BREVI NOTE Influenza del mezzo di sospensione sulla stabilità del virus aftoso a diverse temperature li virus dell'afta epizootica è considerato un agente infettivo resistente in na tura sia agli agenti fisici, sia a quelli chimici. Quando invece esso venga ottenuto in laboratorio s u colture di tessuto non sembra sia altrettanto resistente. BACIIRACH et al. 1 hanno constatato che il virus aftoso, sospeso in normale teneno di mantenimento a pH 7,5, conserva il s uo potere infettant-e: per 18 settimane alla temperatura di 4°(', t>er ll giorni a 20°(' e per 21 ore a 37°C. Queste osservazioni sono state sot!tanzialmente confermate tia 0RFEf, D'A MORE & MAZZARACCHIO 2 • FELLOWJo~S 3 ha compiuto delle ricerche sulla resistenza dell'attività infettante del virus aftoso tipo A (ceppo 119) sia coltivato su cellule renali di vitello, sia proveniente da epitelio linguale di bovino e diluito in vari terreni di mantenimento contenenti degli additivi. Egli, a diverse temperature, ha potuto osservare che sia la virus-coltura che il vims-epitelio mantenuti a - 50°C, conservano il titolo iniziale durante un anno di osservazione; gli additivi aggiunti al terreno di mantenimento per la conservazione del virus hanno un effetto minimo o nullo sulla resistenza del virus eccet.to per il virus-epitelio conservato a + 4°C con il 50 °~ là sie ro bovino. Anche SEGU HA & DE\liOltGl• ha nno Raggiato diverse sostanze protettive allo scopo di prolungare la conservazione del vint>< aftoso. Soluzioni di saccarosio al 15 o~, di gelatina all' l 0 0 , di siero di cavallo a l lO 0 0 , di pulivinilpirrolidone all' l ,5 °~ non sembrano avere alcuna azione sulla conservazione del virus per 12 mesi a - l60 - 18° C: al contra1·io l'albumina bovina crista llizzata, frazione V, permette di mantenere titoli infettanti più elevati. A vendo ottenuto, nel corso di nostri esperimenti sulla puriticazione dei tre tipi di vims aftoso, risultati alquanto discordanti sulla conservazione del virus stesso, ;~bbiarno ritenuto opportuno studiare nuovamen te questo problema usando , come me"truo di sospensione , liquidi diversi, mantenuti a temperature differenti. .llateriali e metotli. - Per le nostre prove ci siamo serviti del virus aftoso tipo • O~. ceppo Cremona (gentilmente fornitoci dal Prof. L·bertini, Direttore dell' Istituto Zooprofilattico della Lombardia ed Emilia, Brescia) al 10° passaggio su celJule renali eli embrione di suino. Il virus venne fatto sviluppare in monostrati di cellule renali eli embrione di suino in bottiglie di Kolle; clopo :!-4 giorni t!all' inocultmt celJulare, CJUa ndo il monostrato era <·ompleto, il terreno tli crescita (terreno di Hanks6, contenente 10 % di siero tli vitello e 0,5 °~ di idrolisato di lattalburnina) era t·imof!so e le cellule venivano inoculate con 2 mi di virus diluito l : IO. Dopo incubazione a 370 C' per 60', venivano aggiunti 15 mi di soluzione salina bilanciata di Earle secon do quanto riportato da LÉPINE 8 con 0,5 oi> di idrolisato di lattalbumina, quindi le bot.tiglie erano poste nuovamente ati inc ubare a :no (.; per l!l ore. Il liquido eli coltura veniva. prelevato dopo distruzione delle cellule e centrifugato a 300 g.p.m. pe1· IO'. Il ~ opranatante veniva f!iluito l : l O e si allestivano vari 11forks : l) virus l : l O in terreno . luu . / s i . .'iiiJ!tr. Sauilri ( I!Hlfi) 2 . 41 - l:L 42 E~ I' F. RI EIX ZE E RI CF. R CII E ti i Earle: 2) viru~ l : l O in teneno <li Enrle <·on ilO", di ><iei'O di coniglio; 3) viru~< l : I O in t-erreno di Earle con 30 °-0 ùi a lbume d 'uovo: 4) viru~ l : IO in latte Rcre ma to (previament e sterilizzato a ll/i° C per 10 minuti). Il pH tl ei vari st,orks venne aggius tato a p H 7,4 e<·t·etto ehe per lo stof'k in latte. il cui pH era di fi,8. I divers i stocks vennero poi distribuiti in fiale di vetro da 2 mi e Raldate alla fia mma. C'ampioni ùi ciascuna prepar azione furono posti : a t-e mpera.tum ambiente (22°(' rirra); a + 4°C; a - zooc ; a - 70o('_ l diversi campioni furono Ila!-(· g ia.ti dopo l :l-30-HO giorn i e dopo 4-fi-12 mesi. Al momento dell 'apertura della fiala veniva <·ontrollato il re la t-i vo pH. Le medie dei valori dell'at tività infettante ottenuti nei diversi periodi <li t empo ed a lle di verf!e temperature !\ono 1:1tate ca lrolah• con il metodo di HE1-:n & 1\t UE:'-iC II 7 e !!ono riporta te nello Figf:!- l e 2. A- il f ~rrpno d t EariP StPrO al SO~o m terre-no d1 Eo rci? o- - -o torre- + -· + Fig. l. albumP al 10% in fprrt-no dt E or/p ' o l --"'!"L--.-- - '·--'i"' 15 30 'l'itoln infettante clel 'L' ir·u s aftoso tipo • O • conservato a temperatura ambiente. Tempo in cui è stata saggia ta l 'attività infettante del virus riportato in ascissa. :Media dei valori dell 'attività infettant e 1determinata usando diluizioni Rl'alari 11 base l O e inocula ndo 4 tti'bi -roltura per ogni diluizione (0,1 ml )J riportnta in ordinata. 60 qiorni Hisultati f' co11clusù111 i. - Dai risultati ot tenuti ai Jmt) notare co me il virus aftot'O <·olti vaf-n in vitro su cellule renali di embrione suino aia po<"o stabile a te mperatura ambien te. Infatti a questa te mperatura il virus è comple tament.e inattivato dopo );; giorni se man tenuto in terreno di Earle semplice o con aggiunta <li siero a l 50 °0 odi albume al 30 ~~; è inattivato in 50-60 giomi se mantenuto in latte scremato (Fig. l ). Anche a lla temperatura ùi + 4°(' l'impiego del latte scremato come consen·ativo ha •-A t~r~no di Ear(f · --- - SJPro ~tso•;. ,n t~rrPno d1 E•rlf - ·- +--+ f•lft atb umr atJo •;."' ffrrf no d1 E•rll l•'ig. 2. - J 'itolo i nfettante del virus aftoso tipo «O* l'Oli Ber· vato a + 4° <;. (Com e in Fig. 1). 15 15 50 9iorni 6mtsi .-1 1111. 1.•1. 811/11'1'. Sm11'lù (l!lllH ) 2. H -4:1. MAZZOTTI E ORFEI 43 dato i migliori risultati : infatti per c.irca sei mesi il t itolo infettante del vims è diminuito solamente di circa l log, mentre il titolo del virus mantenuto in terreno di Earle, con o senza siero al 50 % o con albume al 30 °~ , ò diminuito notevolmente (circa 3 log) ùopo 50 giorni (Fig. 2). Alle temperature di - 20°C e - 70°C il virus si ~J comportato a llo stesso moùo indipendentemente dalla temperatura e dal mezzo ùi sospensione : i titoli degli stocks del virus sospeso in terreno di Earle con o senza siero al 50 % sono diminuiti di circa una unità logaritmica entro i primi 50 giorni e successivamente si sono stabilizzati ; mentre i titoli infettanti del virus sospeso in latte ed in albume al 30 % in Eal'le, sono diminuiti di circa mezza unità logat·itmica entro i primi 25-50 giorni, mantenendosi poi stabili durante il successivo periodo di osservazione ùi circa. un anno. Il latte scremato si ò dimostrato quindi il mezzo più conveniente per la conservazione llel virus aftoso, particolarmente a lle temperature ambiente e + 4° C. 11 ottobre 1965. MIRELLA MAZZOTTI e ZEt' FIRINO 0RFEI [;aboralori di Jlicrobiologia e Laboratori tH l'eleri11aric' BACHRACH, H.L., S.S. BREES.F., J.J. CALLIS, \V .R. HE>~S & R .E. PATTY, Prnc. Ho<J. EJptl. Bwl. ~led., 95, 147 (1957). 1 0 RF'EI, Z., A. D' AMORE & V. MAZZARACCHIO. Rend. ! st. 8t,per. Sanità, 20, 893. ( 195S). a FELLOWES, O.N., Am . .!. Vet . Res., 23, 1035 (1962). ' SEGURA, M. & E. DEGIORGI, Rev. Invest. Ganaderas. 16, 59 (1964). ~ HANKS, J.H. & R.E. WALLACE, Proc. Soc. E.r,ptl. Bio!. ,lfed., 71 , 196 (1949). 8 LÉPINE, P., Tech11iq·ues de laboratoire tm virologie humaine. ~fasson et C., Paris 1964, p. 130. • 1 REED, L.J. & H. MuENCII, . l m. . .7. ll yg., 17, 493 (I 938). l · ''"'· /Hl. Super. Sanità ( 19Gil) 2. 41·1:!. Prove in favore di una mappa continua in Streptomyces I marca.tori genetici dello Streptomy~s coelicolor A3 (2) sono stati localizzati in due gmppi di linkage 1, che segregano indipendentemente entro i cloni eterozigoti 1 • La lunghezza dei due gruppi di linkage, in unità di ricombinazione, è stata portata 3 a circa 60 e 70 unità, con la mappatura di qualche nuovo marcatore ad ambedue le estreruità dei due gruppi. Tuttavia non è stata ancora portata alcuna prova di linkage tra marcatori su gruppi differenti. Alcuni dati sono però stati recentemente presentati da HoPwooo • che mostrano che il tipo di selezione applicato ai marcatori del gruppo I ha un forte effetto sulla selezione dei marcatori non selezionati del Il gruppo. Ciò è stato interpretato come una indicazione di linkage tra i due gruppi. I dati riportati (Tab. l, sinistra) non giustificano tuttavia tale conclusione, essendo soltanto indicativi di una indeterminata correlazione tra il comportamento genetico dei marcatori nei due gruppi. L 'uso dei marcatori mappati recentemente (pro-l e cys-18) ed esterni ai vecchi marcatori 3 , non spiega l'effetto riportato, in primo luogo perchè non è stato dimo· strato che i nuovi marcatori sian o linked ai marcatori del gruppo opposto, in secondo luogo, perchè risultati molto simili possono essere ottenuti anche con i marca.tori pre· cedentemente mappa ti (Tab. l, destra). In vero, dalla Tab. l, i cui valori rappresentano TABELLA l. Correlazioni tra le frequenze degli alleli di differenti gruppi di • Unkage • In accoppiamento • Incrocio l •• pro-l arg-1 + cys- 18 ura-1 + + Alleli selezionati (Gruppo l ) pro + arg+ pro+ arg+ + Alleli In aocupplo.mento non eclezlonatl (GrupPO Il ) (frequenze t•er cento) oys+ ura.+ l 34 34 86 49 17 83 str-1 ura-1 + + + II I II Gruppi di linkage: I l + leu- 1 arg-1 Incrocio 2: Alleli In aecopplarncnto non eclezlonatl (GrupJ>() Il ) (freQuenze per cento) uro.+ str+ ... Alleli selezionati (Gruppo l) l leu + (arg- ) (leu-) arg+ leu + arg+ Il 18 63 14 22 61 ' Per l procedimenti tecnici cd l Plmboll rlcl mnrcatorl. Ycdcrc • Sono consldcruti soltanto alcuni lod. • • Dati rlclo.boratl, da •. ••• 0 11 alleli In repulsione sono dntl trn po.rcnl.(lsl. 1 Aun. 181. ltn·orl llr<'<'Cd!'nti t , 3• 5• S l i/IU . Sanità ( 19GG) 2. H · 4G. ll l 'l l l l 45 SERMONTI le frequenze percentuali della rkombinazione genetica, si può vedere che queste non superano mai il 50 °·0 , quando si seleziona un singolo marcatore, come ci si attendere bbe in caso di semplice linkage. Il Unkage solo non può quindi spiegare l'eccesso di combinazioni parentali che si osserva quando ò applicata una doppia selezione, l 'effetto cumulativo di due non·linkage non potendo essere in alcun modo un linkage. Con ogni probabilità va chiamata in causa l'incompletezza degli zigoti 2•6 • Un difetto di alleli non -selezionati in accoppiamento con quelli selezionati, può simulare un linkage negativo tra di essi, mentre un eccesso ùi questi simula la presenza dellinkage. Le ' correlazioni~ riportate possono quindi spiegarsi supponendo che i ricombinanti selezionati ~u differenti mezzi selettivi risultino ùa differenti tipi di zigoti difettivi. In effetti, la presenza in uno zigote di un marcatore rende più probabile la presenza di un altro marcatore, non Unked al primo, nello stesso zigote. Ciò è stato dimo8trato dall'ana lisi di un certo numero di cloni eterozigoti (eterocloni) raccolti come ciuffetti emergenti dal micelio basale di culture miste. La cultura mista è fatta crescere per circa un giorno su dischi di cellofan distesi sul terreno completo e trasferiti quindi su terreno selettivo contenente streptomicina, dove i cloni eterozigoti possono e mergere in circa due giorni 6 • Questi cloni possono essere analizzati completamente 2 (Tab. 2) TABELLA 2. Frequenza di eteroclonl contenenti talunl marcatorl non selezlonattl • Isolati su terreni selettlvl diversi. Inc rocio : st.r-1 phe-1 + + met-2 + + nra-l acr-3 + II <:ruppo di linkage : l • T c rl'l·ni Rcictti,·i AIle li selczionuU ()B1 -t ) •• p er la, preson t.a : Etcroclonl c ontene nti alleli non ' oiczlonatl In accoppiamento con quelli selezionati (Frcqnf'nzc o/o) phc .,. STR, PHE, URA STR, MET, URA STR, U RA me t r phe + met t p be + I l lU'U- l ac r - l Totale etc rocloni • ngglat l m et + 1.2 27 50 (100) (100) (100) 85 100 54 100 8 (100) rn • ) l l l 26 l :l 18 l pr·occdlmcnti tecnici sono d escritti in d ettaglio altrove •. • ~ono consld oriLtc soltlllltc alc une mutazioni e le sost~Lnze rela tive. •• L o sostanze aggiunte nl terreno minimo (MM) solct.tivo sono infiiciLte con gli stessi simboli u Rnt.l per le mutazioni corris ponde nti, in lctt<·•·e mninAColc. oppure esaminati solo riguardo alla presenza in essi tli alcuni marcatori 6 • Nell'incrocio della Tah. 2, il 50 % degli eterocloni selezionati in assenza di met ionina (met+ sempre presente, str+ assente) non contengono ac·r -. Se è forzata anche la presenza di phe+, acr- non ò mai mancante, benchè phe+ non sia legato ad acr- . Egualmente, la presenza di ura- è portata dall'85 °;', al 100 ° 0 come conseguenza della selezione ùel marcato re (non linkefl) met+. Appare quindi una reciproca influenza tra ùne gruppi, per quanto riguarda il loro contributo di geni agli zigoti . . lttn. /st. Super. S awilà (1!166 ) 2, H ·HI. 4G ESPERIENZE E RICERC II E A questo punto si può di nuovo avan zare l'ipotesi che i due gruppi di linkagr siano, benchè non lin ked tra loro, realmente p ortati da una singola struttura continua (un • cromosoma • o nn • genoforo ~). e che siano uniti da regioni • vuote~ . cioè da segmenti che non comprendono geni conosciuti. Am mettiamo c he i cinque marcato ri nell 'incrocio della Tah. 2 sia no uniti come seguP : + + ura acr + str ph c + + m et e che il contributo agli zigoti da parte di ciascun gen itore sia continuo. Ogni zigote che porti sia pile+ che met+ deve p ortare anche gli a lleli ura- ed acr- localizzati in mezzo ad essi (una continuità lungo un altro arco di una possibile struttura circolare è imped ita dall 'assenza forzata dell'allele str+ negli zigoti ). La Tab. 2 mostra che questo f- quanto si verifica. La ma nca nza di indipendenza tra i gruppi di tinkage osservata nell 'analisi selettiva (Tab. l) ò così spiegata s ulla base di una con tinuità strutturale nel contributi genetico di ciascun geni tore agli zigoti e sul presupposto che i due g ruppi di linkage sia no legati a formare una mappa continua (e molto probabilmente circolare). Tale dipendenza può essere fortemente influenzata da diversi fattori come : la polarità sessuale, l'origine e l'orientamento nel trasferimento del cromosoma, l'ampiezza del contributo genetico di ciascun genitore agli zigoti, e coRì via (secondo il modello di coniugazioni' dell 'Escherichia coli 1). I due gruppi sembran o essere connessi in modo tale che ura· l nel g ruppo Il sta di fron te a acr·3 (o a Jn·o. J, linketl a quest 'ultimo) nel> gruppo I. Una seconda connes· sione tra gli estremi opposti dei due g ruppi, a completamento del circolo 4 è> suggerita da alcuni da ti (Tab. l) ma ancora da dimostrare. 8 novembre 1965. GIUSE PPE SERMONTI J,a.bnratori rli Chimica Binlngira e Unit•ersità di Ca111erino 1 D.A., Ami. N . r. Acarl. Sci., 81 , 887 (1959) D .A. & G. SERMONTI, Advan. Genet., 11 , 273 (1962). HOPWOOD, D.A., (Jeu et . R es., 6 , 248 (1965). HOPWOOD, D .A., .1 . .Mol. Biol., 12, 514 (1965). SERliiONTI , G. , & D .A. H OPW OOD, in : 1'he Bacteria, Acaùemic· Press, New Yo1k 1964, Vol. V, p. 223. SEn MONTI, G., M. BANDIERA & l. SPADA·SERMONTI, .'1 , Bacterio!. , 90, 384 (1966). W OLLMAN, E .L., F. JACOR & ""· H A n:~. Cnld 8JJring HarfJor l'?ymp. Quant. Bio/., 21 , 1-IOP WOOD, ~ H OPWOOD, 3 ' 6 6 1 14 1 ( 1!lnfi). A1111. /81• .<iupu. Sm1ilà (1 966) 2, H · fG . L'emoglobina di anfibi. IV .. Comportamento cromatografico ed elettroforetico della ossiemoglobina di Rana esculenta L. 1 In alcuni lavori preeedenti •. 2 scmo riportati alcuni dati Stùlo studio della struttura della emoglobina ùi Rana esculenta L. Questa emoproteina si è dimostrata eterogenea e per studiarla i> stato necessario separare i suoi componenti omogenei. Usando la ciano -meta-emoglobina (HiCN) di rana è stato possibile separare in fase analitica e preparativa tre componenti principali mediante tecniche elettroforetiche e cromatografiche. Poichè, tuttavia, il derivato ciano-meta della emoglobina non può essere utilizzato per stud i di tipo funzionale, si è reso successivamente necessario preparare la emoglobina di Rana esculenta L. eri i suoi componenti omogenei nella forma di os~iemoglobina (Hb0 2). L'Hb0 2 eli rana è particolarmente labile, ma può essere protetta dalla autossidazione e quindi conservata in ottime condizioni per periodi di tempo piuttosto lunghi quando venga sciolta in un tampone contenente il sale sodico tlell'acido etilen-diammino-tetraacetico (EDTA). Scopo della presente nota è quello di riferire alcune osservazioni sul comportamento cromatografico ed elettroforetico della Hb0 2 di Rmw escultmla L. Jlateriale e metodi. - La preparazione degli emolisati dalle emazie di individui 111aschi adulti clelia specie Ranct esculenta L., la separazione della emoglobina dalle proteine non contenenti eme presenti nell 'emolisato e gli esperimenti di elet.troforeRi :m gel di amido sono stati eseguiti sec•oJHlo le modalità descritte in un precedente lan>ro 2 • Tuttavia i tamponi fosfati 0,01 )1, pH 6,6 e 0,2 M, pH 7,8, usati nella fase l't·omatografica della purificazione con tenevano E DTA in una roncen trazione (l · l o-• M) e non lo 0,1 0/ 00 di KC'N. Gli esperimenti di cromatografia ~;ono stati eseguiti in un apparecchio Spectroehmm Spinco Beckman Mod. 130; è stata usata CM-cellulosa in colonne di cm l X fiO in fase analitica e di c m 2 x 50 in fase preparativa. Per l'eluizione è stato impiegato un gradiente continuo a forma convessa del p H del tampone ottenuto con un sistema a due bottiglie; il tampone iniziale era un tampone fosfati 0,01 M, pH 6,6, il tampone limitante, anche esso fosfati 0,03 M, pH 8,0; ambedue i tamponi contenevano EDTA nella C'oncentrazione l · 10-' M. l l l Risultati e discussione. - U n tipico esempio di separazione ottenuta. sottopone ndo l'Hb0 2 di rana a cromatografia su colonne di CM-cellulosa è rappresentata nella Fig. l. ~elle <·ondizioni sperimentali descritte questa emoproteina viene risolta in due componenti con differente mobilità C'romatografica: esperimenti di ricromatografia hanno dimostrato che ciascuno dei co mponenti si co mporta come una specie molecolare omogenea. L'elettroforesi su gel di a mido della H b0 1 non frazionata e dei suoi due co mponenti sep!U'ati mediante cromatografia (Fig. 2.-\) ba dimostrato che il comportamento elettrofo•·etico della emoproteina studiat a è perfettamente analogo al comportamento rromatografi('o. Poic·hi> precerlentemente era stato dimostrato che .-11111 . Tsl. Super. 8anil<ì ( 1966) 2. 47-•9 . 4R ESPE RI ENZE E RICERCHE o.o., J pH 1,0 0,90,8 0,7 0,6 À ~ \ ~ 0,5 0,1 r----._ 1 \ 0,4 '""'- \ ' \ 0.2 ., 0,3 ' '"- ' ... ~l 0,5 0,3 0,2 0,4 0,6 6 0,7 0,8 0,1 0,9 9 o 10 1,0 o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 '''"'"'"""''''''''lll!"' '' ''""'''""'""''"ll"'''"''!tll''"' " "''"' '' ''''''""'l!'''" '"''l!""""''' n• f razione Pig. l. -· Curva di eluizione della HbO. di Rana e~cule11ta da colonna di cm l x 50 di CM-cellulosa equilibrata con tampone fo sfati pH 6,8, 0,01 l\1 + EDTA 1 0~ l\1. Eluizionecongradieute di tampone fosfati 0,03 M da p H 6,6 a p H 8,0. Flusso 12 mlfh. Ascisse: numero progressivo delle frazioni di 2 mi (10 ' ). Ordinate: D.O. (densità ottira); l ) ll 5 IDfL, percorso ottieu 2,5 m m; 2) 540 mfL, percorso ottico l O m m; 3) 540 ITifL, percorso ottico 2,5 mm; p H; ì.. (conducibilità elettrica in mhos). + 2 t l + i 2 l + 2 c A B Fig. 2. - - Elettroforesi su gel di amido: (A ) della Hb0 2 non frazionata (3) e del primo (2) e secondo (l ) componente da el!8a separa ti mediante nomatografia. su CM-cellulosa; (R) della HiCJ\ (l ) e della Hb0 2 (2) ; (C) del secondo componen te della Hb0 2 isolato mtdiant.e · cromatografia su Cì\l-cdlulosa, dopo essere stat.o trasformato in HiCN (l) e come tale (2) (Sistema discon tinuo di tamponi tris-borato pH 8,il) . i l An11 . 181. Stt1Jer. Sa11iltì (1966) 2, 47 -49 . 49 TENTORI, VIVALDI, CARTA E SALVATI la HiCN di rana viene risolta in tre componenti mediante cromatografia su CM-cellulosa ed in tre componenti principali e due minori mediante elettroforesi su gel di amido, sono state eseguite esperienze di elettroforesi su gel di amido in parallelo con HiCN ed HbO~ preparate dalla emoglobina proveniente dallo stesso pool di emazie di rana (Fig. 2B); i rislùtati ottenuti hanno confermato esattamente quelli dei precedenti esperimenti. Allo scopo di identificare la corrispondenza fra i due componenti elettroforetici della Hb0 1 ed i tre componenti principali in cui viene risolta la HiCN, sono state finalmente eseguite esperienze di elettroforesi su gel di amido con i due componenti della Hb0 1 separati cromatograficamente, sia usandoli come tali che dopo averli trasformati in 1-IiCN (Fig. 2C). I risultati ottenuti hanno dimostrato che il componente più lento della Hb01 dopo essere stato trasformato in HiCN corrisponde come comportamento elettroforetico ai due componenti più lenti della HiCN nei quali appunto viene risolto. SU.MMARY- The oxyhemoglobin of Rana esculenta L ., although very labile, can be preserved for severa! months if dissolved in buffer containing l · 1()-4 M EDTA. ~'i·~g oxyhemoglobin ha.s been resolved into two different homogeneous components by CM-cellulose chromatography as well as by sta.rch-gel electrophoresis. In a previous paper the resolution of tbe cyano-meta-derivative of tbe same bemoglobin into three components by CM-cellulose chromatography and flve components by starch-gel electropboresis has been described. The second component of frog Hb0 1 has proved to correspond with tbe second and third chromatografic components of J{iCN. 18 febbraio 1966. LEONARDO TE:STORI, GEROLAMO VIVALDI, CARTA e ANNA M . Laboràtori di Biologia SALVATORE • l TENTORI, 2 L., G. VIVALDI, S. CARTA 25 , 990 (1962). TENTORI, L., G. VIVALDI, SALVATI & A. M. SALVATI, Rend. 1st. Super. Sanità, S. CARTA, A. M. SALVATI, M. SORCINI & S. VELANI, Arch. BiochMn. Biophy... ;- 109, 404 (1965). A nn. /st. S uper. Sanil<ì (1966) 2, U -49 .