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RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE a cura di Salvatore Accomando Diarree congenite: una nuova classificazione basata sulle recenti evidenze scientifiche Congenital diarrheal disorders: toward a new classification deriving from more recent scientific evidence Vincenza Pezzella1 Giuseppe Castaldo2, 3 Roberto Berni Canani3, 4, 5 (foto) Dipartimento della Donna, del Bambino e Chirurgia Generale e Specialistica, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli; 2 Dipartimento di Medicina Molecolare and Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli; 3 CEINGE Biotecnologie Avanzate, Università di Napoli Federico II, Napoli; 4 Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali, Sezione Pediatria, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli; 5 Laboratorio Europeo per lo Studio delle Malattie Indotte dagli Alimenti, ELFID, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli 1 Key words Chronic diarrhea • Genes • Molecular analysis Abstract Congenital diarrheal disorders (CDDs) represent an evolving group of rare chronic enteropathies with a typical onset early in the life. Severe chronic diarrhea represents the main clinical manifestation, but in some patients diarrhea is only a component of a more complex systemic disease. The number of conditions has gradually increased, and many new genes have been indentified and functionally related to CDDs, opening new diagnostic and therapeutic perspectives. Indirizzo per la corrispondenza Roberto Berni Canani Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali, Sezione Pediatria, Università degli Studi di Napoli, Federico II via Sergio Pansini 5, 80131 Napoli E-mail: [email protected] 172 Introduzione Le diarree congenite (CDD) sono un gruppo di rare enteropatie a eziologia eterogenea ed esordio nei primi giorni di vita. Le forme più severe sono caratterizzate da diarrea cronica con massiva perdita di fluidi a livello intestinale, che richiede spesso una nutrizione parenterale. La diarrea può essere il risultato di un meccanismo secretivo e/o osmotico o infiammatorio. La diarrea secretiva si caratterizza per un aumento delle secrezioni di fluidi nel lume intestinale, come accade spesso nella malattia da inclusioni microvillari (MVID). La diarrea osmotica è causata dalla presenza di nutrienti non assorbiti che richiamano fluidi nel lume intestinale. Un esempio tipico è rappresentato dal malassorbimento di glucosio-galattosio. La forma infiammatoria riconosce una disregolazione del sistema immunitario che conduce a infiltrato infiammatorio e danno della mucosa intestinale, come si osserva nella sindrome legata all’X da immunodisregolazionepoliendocrinopatia-enteropatia (IPEX). Le nuove conoscenze sulla patogenesi suggeriscono l’utilità di un sistema di classificazione basato sul principale meccanismo patogenetico (Fig. 1). Questa classificazione comprende difetti: 1) della digestione e assorbimento di nutrienti ed elettroliti; 2) della struttura enterocitaria; 3) della differenziazione delle cellule enteroendocrine; 4) dell’omeostasi immunitaria intestinale 1. Difetti nella digestione e assorbimento di nutrienti ed elettroliti È il gruppo più numeroso. Non si osservano in genere alterazioni istologiche e ultrastrutturali a livello intestinale. Classici esempi sono il malassorbimento di glucosiogalattosio e la cloridorrea congenita, ma nuove condizioni sono state descritte più recentemente 2, 3 (Tab. I). Diarrea sindromica familiare Riscontrata in 32 membri di una famiglia norvegese e caratterizzata da diarrea cronica a esordio precoce, meteorismo, dolore addominale, dismotilità e IBD (in una Giorn Gastr Epatol Nutr Ped 2016;VII:172-177; doi: 10.19208/2282-2453-138 RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE Diarree congenite: nuova classificazione si nella gestione di questi pazienti con la nutrizione parenterale e il trapianto intestinale hanno ridotto il tasso di mortalità. Figura 1. Classificazione eziopatogenetica delle diarree congenite. parte dei pazienti). Tutti i pazienti mostrano una mutazione missenso in eterozigosi (p.Ser840Ile) del gene GUCY2C, codificante per il recettore della guanilato ciclasi intestinale. La mutazione provoca aumento di cGMP responsabile a sua volta dell’attivazione di protein chinasi GII che fosforilano il canale CFTR con conseguente severa diarrea secretiva cronica 4. Si ipotizza che i diacilgliceroli e acidi grassi non utilizzati per la sintesi dei trigliceridi raggiungono l’intestino e agiscono come composti tossici tramite vie del segnale dei lipidi oppure come detergenti 5. Deficit di DGAT1 Una rara mutazione a carico del gene DGAT1 (codificante per una acyl CoA: diacylglycerol acyltransferasi1) è stata descritta in due neonati con diarrea severa ed enteropatia proteino-disperdente. Questo enzima è importante nelle ultime fasi di sintesi di trigliceridi. Si distinguono per le tipiche caratteristiche istologiche e ultrastrutturali, includono 2 condizioni principali: MVID e l’enteropatia a ciuffi (CTE). La diarrea sindromica, detta anche diarrea fenotipica o syndrome trico-entero-epatica (THE), è comunemente inclusa in questo gruppo (Tab. I). I progres- Difetti della struttura dell'enterocita Malattia da inclusioni microvillari La caratteristica patognomonica è la perdita del brush border apicale e la formazione di inclusioni microvillari intracellulari. La maggior parte dei pazienti con esordio precoce presenta una mutazione inattivante del gene della miosina Vb (MYO5B) 6, che insieme alle GTPasi della famiglia RAB, è responsabile della polarità cellulare, del traffico intracellulare e della crescita dei microvilli. Un’alterazione di questo meccanismo conduce a una riduzione nei processi di assorbimento cellulare. Oltre alla diarrea cronica, i pazienti MVID possono sviluppare colestasi. Il sequenziamento genico di pazienti con MVID con fenotipo clinico più sfumato, ha messo in evidenza un’alterazione nel gene della sintaxina 3 (STX3), responsabile del traffico proteico, fusione vescicolare e polarità cellulare a livello intestinale, epatico, renale e gastrico. Enteropatia a ciuffi I pazienti mostrano le tipiche cellule a ciuffo che possono essere presenti dal duodeno al grosso intestino. La patologia è da correlare a mutazioni a carico del gene delle molecule di adesione cellulare epiteliale (EPCAM). Questi pazienti, in genere, mostrano solo diarrea cronica in assenza di altri sintomi extra-intestinali, a eccezione di una parte di pazienti che sviluppano artrite a esordio tardivo. Un secondo gruppo di pazienti mostra una mutazione in SPINT2, conosciuto anche come inibitore del fattore di crescita epatocitaria. Bambini con la variante SPINT2 presentano una forma sindromica di CTE, caratterizzata da diarrea cronica, cheratite puntata ed atre- 173 V. Pezzella et al. Tabella I. Genetica ed epidemiologia delle principali diarree congenite. Difetti nell’assorbimento e trasporto di nutrienti ed elettroliti Malattia Gene Incidenza e (Numero OMIM) trasmissione Attività biologica alterata e proteine coinvolte Cloridorrea congenita SLC26A3 (126650) AR; comune in Finlandia, Alterata attività dello scambiatore Cl–/HCO3– Polonia, Golfo Persico; poche centinaia di casi in altri gruppi etnici Sodiorrea congenita* SPINT2* (605124) AR; pochi casi descritti Alterata funzione dello scambiatore Na+/H+ a livello digiunale dovuto a una ridotta attività dell’inibitore di serina peptidasi Kunitz tipo 2 Deficit congenito di lattasi LCT (603202) AR; 1:60,000 in Finlandia; poche centinaia di casi in altri gruppi etnici Ridotta attività idrolasica dell’enzima lattasi Deficit saccarasi-isomaltasi SI (609845) AR; 1:5,000; più alta in Groenlandia, Alaska e Canada Ridotta attività dell’enzima saccarasi-isomaltasi Deficit maltasiglucoamilasi MGAM (154360) AR; pochi casi descritti Ridotta attività dell’enzima maltasi-glucoamilasi Malassorbimento glucosiogalattosio SLC5A1 (182380) AR, poche centinaia di casi descritti Alterato assorbimento di sodio-glucosio Sindrome di Fanconi-Bickel SLC2A2 (138160) AR, poche centinaia di casi descritti Alterata attività di un trasportatote di glucosio a livello epatico, pancreatico ed enterocitario Acrodermatite enteropatica SLC39A4 (607059) AR; 1:500.000 Alterata attività del trasportatore di Zn2+ Intolleranza alle proteine con lisinuria SLC7A7 (603593) AR; poche centinaia di casi descritti Alterato trasporto di amminoacidi Diarrea da acidi biliari primari SLC10A2 (601295) AR, pochi casi descritti Ridotto riassorbimento enteroepatico di acidi biliari Deficit di enterochinasi TMPRSS15 (606635) AR, pochi casi descritti Alterata attivazione di tripsinogeno da parte di una serina proteasi transmembrana Abetalipoproteinemia MTTP (157147) AR; 150 casi descritti Alterata attività trasferasica di trigliceridi microsomiali, sintesi più bassa di VLDL e ridotto assorbimento di lipidi Ipobetalipoproteinemia Apo B (107730) Autosomica codominante 1:1,000–1:3,000 Alterata struttura e attività di apolipoproteinaB e conseguente ridotto assorbimento di lipidi Malattia da accumulo di chilomicroni SAR1B (607690) AR, 40 casi descritti Alterato trasporto di chilomicroni a livello enterocitario dovuto all’alterata attività di piccole GTPase Diarrea sindromica familiare GUCY2C (601330) AR, una famiglia descritta Aumentata attività di guanil ciclasi 2C aumenta i livelli di cGMP, iperattivandoCFTR intestinale Diarrea associata a mutazione di DGAT1 DGAT1 (604900) AR, una famiglia Ashkenazi descritta Alterata attività della diacilglicerolo aciltrasferasi 1; effetti sconosciuti *Analisi del brush border intestinale dei pazienti affetti ha rivelato che la condizione è causata da un difetto funzionale in uno degli scambiatori Na+/H+ localizzati sulla membrana apicale delle cellule epiteliali del piccolo intestino. Nessuna mutazione è stata riscontrata a carico dei geni codificanti per uno degli scambiatori Na+/H+ identificati fino a oggi segue tab. I (NHE1,NHE2,NHE3, and NHE5). 174 RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE Diarree congenite: nuova classificazione Continua tab. I Difetti nella struttura degli enterociti Malattia Gene (Numero OMIM) Incidenza e trasmissione Attività biologica alterata e proteine coinvolte Malattia da inclusioni microvillari MYO5B (606540) AR; rara; frequenza più alta tra i Navajo Ridotta attività della miosina 5B causa un anomalo riciclo di endosomi STX3 (600876) AR; 2 pazienti descritti Alterata attività di sintassina 3, coinvolta nella fusione apicale delle vescicole alla membrana EPCAM (185535) AR; 1:50-100.000; più alta tra gli Arabici Difetto nell’attività delle molecole di adesione epiteliale SPINT2 (605124) 12 pazienti descritti Alterata attività dell’inibitore della serina peptidasi Kunitz Tipo 2, coinvolto nella rigenerazione cellulare TTC37 (614589) AR; pochi casi descritti Alterata sintesi o localizzazione di trasportatori di membrana dovuto a una ridotta attività di TTC37 SKIV2L (600478) AR; pochi casi descritti Meccanismo non conosciuto dovuto all’alterata attività dell’elicasi SKIV2L Enteropatia congenita a ciuffi* Sindrome Tricoepatoenterica (Diarrea sindromica) * L’enteropatia congenita a ciuffi associata a mutazioni di EPCAM è caratterizzata solo dall’interessamento intestinale, mentre mutazioni in SPINT2 conducono a una forma sindromica con capelli lanugginosi, basso peso alla nascita, deficit immunitari e diarrea con alta concentrazione di sodio nelle feci. Difetti nella differenziazione delle cellule enteroendocrine Malattia Gene (Numero OMIM) Incidenza e trasmissione Attività biologica alterata e proteine coinvolte Anendocrinosi enterica NEUROG3 (604882) AR, pochi casi descritti Neurogenina-3 alterata, regola lo sviluppo delle cellule epiteliali intestinali in cellule endocrine Lissencefalia X-linked e MR ARX (300382) X-linked, pochi casi descritti Attività alterata del fattore di trascrizione ARX, che regola lo sviluppo delle cellule enteroendocrine Deficit di proproteina convertasi 1/3 PCSK1 (162150) AR, pochi casi descritti Attività ridotta della proproteina convertasi 1/3 coinvolta nella attivazione di pro-ormoni prodotti dalle cellule enteroendocrine Sindrome di Mitchell-Riley RFX6 (612659) AR, pochi casi descritti Ridotta attività del fattore regolatore X6 coinvolto nella morfogenesi e sviluppo del pancreas segue tab. I sia delle coane, insieme ad altre anomalie più rare 7. Sindrome trico-entero-epatica Questi pazienti si caratterizzano per diarrea cronica, dismorfismi facciali e anomalie dei capelli, che possono associarsi o meno ad altri segni e sintomi, come il ritardo di crescita intrauterino, immunodeficienze, anomalie cutanee, pa- tologia epatica, difetti cardiaci e anomalie delle piastrine. Il quadro istologico varia da una moderata a severa atrofia dei villi con infiltrazione incostante di cellule mononucleate. È causata nel 60% dei casi da una mutazione in TTC37 e nel 40% dei casi da una mutazione in SKIV2L. Entrambi i geni fanno parte del sistema di sorveglianza della produzione di mRNA 8. Difetti nella differenziazione delle cellule enteroendocrine La caratteristica principale di queste condizioni è un’anomalia dello sviluppo o della funzione delle cellule enteroendocrine, che si può manifestare con diarrea osmotica cronica, associata o meno ad altre anomalie endocrine sistemiche (Tab. I). 175 V. Pezzella et al. Continua tab. I Difetti nell’omeostasi dell’immunità intestinale Malattia Gene (Numero OMIM) Incidenza e trasmissione Attività biologica alterata e proteine coinvolte Sindrome IPEX FOXP3 (300292) X-linked, poche centinaia di casi descritti Alterata attività di FOXP3 coinvolto nello sviluppo delle cellule TREG CD4+CD25+ Sindromi IPEX-like CD25 (147730) AR Alterata sintesi delle catene del recettore per IL-2 sulle cellule TREG STAT5b (604260) AR Alterata attività di STAT5b coinvolto nel segnale di IL-2 delle cellule TREG STAT-1 (600555) AD, perdita/guadagno di funzione Alterata attività di STAT-1 causa la riprogrammazione delle cellule TREG in cellule TH1-like ITCH (606409) AR (una famiglia) Alterata attività di ITCHY E3 ubiquitina ligasi implicata nello sviluppo delle cellule TREG LRBA (606453) AR, 3 famiglie descritte Alterata attività di LRBA, coinvolto nell’apoptosi delle cellule TREG IL-10 (124092 AR Alterato IL-10 o subunità del suo recettore coinvolti nel controllo della risposta intestinale agli stimoli microbici Enteropatia a esordio precoce con coliti IL-10R 146933 IL-10R 123889 Anendocrinosi enterica Bambini con deficit di neurogenina 3 presentano scarse cellule enteroendocrine e sviluppano diabete mellito insulino dipendente nel corso dell’infanzia, in assenza di altre anomalie endocrine 9. Sindrome di Mitchell–Riley Mutazioni in omozigosi di RFX6 sono associate ad atresia duodenale, anomalie biliari, diabete mellito neonatale e malassorbimento. RFX6 è una proteina legante il DNA ed è fondamentale per lo sviluppo e la funzione delle cellule enteroendocrine, senza intaccarne il numero 10. Mutazioni nel gene ARX A trasmissione X-linked, è caratterizzata da ritardo mentale, epilessia, lissencefalia, anomalie dei genitali e in alcuni casi diarrea congenita 1. Più del 50% dei pa- 176 zienti con perdita di funzione del gene ARX ha espansioni di polialanina che potrebbe essere responsabile dell’elevata variabilità dei segni neurologici e intestinali 1. Difetti nell'omeostasi dell'immunità intestinale Una diarrea cronica severa ad esordio precoce può derivare anche da mutazioni a carico dei geni codificanti proteine che hanno un importante ruolo della regolazione della risposta immunitaria intestinale. La diarrea può derivare da tre meccanismi principali: risposta immunitaria alterata contro gli agenti patogeni, infiammazione o assenza di regolazione immunitaria. Le enteropatie a base autoimmune si riconoscono nei pazienti che mancano di mecca- nismi specifici di regolazione immunitaria, responsabili dell’aggressione tissutale incontrollata (Tab. I). IPEX È il prototipo di questo gruppo. È dovuta a una mutazione nel gene FOXP3, fondamentale fattore di trascrizione per la funzione delle cellule timiche T-regolatorie (TREG) 1. Queste cellule sono in grado di controllare le funzioni indesiderate delle cellule T effettrici. Le mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene e determinano perdita di funzione. Il quadro clinico severo già nei primi giorni di vita, fa supporre che il danno intestinale inizi durante la vita fetale, indipendentemente da fattori esterni, come la nutrizione e il microbioma intestinale. Utili nella diagnosi sono gli anticorpi antiarmonina 1, una proteina espres- RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE Diarree congenite: nuova classificazione sa a livello delle cellule epiteliali. Diversi pazienti con la syndrome IPEX sono stati trattati con un trapianto di cellule staminali emopoietiche 1, ma questo approccio è limitato dalla disponibilità di donatori HLA-compatibili. Sindromi IPEX-like Queste condizioni sono associate a mutazioni in geni responsabili della funzione di mantenimento, segnale ed espansione delle cellule TREG 1. La diagnosi può essere agevolata dal dosaggio della percentuale di specifiche regioni TREG metilate del gene FOXP3 (TSDR) nel sangue periferico. Mutazioni in STAT5B, responsabili dell’attivazione del segnale dell’IL-2 dal CD25 a FOXP3, sono state descritte in associazione a un numero ridotto di cellule TREG 1. Bambini con questa mutazione presentano altri sintomi oltre quelli intestinali, come ritardo di crescita e patologia polmonare interstiziale. Una condizione IPEXlike (caratterizzata da diarrea) con un profondo deficit delle cellule TREG, ma normale gene FOXP3, è stata associata a una mutazione non-senso nel gene LRBA (fattore responsivo ai lipopolisaccaridi) 1. Questi pazienti hanno immunodeficienza comune variabile e alterazioni dell’autoimmunità 1. Deficit di IL-10 o IL10R Caratterizzate da enterocoliti con lesioni ulcerative in regione peria- nale e a livello della mucosa intestinale 1. Fistole e ascessi possono essere presenti, richiendo multipli interventi chirurgici. Diversi farmaci anti-infiammatori sono stati usati con efficacia limitata. Il trapianto di cellule staminali emopoietiche è stato usato con successo 1. Conclusioni Negli ultimi anni, molti progressi sono stati fatti sulla comprensione della patogenesi di queste condizioni 1. La diagnosi molecolare ha ulteriormente cambiato lo scenario delle CDD, aprendo la strada a nuove strategie terapeutiche come il trapianto di cellule staminali emopoietiche 1 e la terapia genica con endo-nucleasi, inclusi TALENs o CRISPR/Cas9 1. Studi a lungo termine sono necessari per fornire altre informazioni riguardo la prognosi di queste condizioni. Bibliografia 1 Berni Canani R, Castaldo G, Bacchetta R, et al. Congenital diarrhoeal disorders: advances in this evolving web of inherited enteropathies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2015;12:293-302. Berni Canani R, Terrin G, Cardillo G, et al. Congenital diarrheal disorders: improved understanding of gene defects is leading to advances in intestinal physiology and clinical management. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2010;50:360-6. 2 Terrin G, Tomaiuolo R, Passariello A, et al. Congenital diarrheal disorders: an updated diagnostic approach. Int J Mol Sci 2012;13:4168-85. 3 Fiskerstrand T, Arshad N, Haukanes BI, et al. Familial diarrhea syndrome caused by an activating GUCY2C mutation. N Engl J Med 2012;366:1586-95. 4 Haas JT, Winter HS, Lim E, et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. J Clin Invest 2012;122:4680-4. 5 Ruemmele FM, Müller T, Schiefermeier N, et al. Loss-of-function of MYO5B is the main cause of microvillus inclusion disease: 15 novel mutations and a CaCo-2 RNAi cell model. Hum Mutat 2010;31:544-51. 6 Salomon J, Goulet O, Canioni D, et al. Genetic characterization of congenital tufting enteropathy: epcam associated phenotype and involvement of SPINT2 in the syndromic form. Hum Genet 2014;133:299-310. 7 Fabre A, Martinez-Vinson C, Roquelaure B, et al. Novel mutations in TTC37 associated with trichohepato-enteric syndrome. Hum Mutat 2011;32:277-81. 8 Wang J, Cortina G, Wu SV, et al. Mutant neurogenin-3 in congenital malabsorptive diarrhea. N Engl J Med 2006;355:270-80. 9 Suzuki K, Harada N, Yamane S, et al. Transcriptional regulatory factor X6 (Rfx6) increases gastric inhibitory polypeptide (GIP) expression in enteroendocrine K-cells and is involved in GIP hypersecretion in high fat dietinduced obesity. J Biol Chem 2013;288:1929-38. 10 • Le diarree congenite (CDD) sono un gruppo di rare e severe enteropatie con tipico esordio nei primi giorni di vita. • All’interno delle CDD possiamo distinguere: I. Difetti nell’assorbimento e trasporto di nutrienti ed elettroliti; II. Difetti nella struttura dell’enterocita; III. Difetti nella differenziazione delle cellule enteroendocrine; IV. Difetti dell’omeostasi immunitaria intestinale. • Il numero di condizioni incluse nel gruppo delle CDD sta progressivamente aumentando, molti nuovi geni sono stati identificati e correlati funzionalmente a queste patologie. • La diagnostica molecolare sta acquistando un ruolo sempre più importante e oggi consente di ricorrere a efficienti procedure di sequenziamento genico esteso a costi ragionevoli. 177
