Influenza del mezzo di sospensione sulla stabilità del virus aftoso a

BREVI NOTE
Influenza del mezzo di sospensione sulla stabilità
del virus aftoso a diverse temperature
li virus dell'afta epizootica è considerato un agente infettivo resistente in na tura sia agli agenti fisici, sia a quelli chimici. Quando invece esso venga ottenuto in
laboratorio s u colture di tessuto non sembra sia altrettanto resistente. BACIIRACH et al. 1
hanno constatato che il virus aftoso, sospeso in normale teneno di mantenimento a
pH 7,5, conserva il s uo potere infettant-e: per 18 settimane alla temperatura di 4°(',
t>er ll giorni a 20°(' e per 21 ore a 37°C. Queste osservazioni sono state sot!tanzialmente confermate tia 0RFEf, D'A MORE & MAZZARACCHIO 2 • FELLOWJo~S 3 ha compiuto
delle ricerche sulla resistenza dell'attività infettante del virus aftoso tipo A (ceppo
119) sia coltivato su cellule renali di vitello, sia proveniente da epitelio linguale di
bovino e diluito in vari terreni di mantenimento contenenti degli additivi. Egli, a diverse temperature, ha potuto osservare che sia la virus-coltura che il vims-epitelio
mantenuti a - 50°C, conservano il titolo iniziale durante un anno di osservazione;
gli additivi aggiunti al terreno di mantenimento per la conservazione del virus hanno
un effetto minimo o nullo sulla resistenza del virus eccet.to per il virus-epitelio conservato a + 4°C con il 50 °~ là sie ro bovino. Anche SEGU HA & DE\liOltGl• ha nno Raggiato diverse sostanze protettive allo scopo di prolungare la conservazione del vint><
aftoso. Soluzioni di saccarosio al 15 o~, di gelatina all' l 0 0 , di siero di cavallo a l lO 0 0 ,
di pulivinilpirrolidone all' l ,5 °~ non sembrano avere alcuna azione sulla conservazione del virus per 12 mesi a - l60 - 18° C: al contra1·io l'albumina bovina crista llizzata,
frazione V, permette di mantenere titoli infettanti più elevati.
A vendo ottenuto, nel corso di nostri esperimenti sulla puriticazione dei tre tipi
di vims aftoso, risultati alquanto discordanti sulla conservazione del virus stesso,
;~bbiarno ritenuto opportuno studiare nuovamen te questo problema usando , come me"truo di sospensione , liquidi diversi, mantenuti a temperature differenti.
.llateriali e metotli. - Per le nostre prove ci siamo serviti del virus aftoso tipo
• O~. ceppo Cremona (gentilmente fornitoci dal Prof. L·bertini, Direttore dell' Istituto
Zooprofilattico della Lombardia ed Emilia, Brescia) al 10° passaggio su celJule renali
eli embrione di suino. Il virus venne fatto sviluppare in monostrati di cellule renali
eli embrione di suino in bottiglie di Kolle; clopo :!-4 giorni t!all' inocultmt celJulare,
CJUa ndo il monostrato era <·ompleto, il terreno tli crescita (terreno di Hanks6, contenente 10 % di siero tli vitello e 0,5 °~ di idrolisato di lattalburnina) era t·imof!so e le
cellule venivano inoculate con 2 mi di virus diluito l : IO. Dopo incubazione a 370 C'
per 60', venivano aggiunti 15 mi di soluzione salina bilanciata di Earle secon do quanto
riportato da LÉPINE 8 con 0,5 oi> di idrolisato di lattalbumina, quindi le bot.tiglie
erano poste nuovamente ati inc ubare a :no (.; per l!l ore. Il liquido eli coltura veniva. prelevato dopo distruzione delle cellule e centrifugato a 300 g.p.m. pe1· IO'. Il
~ opranatante veniva f!iluito l : l O e si allestivano vari 11forks : l) virus l : l O in terreno
. luu . / s i . .'iiiJ!tr. Sauilri ( I!Hlfi) 2 . 41 - l:L
42
E~ I' F. RI EIX ZE
E RI CF. R CII E
ti i Earle: 2) viru~ l : l O in teneno <li Enrle <·on ilO", di ><iei'O di coniglio; 3) viru~< l : I O
in t-erreno di Earle con 30 °-0 ùi a lbume d 'uovo: 4) viru~ l : IO in latte Rcre ma to (previament e sterilizzato a ll/i° C per 10 minuti).
Il pH tl ei vari st,orks venne aggius tato a p H 7,4 e<·t·etto ehe per lo stof'k in latte.
il cui pH era di fi,8. I divers i stocks vennero poi distribuiti in fiale di vetro da 2 mi e
Raldate alla fia mma. C'ampioni ùi ciascuna prepar azione furono posti : a t-e mpera.tum
ambiente (22°(' rirra); a + 4°C; a - zooc ; a - 70o('_ l diversi campioni furono Ila!-(·
g ia.ti dopo l :l-30-HO giorn i e dopo 4-fi-12 mesi. Al momento dell 'apertura della fiala
veniva <·ontrollato il re la t-i vo pH. Le medie dei valori dell'at tività infettante ottenuti
nei diversi periodi <li t empo ed a lle di verf!e temperature !\ono 1:1tate ca lrolah• con il
metodo di HE1-:n & 1\t UE:'-iC II 7 e !!ono riporta te nello Figf:!- l e 2.
A-
il
f ~rrpno d t EariP
StPrO al SO~o m terre-no d1
Eo rci?
o- - -o torre-
+ -· +
Fig. l.
albumP al 10% in fprrt-no dt E or/p
'
o l --"'!"L--.-- - '·--'i"'
15
30
'l'itoln infettante clel 'L' ir·u s aftoso
tipo • O • conservato a temperatura
ambiente. Tempo in cui è stata
saggia ta l 'attività infettante del
virus riportato in ascissa. :Media
dei valori dell 'attività infettant e
1determinata usando diluizioni
Rl'alari 11 base l O e inocula ndo 4
tti'bi -roltura per ogni diluizione
(0,1 ml )J riportnta in ordinata.
60 qiorni
Hisultati f' co11clusù111 i. - Dai risultati ot tenuti ai Jmt) notare co me il virus aftot'O
<·olti vaf-n in vitro su cellule renali di embrione suino aia po<"o stabile a te mperatura
ambien te. Infatti a questa te mperatura il virus è comple tament.e inattivato dopo );;
giorni se man tenuto in terreno di Earle semplice o con aggiunta <li siero a l 50 °0 odi
albume al 30 ~~; è inattivato in 50-60 giomi se mantenuto in latte scremato (Fig. l ).
Anche a lla temperatura ùi + 4°(' l'impiego del latte scremato come consen·ativo ha
•-A
t~r~no di Ear(f
· --- - SJPro ~tso•;. ,n t~rrPno d1 E•rlf
-
·-
+--+
f•lft
atb umr atJo •;."' ffrrf no d1 E•rll
l•'ig. 2. - J 'itolo i nfettante
del virus aftoso
tipo «O* l'Oli Ber·
vato a + 4° <;.
(Com e in Fig. 1).
15 15
50 9iorni
6mtsi
.-1 1111.
1.•1. 811/11'1'. Sm11'lù (l!lllH ) 2. H -4:1.
MAZZOTTI
E
ORFEI
43
dato i migliori risultati : infatti per c.irca sei mesi il t itolo infettante del vims è diminuito solamente di circa l log, mentre il titolo del virus mantenuto in terreno di
Earle, con o senza siero al 50 % o con albume al 30 °~ , ò diminuito notevolmente
(circa 3 log) ùopo 50 giorni (Fig. 2).
Alle temperature di - 20°C e - 70°C il virus si ~J comportato a llo stesso moùo indipendentemente dalla temperatura e dal mezzo ùi sospensione : i titoli degli stocks
del virus sospeso in terreno di Earle con o senza siero al 50 % sono diminuiti di circa
una unità logaritmica entro i primi 50 giorni e successivamente si sono stabilizzati ;
mentre i titoli infettanti del virus sospeso in latte ed in albume al 30 % in Eal'le, sono
diminuiti di circa mezza unità logat·itmica entro i primi 25-50 giorni, mantenendosi
poi stabili durante il successivo periodo di osservazione ùi circa. un anno. Il latte
scremato si ò dimostrato quindi il mezzo più conveniente per la conservazione llel
virus aftoso, particolarmente a lle temperature ambiente e + 4° C.
11 ottobre 1965.
MIRELLA MAZZOTTI e ZEt' FIRINO 0RFEI
[;aboralori di Jlicrobiologia e Laboratori tH l'eleri11aric'
BACHRACH, H.L., S.S. BREES.F., J.J. CALLIS, \V .R. HE>~S & R .E. PATTY, Prnc. Ho<J.
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l
· ''"'· /Hl. Super. Sanità ( 19Gil) 2. 41·1:!.
Prove in favore di una mappa continua in Streptomyces
I marca.tori genetici dello Streptomy~s coelicolor A3 (2) sono stati localizzati in
due gmppi di linkage 1, che segregano indipendentemente entro i cloni eterozigoti 1 •
La lunghezza dei due gruppi di linkage, in unità di ricombinazione, è stata portata 3 a
circa 60 e 70 unità, con la mappatura di qualche nuovo marcatore ad ambedue le
estreruità dei due gruppi. Tuttavia non è stata ancora portata alcuna prova di linkage
tra marcatori su gruppi differenti. Alcuni dati sono però stati recentemente presentati
da HoPwooo • che mostrano che il tipo di selezione applicato ai marcatori del
gruppo I ha un forte effetto sulla selezione dei marcatori non selezionati del Il
gruppo. Ciò è stato interpretato come una indicazione di linkage tra i due gruppi.
I dati riportati (Tab. l, sinistra) non giustificano tuttavia tale conclusione, essendo
soltanto indicativi di una indeterminata correlazione tra il comportamento genetico
dei marcatori nei due gruppi.
L 'uso dei marcatori mappati recentemente (pro-l e cys-18) ed esterni ai vecchi
marcatori 3 , non spiega l'effetto riportato, in primo luogo perchè non è stato dimo·
strato che i nuovi marcatori sian o linked ai marcatori del gruppo opposto, in secondo
luogo, perchè risultati molto simili possono essere ottenuti anche con i marca.tori pre·
cedentemente mappa ti (Tab. l, destra). In vero, dalla Tab. l, i cui valori rappresentano
TABELLA
l.
Correlazioni tra le frequenze degli alleli di differenti gruppi
di • Unkage • In accoppiamento •
Incrocio l ••
pro-l arg-1
+
cys- 18 ura-1
+
+
Alleli
selezionati
(Gruppo l )
pro +
arg+
pro+ arg+
+
Alleli In aocupplo.mento
non eclezlonatl
(GrupPO Il )
(frequenze t•er cento)
oys+
ura.+
l
34
34
86
49
17
83
str-1 ura-1
+
+
+
II
I
II
Gruppi di linkage: I
l
+
leu- 1 arg-1
Incrocio 2:
Alleli In aecopplarncnto
non eclezlonatl
(GrupJ>() Il )
(freQuenze per cento)
uro.+
str+
...
Alleli
selezionati
(Gruppo l)
l
leu + (arg- )
(leu-) arg+
leu + arg+
Il
18
63
14
22
61
'
Per l procedimenti tecnici cd l Plmboll rlcl mnrcatorl. Ycdcrc
• Sono consldcruti soltanto alcuni lod.
• • Dati rlclo.boratl, da •.
••• 0 11 alleli In repulsione sono dntl trn po.rcnl.(lsl.
1
Aun. 181.
ltn·orl llr<'<'Cd!'nti t , 3• 5•
S l i/IU .
Sanità ( 19GG) 2. H · 4G.
ll
l
'l
l
l
l
45
SERMONTI
le frequenze percentuali della rkombinazione genetica, si può vedere che queste non
superano mai il 50 °·0 , quando si seleziona un singolo marcatore, come ci si attendere bbe
in caso di semplice linkage. Il Unkage solo non può quindi spiegare l'eccesso di combinazioni parentali che si osserva quando ò applicata una doppia selezione, l 'effetto
cumulativo di due non·linkage non potendo essere in alcun modo un linkage. Con ogni
probabilità va chiamata in causa l'incompletezza degli zigoti 2•6 • Un difetto di alleli
non -selezionati in accoppiamento con quelli selezionati, può simulare un linkage negativo tra di essi, mentre un eccesso ùi questi simula la presenza dellinkage. Le ' correlazioni~ riportate possono quindi spiegarsi supponendo che i ricombinanti selezionati
~u differenti mezzi selettivi risultino ùa differenti tipi di zigoti difettivi.
In effetti, la presenza in uno zigote di un marcatore rende più probabile la presenza di un altro marcatore, non Unked al primo, nello stesso zigote. Ciò è stato dimo8trato dall'ana lisi di un certo numero di cloni eterozigoti (eterocloni) raccolti come ciuffetti emergenti dal micelio basale di culture miste. La cultura mista è fatta crescere
per circa un giorno su dischi di cellofan distesi sul terreno completo e trasferiti quindi
su terreno selettivo contenente streptomicina, dove i cloni eterozigoti possono e mergere in circa due giorni 6 • Questi cloni possono essere analizzati completamente 2 (Tab. 2)
TABELLA
2.
Frequenza di eteroclonl contenenti talunl marcatorl non selezlonattl •
Isolati su terreni selettlvl diversi.
Inc rocio :
st.r-1
phe-1
+
+
met-2
+
+
nra-l
acr-3
+
II
<:ruppo di linkage :
l
•
T c rl'l·ni Rcictti,·i
AIle li selczionuU
()B1 -t ) ••
p er la, preson t.a
:
Etcroclonl c ontene nti alleli
non ' oiczlonatl In accoppiamento
con quelli selezionati
(Frcqnf'nzc o/o)
phc .,.
STR, PHE, URA
STR, MET, URA
STR, U RA
me t
r
phe +
met t p be +
I
l
lU'U-
l
ac r -
l
Totale
etc rocloni
• ngglat l
m et +
1.2
27
50
(100)
(100)
(100)
85
100
54
100
8
(100)
rn • )
l
l
l
26
l :l
18
l pr·occdlmcnti tecnici sono d escritti in d ettaglio altrove •.
• ~ono consld oriLtc soltlllltc alc une mutazioni e le sost~Lnze rela tive.
•• L o sostanze aggiunte nl terreno minimo (MM) solct.tivo sono infiiciLte con gli stessi simboli
u Rnt.l per le mutazioni corris ponde nti, in lctt<·•·e mninAColc.
oppure esaminati solo riguardo alla presenza in essi tli alcuni marcatori 6 • Nell'incrocio della Tah. 2, il 50 % degli eterocloni selezionati in assenza di met ionina
(met+ sempre presente, str+ assente) non contengono ac·r -. Se è forzata anche la
presenza di phe+, acr- non ò mai mancante, benchè phe+ non sia legato ad acr- .
Egualmente, la presenza di ura- è portata dall'85 °;', al 100 ° 0 come conseguenza della
selezione ùel marcato re (non linkefl) met+. Appare quindi una reciproca influenza tra
ùne gruppi, per quanto riguarda il loro contributo di geni agli zigoti .
. lttn. /st. Super. S awilà (1!166 ) 2, H ·HI.
4G
ESPERIENZE E RICERC II E
A questo punto si può di nuovo avan zare l'ipotesi che i due gruppi di linkagr
siano, benchè non lin ked tra loro, realmente p ortati da una singola struttura continua
(un • cromosoma • o nn • genoforo ~). e che siano uniti da regioni • vuote~ . cioè da
segmenti che non comprendono geni conosciuti. Am mettiamo c he i cinque marcato ri
nell 'incrocio della Tah. 2 sia no uniti come seguP :
+
+
ura
acr
+
str
ph c
+
+
m et
e che il contributo agli zigoti da parte di ciascun gen itore sia continuo. Ogni zigote
che porti sia pile+ che met+ deve p ortare anche gli a lleli ura- ed acr- localizzati in
mezzo ad essi (una continuità lungo un altro arco di una possibile struttura circolare
è imped ita dall 'assenza forzata dell'allele str+ negli zigoti ). La Tab. 2 mostra che
questo f- quanto si verifica.
La ma nca nza di indipendenza tra i gruppi di tinkage osservata nell 'analisi selettiva
(Tab. l) ò così spiegata s ulla base di una con tinuità strutturale nel contributi genetico
di ciascun geni tore agli zigoti e sul presupposto che i due g ruppi di linkage sia no
legati a formare una mappa continua (e molto probabilmente circolare). Tale dipendenza può essere fortemente influenzata da diversi fattori come : la polarità sessuale,
l'origine e l'orientamento nel trasferimento del cromosoma, l'ampiezza del contributo
genetico di ciascun genitore agli zigoti, e coRì via (secondo il modello di coniugazioni'
dell 'Escherichia coli 1).
I due gruppi sembran o essere connessi in modo tale che ura· l nel g ruppo Il sta
di fron te a acr·3 (o a Jn·o. J, linketl a quest 'ultimo) nel> gruppo I. Una seconda connes·
sione tra gli estremi opposti dei due g ruppi, a completamento del circolo 4 è> suggerita
da alcuni da ti (Tab. l) ma ancora da dimostrare.
8 novembre 1965.
GIUSE PPE SERMONTI
J,a.bnratori rli Chimica Binlngira e Unit•ersità di Ca111erino
1
D.A., Ami. N . r. Acarl. Sci., 81 , 887 (1959)
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3
'
6
6
1
14 1 ( 1!lnfi).
A1111. /81• .<iupu. Sm1ilà (1 966) 2, H · fG .
L'emoglobina di anfibi. IV .. Comportamento cromatografico
ed elettroforetico della ossiemoglobina
di Rana esculenta L.
1
In alcuni lavori preeedenti •. 2 scmo riportati alcuni dati Stùlo studio della struttura della emoglobina ùi Rana esculenta L. Questa emoproteina si è dimostrata eterogenea e per studiarla i> stato necessario separare i suoi componenti omogenei. Usando
la ciano -meta-emoglobina (HiCN) di rana è stato possibile separare in fase analitica
e preparativa tre componenti principali mediante tecniche elettroforetiche e cromatografiche. Poichè, tuttavia, il derivato ciano-meta della emoglobina non può essere
utilizzato per stud i di tipo funzionale, si è reso successivamente necessario preparare
la emoglobina di Rana esculenta L. eri i suoi componenti omogenei nella forma di
os~iemoglobina (Hb0 2). L'Hb0 2 eli rana è particolarmente labile, ma può essere protetta dalla autossidazione e quindi conservata in ottime condizioni per periodi di
tempo piuttosto lunghi quando venga sciolta in un tampone contenente il sale sodico
tlell'acido etilen-diammino-tetraacetico (EDTA). Scopo della presente nota è quello di
riferire alcune osservazioni sul comportamento cromatografico ed elettroforetico della
Hb0 2 di Rmw escultmla L.
Jlateriale e metodi. - La preparazione degli emolisati dalle emazie di individui
111aschi adulti clelia specie Ranct esculenta L., la separazione della emoglobina dalle
proteine non contenenti eme presenti nell 'emolisato e gli esperimenti di elet.troforeRi
:m gel di amido sono stati eseguiti sec•oJHlo le modalità descritte in un precedente lan>ro 2 • Tuttavia i tamponi fosfati 0,01 )1, pH 6,6 e 0,2 M, pH 7,8, usati nella fase
l't·omatografica della purificazione con tenevano E DTA in una roncen trazione (l · l o-• M)
e non lo 0,1 0/ 00 di KC'N.
Gli esperimenti di cromatografia ~;ono stati eseguiti in un apparecchio Spectroehmm Spinco Beckman Mod. 130; è stata usata CM-cellulosa in colonne di cm l X fiO
in fase analitica e di c m 2 x 50 in fase preparativa. Per l'eluizione è stato impiegato
un gradiente continuo a forma convessa del p H del tampone ottenuto con un sistema
a due bottiglie; il tampone iniziale era un tampone fosfati 0,01 M, pH 6,6, il tampone
limitante, anche esso fosfati 0,03 M, pH 8,0; ambedue i tamponi contenevano EDTA
nella C'oncentrazione l · 10-' M.
l
l
l
Risultati e discussione. - U n tipico esempio di separazione ottenuta. sottopone ndo l'Hb0 2 di rana a cromatografia su colonne di CM-cellulosa è rappresentata
nella Fig. l. ~elle <·ondizioni sperimentali descritte questa emoproteina viene risolta
in due componenti con differente mobilità C'romatografica: esperimenti di ricromatografia hanno dimostrato che ciascuno dei co mponenti si co mporta come una specie
molecolare omogenea. L'elettroforesi su gel di a mido della H b0 1 non frazionata e dei
suoi due co mponenti sep!U'ati mediante cromatografia (Fig. 2.-\) ba dimostrato che il
comportamento elettrofo•·etico della emoproteina studiat a è perfettamente analogo
al comportamento rromatografi('o. Poic·hi> precerlentemente era stato dimostrato che
.-11111 . Tsl. Super. 8anil<ì ( 1966)
2.
47-•9 .
4R
ESPE RI ENZE E RICERCHE
o.o.,
J
pH
1,0
0,90,8
0,7
0,6
À
~
\
~
0,5
0,1
r----._ 1
\
0,4
'""'-
\
'
\
0.2
.,
0,3
' '"-
' ...
~l
0,5
0,3
0,2
0,4
0,6
6
0,7
0,8
0,1
0,9
9
o
10
1,0
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
'''"'"'"""''''''''lll!"' '' ''""'''""'""''"ll"'''"''!tll''"' " "''"' '' ''''''""'l!'''" '"''l!""""'''
n• f razione
Pig. l. -· Curva di eluizione della HbO. di Rana e~cule11ta da colonna
di cm l x 50 di CM-cellulosa equilibrata con tampone fo sfati pH 6,8, 0,01 l\1 + EDTA 1 0~ l\1. Eluizionecongradieute
di tampone fosfati 0,03 M da p H 6,6 a p H 8,0. Flusso 12 mlfh.
Ascisse: numero progressivo delle frazioni di 2 mi (10 ' ).
Ordinate: D.O. (densità ottira); l ) ll 5 IDfL, percorso ottieu
2,5 m m; 2) 540 mfL, percorso ottico l O m m; 3) 540 ITifL, percorso ottico 2,5 mm; p H; ì.. (conducibilità elettrica in mhos).
+
2
t
l
+
i
2
l
+
2
c
A
B
Fig. 2. - - Elettroforesi su gel di amido: (A ) della Hb0 2 non frazionata
(3) e del primo (2) e secondo (l ) componente da el!8a separa ti
mediante nomatografia. su CM-cellulosa; (R) della HiCJ\
(l ) e della Hb0 2 (2) ; (C) del secondo componen te della Hb0 2
isolato mtdiant.e · cromatografia su Cì\l-cdlulosa, dopo essere
stat.o trasformato in HiCN (l) e come tale (2) (Sistema discon tinuo di tamponi tris-borato pH 8,il) .
i
l
An11 . 181. Stt1Jer. Sa11iltì (1966) 2, 47 -49 .
49
TENTORI, VIVALDI, CARTA E SALVATI
la HiCN di rana viene risolta in tre componenti mediante cromatografia su CM-cellulosa ed in tre componenti principali e due minori mediante elettroforesi su gel di
amido, sono state eseguite esperienze di elettroforesi su gel di amido in parallelo con
HiCN ed HbO~ preparate dalla emoglobina proveniente dallo stesso pool di emazie
di rana (Fig. 2B); i rislùtati ottenuti hanno confermato esattamente quelli dei precedenti esperimenti. Allo scopo di identificare la corrispondenza fra i due componenti
elettroforetici della Hb0 1 ed i tre componenti principali in cui viene risolta la HiCN,
sono state finalmente eseguite esperienze di elettroforesi su gel di amido con i due componenti della Hb0 1 separati cromatograficamente, sia usandoli come tali che dopo
averli trasformati in 1-IiCN (Fig. 2C).
I risultati ottenuti hanno dimostrato che il componente più lento della Hb01
dopo essere stato trasformato in HiCN corrisponde come comportamento elettroforetico ai due componenti più lenti della HiCN nei quali appunto viene risolto.
SU.MMARY- The oxyhemoglobin of Rana esculenta L ., although very labile,
can be preserved for severa! months if dissolved in buffer containing l · 1()-4 M EDTA.
~'i·~g oxyhemoglobin ha.s been resolved into two different homogeneous components
by CM-cellulose chromatography as well as by sta.rch-gel electrophoresis. In a previous
paper the resolution of tbe cyano-meta-derivative of tbe same bemoglobin into three
components by CM-cellulose chromatography and flve components by starch-gel
electropboresis has been described. The second component of frog Hb0 1 has proved
to correspond with tbe second and third chromatografic components of J{iCN.
18 febbraio 1966.
LEONARDO TE:STORI, GEROLAMO VIVALDI,
CARTA e ANNA M .
Laboràtori di Biologia
SALVATORE
•
l TENTORI,
2
L.,
G. VIVALDI, S. CARTA
25 , 990 (1962).
TENTORI, L., G. VIVALDI,
SALVATI
& A. M. SALVATI, Rend. 1st. Super. Sanità,
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