Generon
Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO
Cat. # 106005-G
Saggio ELISA per rilevazione di Aflatossina M1
Manuale Utente
Leggere attentamente questo inserto prima di utilizzare il prodotto
Via San Geminiano, 4
41030 San Prospero (MO)- Italy
: +39 059 8637161
: +39 059 7353024
: [email protected]
: www.generon.it
[1]
Manuale utente - Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO - Rev. 1 - 08/03/2017
Indice
INFORMAZIONI GENERALI
Descrizione del prodotto………………………………………….……………....…[3]
Procedura generale………………………………………………………….……....[3]
Contenuto del kit, conservazione e durata……………….……………....…….[3]
Sensibilità (Limite di rilevazione) …………………………………………………...[4]
Specificità (Cross- reattività)…………………………………………....…………..[4]
Materiali richiesti non inclusi nel kit……………………………………………….. [4]
Avvertenze e precauzioni………………………………………………………….. [4]
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Latte……………………………………………………………………………………...[5]
Latte in polvere……………………………………………………………………….. [5]
PROTOCOLLO DEL KIT TEST ELISA PER AFLATOSSINA M1
Preparazione dei reagenti…………………………………………………………..[5]
Protocollo test ELISA………………………………………………………………..…[5]
Calcolo dei risultati……………………………………………………………………[6]
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
Nessuno sviluppo del colore o Nessun segnale con gli standard……………[7]
Bassa lettura della densità ottica (OD)……………………………………………[7]
Elevato rumore di fondo o eccessiva densità ottica (OD)……………………[7]
Alta variabilità Intra-Piastra……………………………………………………….....[8]
Alta variabilità Inter-Piastra…………………………………………………………..[8]
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Manuale utente - Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO - Rev. 1 - 08/03/2017
1 – Informazioni Generali
Descrizione del prodotto
Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO è un saggio competitivo immunoenzimatico per l’analisi quantitativa di
Aflatossina M1 in latte e latte in polvere.
L’Aflatossina M1 è il metabolita idrossilato dell’Aflatossina B1. Le Aflatossine sono ritenute essere tra le principali
sostanze cancerogeniche presenti in natura, capaci di danneggiare il fegato e il DNA. Nel 1987, l’OMS ha
classificato le aflatossine come sostanze cancerogene di Gruppo 1. È noto che l’Aflatossina M1 viene
ossidata dalle ossidasi a funzione mista P450 del fegato. Tale ossidazione genera come prodotto un 8,9epossido, che sembra attaccare preferenzialmente certi residui di guanina nei doppi filamenti di DNA.
L’aflatossicosi è una malattia causata dall’ingestione di aflatossine in alimenti o mangimi contaminati.
Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO consente alle agenzie di controllo governative e internazionali, ai produttori
alimentari nonché agli enti di certificazione della qualità di rilevare aflatossina M1 in latte e latte in polvere e
soddisfare i clienti relativamente alla sicurezza alimentare. Le caratteristiche uniche del kit sono:
Campioni di latte possono essere caricati direttamente nella piastra ELISA
Non è necessario il caricamento della curva standard ma solo del controllo negativo
Alta sensibilità (0.010 ng/g o ppb)
Alta rapidità del saggio (35 minuti)
Procedura Generale
Il metodo è basato su un saggio ELISA competitivo e colorimetrico. L’anticorpo per Aflatossina M1 è assorbito
nei pozzetti della piastra. Durante le analisi, il campione viene aggiunto ai pozzetti per l’incubazione. Dopo il
lavaggio della piastra, l’Aflatossina M1 coniugata con la perossidasi del rafano (Aflatoxin M1-HRP) viene
aggiunta ai pozzetti per l’incubazione. Se un residuo di Aflatossina M1 è presente nel campione, competerà
con l’anticorpo per l’Aflatossina M1, impedendo così alla perossidasi del rafano di legare l’anticorpo
attaccato al pozzetto. L’intensità della colorazione che risulta dopo l’aggiunta del substrato (TMB), ha una
proporzionalità inversa alla concentrazione di Aflatossina M1 nel campione.
Contenuto del kit, conservazione e durata
Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO (96 pozzetti) consente di analizzare fino a 94 campioni in singolo. Riporre sempre
ogni micropozzetto inutilizzato nella bustina e risigillare con il dessiccante incluso nella confezione originale.
Conservare il kit a 2 - 8 °C**. Fare sempre riferimento alla data di scadenza riportata sulla scatola se il kit è
correttamente conservato.
Contenuto del kit
Aflatossina M1 Piastra
Controllo Negativo
Aflatossina M1 - HRP coniugato
20X Wash Solution
Substrato TMB
Stop Buffer
Quantità
12x8 pozzetti
4,5 ml*
12 ml
28 ml
12 ml
14 ml
Conservazione
2 — 8 °C
2 — 8 °C
2 — 8 °C**
2 — 8 °C
2 — 8 °C
2 — 8 °C
* Il volume del Controllo Negativo fornito nel kit consente di caricare fino a 22 pozzetti. Se si necessita di un volume
maggiore è possibile contattare [email protected].
**Se si pensa di non utilizzare il kit per oltre un mese, conservare Aflatossina M1- HRP coniugata in freezer a -20°C.
Se si necessita degli Standards di Aflatossina M1 (BOS106005-Q) è possibile contattare [email protected].
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Manuale utente - Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO - Rev. 1 - 08/03/2017
Sensibilità (Limite di rilevazione)
Latte
10 ppt
Latte in polvere
10 ppt
Specificità (Cross-Reattività)
Aflatossina M1
100%
Aflatossina B1
59%
Aflatossina B2
14%
Aflatossina G1
21%
Aflatossina G2
13%
Materiali richiesti non inclusi nel kit
Lettore di micropiastre (450 nm filtro primario; codice ACC1028)
Pipette da 200 e 1000 microlitri
Pipetta Multi-canale da 50 — 300 microlitri (consigliata in alternativa a pipetta 1000, code ACC1018)
Cilindro, spruzzetta e contenitori da laboratorio
Avvertenze e Precauzioni
Si raccomanda di leggere le seguenti avvertenze e precauzioni per assicurare la completa conoscenza dei
dettagli verso i quali riporre attenzione durante l’utilizzo dei saggi. Ulteriori informazioni possono essere trovate
nella sezione “Risoluzione dei problemi”. Periodicamente, vengono eseguite ottimizzazioni e revisioni al kit e
al manuale: di conseguenza, è importante seguire il protocollo in allegato al kit. Se si necessita di ulteriore
assistenza, è possibile contattare [email protected].
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
GLI ANTICORPI E LE PIASTRE SONO SPECIFICHE PER IL KIT E IL LOTTO. Non mescolare reagenti provenienti da kit
differenti.
Mantenere una temperatura in laboratorio tra i 20 e i 25 °C. Evitare di utilizzare i saggi in prossimità di correnti
d’aria, poiché ciò potrebbe causare un raffreddamento eccessivo, riscaldamento e/o evaporazione. Non
utilizzare i saggi esponendosi direttamente al sole, poiché potrebbe causare un riscaldamento eccessivo ed
evaporazione. Non lavorare su piani di lavoro freddi, eventualmente disporre diversi strati di carta o altri
materiali isolanti sotto le piastre durante l’incubazione.
Assicurarsi di usare solo acqua distillata o deionizzata poiché la qualità dell’acqua è molto importante.
Quando si pipettano i campioni o i reagenti dentro la micropiastra vuota, posizionare il puntale nell’angolo
in basso del pozzetto, a contatto con la plastica.
I tempi di incubazione della piastra devo essere i più precisi possibile. Caricare nella piastra prima il controllo
negativo e poi i campioni facendo attenzione a pipettare volumi corretti.
Stoccare sempre in frigorifero la piastra negli appositi contenitori sigillati con il dessiccante per mantenere
una corretta conservazione. Prima dell’utilizzo del prodotto, per prevenire la formazione di condensa, portare
le piastre a temperatura ambiente (20-25°C) mantenendole nel loro contenitore.
Generon non offre garanzie di nessun tipo, né espresse né implicite, ad eccezione dei materiali di cui i loro
prodotti sono fatti, di qualità standard. Non ci sono garanzie di vendita per questo prodotto, o sull’efficacia
del prodotto per ogni applicazione. Generon non è responsabile per alcun danno, inclusi danni speciali o
conseguenti, o spese direttamente o indirettamente dovute all’uso di questo prodotto.
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2 – Preparazione del campione
Assicurarsi che i campioni siano correttamente conservati. I campioni devono essere refrigerati a 2-4°C per
non più di 1-2 giorni. Congelare i campioni ad un minimo di -20°C se devono essere conservati per un lungo
periodo. I campioni congelati possono essere scongelati a temperatura ambiente (20-25°C) o in frigorifero.
Portare i campioni a temperatura ambiente prima dell’uso.
Latte
In generale, i campioni di latte possono essere direttamente utilizzati per il saggio. Comunque, se si
riscontrasse alto rumore di fondo o un basso recupero, centrifugare il latte per 5-10 minuti a 2000 g scartando
lo strato superiore di grasso e usare il campione rimanente per il saggio.
Nota: Fattore di diluizione = 1
Latte in polvere
Per 1 g di latte in polvere in una provetta, aggiungere 10 mL di acqua distillata. Sciogliere il campione
vortexando. Se si ottiene alto rumore di fondo perché il latte in polvere è particolarmente grasso, centrifugare
per 5-10 minuti a 2000 g, scartando lo strato superiore di grasso e usare il campione rimanente per il saggio.
Nota: Fattore di diluizione = 1 (corrispondenti al latte liquido disciolto).
3 – Test kit ELISA Aflatossine M1 – Protocollo Rap’SOLO
Preparazione dei Reagenti
IMPORTANTE: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso (1 - 2 ore a 20 - 25
°C). Assicurarsi di avere letto la sezione “Avvertenze e Precauzioni”.
Le soluzioni dovrebbero essere preparate subito prima del Test ELISA.
Tutti i reagenti devono essere agitati vigorosamente prima dell’uso. Preparare solo i volumi necessari per il
numero di pozzetti che verranno utilizzati. Non rimettere i reagenti nella provetta/bottiglietta originale. È
raccomandato l’utilizzo di contenitori monouso quando si maneggiano i reagenti per minimizzare il rischio di
contaminazione.
Preparazione di 1X Wash Solution: aggiungere 1 volume di 20X Wash Solution con 19 volumi di acqua distillata.
Protocollo test ELISA
Protocollo validato SOLO su campioni di latte e latte in polvere.
Se si ha in dotazione una pipetta monocanale e si utilizzano più di una strip da 8 pozzetti, caricare sempre il
Controllo Negativo nel primo pozzetto di ogni strip che si vuole utilizzare. Se invece si dispone di una pipetta
multicanale, è possibile caricare il Controllo Negativo solo nel primo pozzetto della prima strip anche se si
utilizzano più di una strip da 8 pozzetti. E’ comunque consigliabile non utilizzare più di 6 strip da 8 pozzetti per
sessione analitica.
1. Aggiungere 200 µL di Controllo Negativo (nel primo pozzetto – vedi sopra).
2. Aggiungere 200 µL di ogni campione nel rispettivo pozzetto (si consiglia di procedere dal secondo
pozzetto della prima strip in avanti). Agitare leggermente la piastra per alcuni secondi.
3. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25°C) senza l’utilizzo di agitatori
automatici.
4. Svuotare la piastra e scartare il liquido. Riempire completamente i pozzetti con una spruzzetta di Wash
Solution 1X e in seguito svuotare la piastra. Ripetere la sequenza fino ad ottenere 3 lavaggi totali.
Dopo l’ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare delicatamente per asciugarla su pezzi
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Manuale utente - Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO - Rev. 1 - 08/03/2017
di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non
permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro.
5. Aggiungere 115 µL di Aflatossina M1-HRP coniugata in ogni pozzetto. Agitare leggermente la piastra
per alcuni secondi.
6. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente (20-25°C) senza l’utilizzo di agitatori
automatici.
7. Svuotare la piastra e scartare il liquido. Riempire completamente i pozzetti con una spruzzetta di Wash
Solution 1X e in seguito svuotare la piastra. Ripetere la sequenza fino ad ottenere 3 lavaggi totali.
Dopo l’ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare delicatamente per asciugarla su pezzi
di carta. Passare al passaggio successivo immediatamente dopo i lavaggi delle piastre. Non
permettere alla piastra di asciugarsi tra le fasi di lavoro.
8. Aggiungere 100 µL di substrato TMB in ogni pozzetto. Agitare leggermente la piastra per alcuni
secondi. Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25°C) senza l’utilizzo di agitatori
automatici. Cronometrare la reazione facendo partire il timer subito dopo l’aggiunta del substrato.
Agitare la soluzione oscillando manulmente la piastra per 1 minuto durante l’incubazione.
Non rimettere il substrato nella confezione originale per evitare potenziali contaminazioni. Se il TMB
nella bottiglietta dovesse mostrare una qualunque colorazione, ciò è indicativo di un deterioramento
e perciò la soluzione deve essere scartata. È consigliato coprire la micropiastra durante l’incubazione
in modo da mantenerla al riparo dalla luce.
9. Dopo l’incubazione, aggiungere 100 µL di Stop Buffer per bloccare la reazione enzimatica. Agitare
leggermente la piastra per alcuni secondi.
10. Leggere le piastre il prima possibile in seguito all’aggiunta dello Stop Buffer con un lettore di
micropiastre a lunghezza d’onda di 450 nm.
Calcolo dei risultati
Per il calcolo dei risultati utilizzare il foglio “GENERON-Aflatoxin M1 ELISA-Rap'SOLO”.
Se si ha a disposizione il lettore ELISA Chromate 4300 (Awareness) è possibile eseguire l’esportazione diretta
dei dati ottenuti nel foglio di calcolo. Dopo aver eseguito la lettura, cliccare sul tasto “export” e selezionare
il foglio GENERON-Aflatoxin M1 ELISA-Rap'SOLO. Cliccare su “apri” per terminare l’esportazione.
Se l’analisi è stata eseguita con pipetta monocanale e nel primo pozzetto di ogni strip è stato caricato il
Controllo Negativo, selezionare il foglio “Monocanale”. Se invece l’analisi è stata eseguita con pipetta
multicanale e il Controllo Negativo è stato caricato solo nel primo pozzetto della prima strip, selezionare il
foglio “Multicanale”.
Inserire manualmente nelle celle arancioni i valori di B/B0 % indicati nel CQ presente all’interno del prodotto.
Tali valori sono da considerarsi validi esclusivamente per lo stesso lotto di prodotto.
In caso non si avesse a disposizione il lettore ELISA Chromate 4300 (Awareness) non è possibile esportare
automaticamente i dati. In tal caso quindi sarà opportuno trascrivere manualmente, oltre ai valori di B/B0%,
anche i valori di OD del (o dei) Controllo/i Negativo/i e dei campioni.
È ora possibile visualizzare i risultati ottenuti nella colonna corrispondente: tali risultati saranno quantificati nel
range 10-270 ppt (ng/ml).
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4 – Risoluzione dei problemi
Nessuno sviluppo del colore o nessun segnale con gli standard
Possibili cause
I reagenti sono stati usati nell’ordine scorretto o
è stato saltato un passaggio.
Sono stati usati anticorpi sbagliati o anticorpi
deteriorati.
Il TMB Substrato è deteriorato.
Azioni raccomandate
Seguire attentamente il protocollo e ripetere il saggio.
Assicurarsi che gli anticorpi utilizzati siano gli stessi inclusi nel kit. Tutti
gli anticorpi sono kit e lotto specifici.
Utilizzare un nuovo set di substrato.
Bassa lettura di Densità Ottica (OD)
Possibili cause
I reagenti erano scaduti o mescolati con un
diverso numero di lotto.
La soluzione di lavaggio NON è stata preparata
correttamente.
Sono stati eseguiti troppi cicli di lavaggio.
I tempi di incubazione sono stati troppo corti.
La temperature del laboratorio era troppo
bassa.
I reagenti e le piastre erano troppo fredde.
La lunghezza d’onda del lettore era sbagliata o
il lettore era malfunzionante.
Il kit ha subito stress termici eccessivi.
Le piastre del saggio erano deteriorate.
Azioni raccomandate
Verificare le date di scadenza e il numero di lotto.
Usare la soluzione di lavaggio per il kit e assicurarsi che sia preparato
correttamente.
Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi indicato nel protocollo.
Cronometrare i tempi separatamente per ogni piastra per
assicurare un accurato tempo d’incubazione. Seguire il protocollo.
Mantenere la temperatura del laboratorio tra i 20 °C e i 25°C. Non
utilizzare i saggi in prossimità di correnti d’ aria.
Assicurarsi che piastre e i reagenti siano portati a temperatura
ambiente. Lasciare i componenti del kit fuori dalla scatola per
minimo 1 ora prima di iniziare il saggio.
Assicurarsi che la lunghezza d’onda sia impostata a 450 nm e
leggere la piastra nuovamente. Verificare la calibrazione del lettore
e l’allineamento della lampada.
Tenere nota di quante volte il kit è stato estratto dal congelatore.
Controllare se il kit è stato lasciato a temperature estreme per lungo
tempo.
Refrigerare sempre le piastre in contenitori chiusi e con dessiccanti
per mantenerle stabili. Prevenire la formazione della condensa
lasciandole equilibrare a temperatura ambiente (20 - 25 °C) mentre
sono nella confezione.
Alto rumore di fondo o alta Densità Ottica (OD)
Possibili cause
Nella soluzione di lavaggio è stata utilizzata
acqua di scarsa qualità.
Il TMB substrato era deteriorato.
Ci sono stati insufficienti lavaggi o scarse
performance di lavaggio.
Lettore era malfunzionante o non leggeva il
bianco correttamente. Ciò è altamente
possibile se le letture delle OD erano alte e il
colore non era intenso.
La temperatura del laboratorio era troppo alta.
I reagenti erano mischiati o preparati
scorrettamente.
[7]
Azioni raccomandate
Se la qualità dell’acqua è dubbia, provare sostituendo con una
fonte alternativa di acqua distillata per preparare la soluzione.
Assicurarsi che il substrato sia incolore prima di essere aggiunto
alla piastra.
Eseguire il numero di lavaggi indicati sul protocollo. Assicurarsi che
almeno 250 µL di Wash Buffer sia stata aggiunta nei pozzetti per il
lavaggio. Verificare le performance del lavapiastre (se
automatico); riparare il sistema se alcuni ugelli gocciolano o
dispensano/aspirano male.
Verificare le performance del lettore usando una piastra
contenente un calibratore e controllando l’allineamento della
lampada. Verificare la procedura di lettura del bianco ed
eventualmente rieseguirne la lettura.
Mantenere la temperatura del laboratorio tra i 20 e i 25 °C. Evitare
l’utilizzo del test nei pressi di fonti di calore o esposizione diretta al
sole.
Assicurarsi che siano stati usati i reagenti corretti, che le soluzioni di
lavoro siano state preparate correttamente e che non si siano
verificate contaminazioni.
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Alta variabilità Intra-piastra
Possibili cause
La pipetta multicanale non funzionava
correttamente.
Non sono stati eseguiti correttamente i lavaggi
o la macchina lavapiastre era malfunzionante.
Sono stati cronometrati male i tempi quando
sono stati aggiunti il controllo negativo, i
reagenti o i campioni alla piastra.
Azioni raccomandate
Verificare la calibrazione delle pipette e controllare che i puntali
siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino
e dispensino egual volumi.
Controllare le performance della macchina lavapiastre.
Controllare i componenti della macchina. Riparare il sistema se
alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male.
Assicurarsi che tutti i materiali siano pronti all’uso. Usare una
pipetta multicanale per aliquotare i reagenti su più pozzetti
quando possibile. Non interrompersi mentre si aggiungono
controllo negativo, reagenti e campioni.
Alta variabilità Inter-piastra
Possibili cause
Tempi di incubazione più corti tra le piastre.
Non sono stati eseguiti correttamente i lavaggi.
La pipetta multicanale non funzionava
correttamente.
Piastre, reagenti, controllo negativo e campioni
erano a temperature diverse.
I reagenti usati erano di lotti differenti o i kit
avevano differente data di scadenza.
[8]
Azioni raccomandate
Cronometrare separatamente ciascuna piastra per essere sicuri di
tempi di incubazione corretti.
Assicurarsi di eseguire il numero di lavaggi indicati nel protocollo.
Controllare i componenti della macchina lavapiastre. Riparare il
sistema se alcuni ugelli gocciolano o dispensano/aspirano male.
Verificare la calibrazione della pipetta e controllare che i puntali
siano ben inseriti. Assicurarsi che tutti i canali delle pipette aspirino
e dispensino egual volumi.
Assicurarsi di portare a temperatura ambiente (20 –25°C) piastre,
reagenti, controllo negativo e campioni. Volumi maggiori
necessitano di più tempo per arrivare a temperatura. Se si usa un
bagnetto per velocizzare il procedimento, assicurarsi che sia
mantenuto a temperatura ambiente; non usare un bagnetto
caldo per scaldare reagenti, campioni e controllo negativo.
Etichettare attentamente ogni reagente per assicurarsi che i
reagenti non vengano mischiati. Kit con diverse date di scadenza
possono generare diversi range di lettura di OD, tuttavia, i valori
delle assorbanze relative possono essere paragonabili. In
generale, un valore di OD dello Standard 0 < 0.6 può indicare un
certo grado di deterioramento dei reagenti.
Manuale utente - Aflatoxin M1-ELISA Rap’SOLO - Rev. 1 - 08/03/2017
