MTT ASSAY PROTOCOL
1° giorno: SEMINA delle CELLULE
1. tripsinizzare e contare le cellule;
2. diluire propriamente le cellule in terreno di coltura;
3. pipettare le cellule nei pozzetti (100 ml/pozzetto) usando un pipettatore
multicanale (fare attenzione ai volumi pipettati dal pipettatore). Nella colonna 1
e la colonna 12 della piasta vanno pipettati 200 ml di solo terreno e verranno
utilizzati come BIANCHI
2° giorno: TRATTAMENTO
4. diluire il farmaco in modo appropriato in terreno di coltura. Fare una diluizione 2x
rispetto a quella finale voluta, in quanto 100 ml di diluizione saranno aggiunti ai
100 ml già presenti nel pozzetto;
5. aggiungere solo terreno ai pozzetti di controllo (pozzetti delle colonne 2 e 11);
6. aggiungere il farmaco a partire dalla concentrazione più bassa;
3° giorno: TEST MTT
7. aggiungere 50 ml di MTT (2 mg/ml in PBS) ad ogni pozzetto, inclusi quelli di contr
8. tenere le piastre in incubatore per 3 ore;
9. centrifugare le piatre per 10’ a 2000 rpm;
10. rimuovere il terreno di coltura rovesciando le piastre e asciugandole su un foglio
di carta assorbente;
11. aggiungere 120 ml di DMSO ad ogni pozzetto;
12. avvolgere le piastre con alluminio e metterle su un agitatore rotante per 20-30’;
13. leggere le piastre.
OBT
0
1
2,5
5
10
25
50
100
200 nM
0,8817
0,815
0,5588
0,6118
0,4918
0,3928
0,3168
0,1118
0,103
0,9178
0,806
0,6318
0,6258
0,5118
0,3928
0,2658
0,125
0,099
0,9798
0,825
0,6288
0,6858
0,5248
0,3658
0,2288
0,135
0,108
0,9848
0,724
0,7818
0,7028
0,6028
0,4718
0,2998
0,119
0,102
1,011
0,799
0,8288
0,715
0,523
0,401
0,265
0,12
0,1
1,119
0,856
0,9428
0,695
0,561
0,387
0,285
0,123
0,096
media
0,98235
0,804167
0,7288
0,6727
0,535867
0,401867
0,276867
0,1223
0,101333
sd
0,082224
0,044034
0,146229
0,043064
0,039802
0,03627
0,030856
0,007688
0,004082
Fu
1
0,818615
0,741894
0,684786
0,545495
0,409087
0,281841
0,124497
0,103154
Fa
0
0,181385
0,258106
0,315214
0,454505
0,590913
0,718159
0,875503
0,896846
frazione di sopravvivenza
CURVA DOSE-EFFETTO
1.0
0.5
0.0
0.1
1
10
[OBT] (nM)
100
1000
EQUAZIONE DELL’EFFETTO MEDIANO
fa/fu = (D/Dm)m
log(fa/fu) = log D – m log Dm
y = fa/fu = 1
log fa/fu = 0
