
presente negli standard/campioni per i siti di legame degli anticorpi anti- AFLATOSSINA.
Il coniugato e il materiale che non si è legato ai pozzetti viene allontanato con il lavaggio.
Il complesso coniugato-anticorpo viene evidenziato mediante l’aggiunta del substrato cromogeno
che produce lo sviluppo di una reazione colorata.
Dopo una breve incubazione si aggiunge la soluzione d’arresto e si osserva la colorazione: il
colore blu indica campione negativo, il rosso una forte positività.
Si consiglia la lettura dei risultati al lettore di micropiastre con filtro a 650 nm.
DIESSECHEM s.r.l. via Meucci 61/b 20128 Milano tel. +39 0226305484 fax +39 0226305485
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Capitale Sociale € 10.400,00 C.F./P.IVA/C.C.I.A.A. (Milano) 10978790151 R.E.A. MI-1423409
3. CONTENUTO DEL KIT
Q.TA’
FORMATO
5
1
DESCRIZIONE
Strip da 12 pozzetti separabili, sensibilizzati
con anticorpi
Strip da 12 pozzetti separabili, marcati in
rosso (mixing wells)
Standard AFLATOSSINA 0, 1, 2, 4, 8 ppb
Coniugato AFLATOSSINA –HRP
vial da 1,5 ml
boccetta da 7 ml
tappo giallo
tappo blu
1
TMB substrate cromogeno
boccetta da 24 ml
tappo verde
1
1
Red Stop Solution
Libretto di istruzioni
boccetta da 32 ml
tappo rosso
4
4
busta di alluminio
busta di alluminio
4. MATERIALI NECESSARI NON FORNITI NEL KIT
1. Acqua distillata o deionizzata:
2. Micropipetta da 100 µl. Consigliata:
pipetta multicanale
3. Pipette disposable da 5 ml
4. Spruzzetta da 300 ml
5. Guanti in lattice
6. Supporto per microwell
(da richiedere a Diessechem)
7. Grinder (Dickens Mill, VCM, Glen
disc Mill, Retch Mill o equivalenti)
8. Metanolo ACS grade
9. NaCl grado analitico
10. Agitatore
11. Carta da filtro tipo Whatman n.1 o equivalenti
12.
13.
14.
15.
Cilindro graduato da 250 ml in plastica o vetro
Imbuto in vetro per filtrare i 15 ml di campione
Beaker da 125 ml, Beuta da 500 ml
Bilancia
16. Lettore di micropiastre con filtro a 650 nm
17. Provette da 20 ml in vetro
5. CONSERVAZIONE:
Conservare il kit a 2-4 °C. Non congelare.
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
Il kit, anche dopo aperto, può essere utilizzato fino alla data di scadenza.
Gli estratti dei campioni possono essere conservati a 4°C per 1 settimana, a – di 20 °C fino a
15 giorni.
5. Conservare il substrato al riparo dalla luce.
1.
2.
3.
4.
6. AVVERTENZE
1. I campioni da testare devono avere un pH = 7 (± 1).
2. Aggiustare il pH con NaOH 1N (40 gr NaOH in 1 litro di acqua) e HCl 0.1N (10 mL HCl in 1
3.
4.
5.
6.
7.
8.
litro).
I campioni potrebbero essere contaminati, usare i guanti.
Non usare reagenti provenienti da kit di lotti diversi.
Gli standard contengono AFLATOSSINA: maneggiare con cura, usare i guanti.
Usare pipette, puntali, vetreria pulita fra un campione e l’altro per evitare cross-contaminazioni.
Pulire la vetreria utilizzata, con acqua calda e sapone.
Decontaminare i campioni, gli standard e i puntali immergendoli in Ipoclorito 5% per 30‘
aggiungere 5% di Acetone e quindi eliminare.
7. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Mais, cereali, mangimi in genere:
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1. Prelevare il campione seguendo il metodo ufficiale e macinarlo fino ottenere dei granuli della
2.
3.
4.
5.
6.
7.
misura di circa 20 mesh (i.e caffè solubile).
Mescolare 50 gr. di campione macinato con 250 ml di metanolo/acqua al 70%.
Mescolare vigorosamente per 2 minuti.
Lasciar sedimentare per 2-3 minuti.
Filtrare 15 ml di estratto su carta da filtro tipo Whatman n.1 o equivalente.
Raccogliere il filtrato in una provetta di vetro da 20 ml.
Il campione è pronto per essere analizzato.
In alternativa si può partire da 5 gr. di campione ed estrarli con 25 ml di metanolo 70%.
Tener conto di questa modifica nel calcolo dei risultati.
Spezie (Metodo NON validato):
Per i campioni di spezie si suggerisce la seguente estrazione. Sono allo studio altre modalità di
estrazione.
Per ogni 10 gr di campione aggiungere 1 gr di charcoal attivato in polvere (i.e. “Darco charcoal”).
Miscelare bene e quindi filtrare 2 volte.
Nel caso si notino delle interferenze, è consigliabile diluire il campione (i.e. 1:5 in metanolo
70%).
8. ESECUZIONE DEL SAGGIO
Portare i reagenti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente il contenuto prima dell’uso.
Il substrato è pronto per l’uso. Tenere al buio fino al momento dell’uso.
E’ consigliabile testare i campioni e la curva standard in doppio al fine di evitare errori accidentali
durante il saggio.
1. Prelevare il numero necessario di “mixing well” (pozzetti marcati in rosso) ed un uguale
numero di pozzetti sensibilizzati con anticorpo e posizionarli sul supporto.
2. Pipettare 100 µl di coniugato (enzima - aflatossina) in tutti i “mixing well”.
3. Pipettare 100 µl di campione nel rispettivo “mixing well”.
4. Pipettare 100 µl di standard (control) nel rispettivo “mixing well”.
Per i passaggi successivi è consigliabile l’uso di una pipetta multicanale.
5. Mescolare il contenuto dei “mixing well aspirando e scaricando i reagenti con la micropipetta
(3 volte) facendo attenzione a non contaminare pozzetti adiacenti.
6. Trasferire 100 µl del contenuto dei “mixing well” nei corrispondenti pozzetti sensibilizzati con
anticorpo
Agitare delicatamente la piastra.
7. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
8. Vuotare completamente i pozzetti, riempirli con acqua distillata (o acqua di rubinetto) e
vuotarli immediatamente. Ripetere 5 volte. Per il lavaggio ci si può servire di una spruzzetta.
9. Tamponare la strip su carta assorbente in modo da eliminare le gocce d’acqua.
10. Eliminare i pozzetti marcati in rosso già utilizzati.
11. Pipettare 100 µl di substrato in tutti i pozzetti. Agitare delicatamente la piastra.
12. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
13. Pipettare 100 µl di soluzione d’arresto in tutti i pozzetti.
14. Leggere i risultati al lettore di micropiastre con filtro a 650 nm entro 20 minuti dalla fine del
test.
15. Riportare i dati su una carta logit/log.
Se la lettura viene effettuata con il lettore di micropiastre Anthos mod.2010: impostare il
programma per il calcolo del B/B0 per ottenere direttamente Il valore della concentrazione di
analita nel campione.
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9. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Affinché il test sia valido, il valore di OD dello standard zero deve essere almeno di 0.8 OD.
Calcolare la media delle assorbanze di standard e campioni.
Riportare sulla carta semilogaritmica i valori di assorbanza di ogni standard contro la
concentrazione, tracciare la curva di calibrazione.
La curva standard deve essere lineare nel range 1-8 ppb.
Riportare sulla curva i valori di assorbanza dei campioni ed interpolare la concentrazione
corrispondente.
Seguendo la preparazione del campione descritta, la concentrazione letta dalla curva di
calibrazione corrisponde alla concentrazione di AFLATOSSINA contenuta nel campione.
Nel caso il campione fosse stato ulteriormente diluito, bisogna moltiplicare il valore ottenuto per
il fattore di diluizione.
Il campione risultato positivo con il test Elisa va confermato con le metodiche ufficiali.
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