DISS. ETH Nr. 22345
SYNTHESIS AND REACTIVITY OF AN OXAZETIDINE MONOMER FOR
α-KETOACID–HYDROXYLAMINE LIGATION
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Ivano Pusterla
Master of Science in Chemistry, ETH Zurich
Born on 15.11.1985
Citizen of Morbio Inferiore (TI), Switzerland
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Jeffrey W. Bode, examiner
Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner
2014
Abstract
Modern chemical biology requires chemical access to biologically relevant macromolecules
such as peptides and proteins. Linear peptides up to 30–40 amino acids can be accessed via solid
phase peptide synthesis (SPPS), but the synthesis of larger sequences relies on ligation reactions
between unprotected peptide segments.
The native chemical ligation (NCL), so far the most employed ligation technique used for the
total chemical synthesis of proteins, has flourished since its discovery more than 20 years ago.
However this reaction has some limitations, most importantly the challenging synthesis of the Cterminal thioesters and the need of a cysteine residue in the target molecule. Recently, many
contributions have partially overcome these limitations, but NCL can not yet be defined as a
solution to all target proteins.
A very promising and complementary ligation has been developed in our laboratories: the
decarboxylative condensation of C-terminal !-ketoacids (KA) with N-terminal hydroxylamines (HA)
for the chemoselective formation of amide bonds (KAHA ligation). This powerful reaction was
applied to the synthesis of several small and medium-sized proteins. Since the discovery of the
reaction in 2006, many technological improvements have rendered the KAHA ligation progressively
competitive with NCL. However, when more ambitious targets have to be synthesized, all presently
available ligation reactions reach their kinetic limits.
In this dissertation the reaction mechanism of the KAHA ligation was studied. Based on the
mechanistic results a new N-terminal monomer – the Fmoc-amino acid 1 – was designed and
synthesized. In order to prepare compound 1, a new oxazetidine-forming reaction was developed.
O
Fmoc
N
O
OH
1
When 1 was coupled to the N-terminus of peptides, deprotected, and exposed to !ketoacids, the resulting KAHA ligation proved to be particularly rapid and clean. The utility of the
improved version of the ligation was demonstrated in the chemical synthesis of S100A4, a protein
involved in the metastasis process.
III
Sommario
La chimica biologica moderna richiede lʼaccesso sintetico a macromolecole biologicamente
rilevanti, come peptidi e proteine. La sintesi di peptidi lineari contenenti fino a 30–40 amminoacidi è
possibile mediante lʼutilizzo della sintesi peptidica in fase solida (solid phase peptide synthesis,
SPPS). Peptidi di più grandi dimensioni vengono preparati combinando dei frammenti peptidici non
protetti mediante reazioni di ligazione chimica.
La ligazione chimica nativa (native chemical ligation, NCL), indubbiamente la tecnica più
usata per la sintesi di proteine, ha prosperato dal momento della sua scoperta, più di 20 anni or
sono. Tuttavia questa reazione presenta alcune limitazioni, le più importanti delle quali sono il
difficile accesso ai peptidi contenenti dei tioesteri nellʼestremità C-terminale e la necessità di una
cisteina nella proteina bersaglio.
Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato una tecnica di ligazione molto promettente e
complementare: la condensazione decarbossilativa di !-chetoacidi C-terminali (!-ketoacids, KA)
con idrossilammine N-terminali (hydroxylamines, HA) per la formazione chemoselettiva di legami
peptidici (ligazione KAHA). Il potenziale di questa reazione è stato dimostrato nella sintesi di
diverse proteine di piccole e medie dimensioni. Dal momento della sua scoperta, nel 2006,
numerose innovazioni tecniche hanno reso la ligazione KAHA via via più competitiva con la NCL.
Tuttavia, quando si devono sintetizzare proteine di più grandi dimensioni, i metodi finora presenti
raggiungono i loro limiti cinetici.
In questa dissertazione è stato dapprima studiato il meccanismo di reazione della ligazione
KAHA. Sulla base dei risultati ottenuti, è poi stato concepito e sintetizzato un nuovo monomero Nterminale: lʼamminoacido Fmoc-protetto 1. Al fine di preparare il composto 1, è stata sviluppata
una nuova reazione per la sintesi di oxazetidine.
O
Fmoc
N
O
OH
1
Quando il composto 1 viene accoppiato allʼestremità N-terminale di un peptide e questo
viene deprotetto ed esposto ad un !-chetoacido, la ligazione KAHA che ne risulta è
particolarmente rapida e selettiva. Lʼutilità di questa nuova versione della ligazione è stata infine
dimostrata nella sintesi totale di S100A4, una proteina coinvolta nel processo di metastasi.
V
