BLOCCO 1

INTRODUZIONE
FARMACI PEPTIDICI
Più di 7000 peptidi presenti in natura sono stati identificati, e questi hanno
spesso un ruolo cruciale nella fisiologia umana, tra cui
azioni come ormoni, neurotrasmettitori, fattori di crescita…….
Hanno come bersaglio specifici recettori della superficie cellulare, come i
recettori accoppiati a proteine ​G (GPCR) o canali ionici, che una volta
stimolati scatenano effetti intracellulari.
I peptidi di origine naturale spesso non sono direttamente utilizzabili in
terapia perché hanno carenze intrinseche, come una certa instabilità chimico
fisica e una limitata emivita plasmatica.
Dato il loro promettente profilo farmacologico i peptidi rappresentano un
ottimo punto di partenza per la progettazione di nuovi farmaci dotati di
eccellente sicurezza e tollerabilità.
FARMACI PEPTIDICI
Nessun altro tipo di molecola biologica offre uno spettro più ampio di quello dei peptidi + proteine.
Queste sostanze inoltre non sono tossiche per l’organismo. Per molto tempo i peptidi sono stati relegati
al trattamento dei tumori ormono dipendenti (tipico esempio è la sandostatina), essendo inoltre molto
costosi, con emivita molto breve e con nessuna possibilità di un trattamento orale.
OCTREOTIDE
Già negli anni ’80 l’introduzione di formulazioni a rilascio prolungato di peptidi come l’ormone della
crescita e la somatostatina, incapsulati in polimeri biodegradabili che vengono somministrati in
iniezioni mensili, ha permesso a queste sostanze di essere sfruttate maggiormente in clinica.
Con le nuove tecnologie inoltre si stanno abbassando i costi di produzione con l’immissione sul mercato
di farmaci sempre più mirati ed a costi contenuti, anche se sempre molto elevati. Il costo è correlato al
numero di aminoacidi collegati fra loro da un legame peptidico per cui farmaci con 30 aminoacidi
risultano molto costosi anche se, essendo molto potenti, ne bastano dosi minime.
SMALL MOLECULE DRUG
Lipinski's rule of five
Per definizione, le small molecules sono
molecole organiche di piccolo peso molecolare
(inferiore a 800-1000 Dalton). Esse possiedono
un’attività biologica determinata dal fatto di
legarsi al sito attivo di una proteina
responsabile della malattia, chiamato
“target molecolare”.
La regola di Lipinski si basa su quattro semplici fondamenti:
• le molecole non devono avere una massa molecolare maggiore di 500 Dalton (PM < 500).
Infatti se le molecole fossero troppo voluminose e pesanti sarebbero difficilmente assimilabili
ed incontrerebbero troppa difficoltà nel processo di diffusione;
• non ci devono essere più di 5 donatori di ponti idrogeno: troppi ponti idrogeno rendono la
molecola eccessivamente polare, impedendone la diffusione nelle parti lipofile;
• non ci devono essere più di 10 accettori di ponti idrogeno (di solito atomi di ossigeno, azoto);
• la molecola deve avere un log P (il logaritmo del coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua) che
deve essere minore di 5 (log P < 5).
SMALL MOLECULE DRUG
Lipinski's rule of five
CICLOSPORINA
Formula
C62H111N11O12
Molar mass
1202.61 g/mol
PEPTIDI TERAPEUTICI:
definizione
I 'peptidi terapeutici' sono definiti come corte catene di aminoacidi
che hanno un potenziale nella gestione dei sintomi di una malattia,
e in alcuni casi nella vera e propria cura della stessa.
L'industria definisce peptidi come molecole più breve di 100
aminoacidi; mentre le catene aminoacidiche più lunghi possono
essere anticorpi monoclonali e proteine.
Secondo la Peptide Therapeutics Foundation è considerate peptide
una catena di meno di 50 residui amminoacidici (PM < 10 kDa).
PEPTIDI/PROTEINE TERAPEUTICHE
FARMACO PEPTIDICO
FARMACO BIOTECNOLOGICO
FARMACO TRADIZIONALE
SMALL MOLECULE
FARMACO BIOTECNOLOGICO
PM = 180
FARMACI PEPTIDICI:
Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules
S
Strengths
•Good efficacy, safety, and tolerability
•High selectivity and potency
•Predictable metabolism
•Shorter time to market
•Lower attrition rates
•Standard synthetic protocols
W
Weaknesses
•Chemically and physically instable
•Prone to hydrolysis and oxidation
•Tendency for aggregation
•Short half-life and fast elimination
•Usually not orally available
•Low membrane permeability
O
Opportunities
T
Threats
•Immunogenicity
•Price and reimbursement
environment
•Discovery of new peptides,
•Focused libraries
•Optimized designed sequences
•Formulation development
•Alternative delivery routes besides
parental
•Multifunctional peptides
FARMACI PEPTIDICI e BIOTECNOLOGICI:
Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules
FARMACI PEPTIDICI:
Vantaggi e svantaggi rispetto alle small molecules
FARMACI PEPTIDICI:
Il mercato
Attualmente, ci sono più di 60 farmaci peptidici approvati dalla US
Food and Drug Administration (FDA) sul mercato e questo dato è
destinato a crescere in modo significativo, con circa 140 farmaci
peptidici attualmente in sperimentazione clinica e più di 500 peptidi
terapeutici in fase preclinica.
Negli ultimi dieci anni, i peptidi hanno conquistato una vasta gamma
di applicazioni nel campo della medicina e delle biotecnologie, e il
settore sta sperimentando una rinascita anche per
ragioni commerciali.
LupronTM (Abbott Laboratories, cancro della prostata, un fatturato
globale di oltre 2.3 miliardi US $ nel 2011)
LantusTM (Sanofi, diabete, un fatturato di 7,9 miliardi US $ nel 2013).
LA LUNGA STRADA VERSO UN NUOVO FARMACO
10-18 anni
Numbers of New Small Molecule Drug Approvals per Year Compared to New
Biologic Drug Approvals 1998-2008.
FARMACI PEPTIDICI:
Il mercato
FARMACI PEPTIDICI:
Il mercato
FARMACI PEPTIDICI APPROVATI NEL BIENNIO 2012-2014
(USA O EU)
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
Un gran numero di peptidi attivi sono stati isolati e caratterizzati da
un'ampia varietà di fonti biologiche. I peptidi coinvolti nella difesa
dell’ospite e nella cattura delle prede sono tra i migliori candidati farmaci
a causa del loro meccanismo ad azione rapida.
FONTI BIOLOGICHE
• BATTERI
• PIANTE
• ANIMALI
BATTERI COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI
I batteri sono una ricca fonte di peptidi con potenziali
applicazioni farmaceutiche. La nisina, approvato dalla FDA, e con
attività contro gli agenti patogeni di origine alimentare. La nisina
ha anche applicazioni promettenti nel trattamento delle infezioni
da Helicobacter (ulcere) e recentemente è stato studiata come
anti-cancro. La nisina è entrata in studi preclinici come
antibiotico.
NISINA
E’ un polipeptide policiclico costituita da 34
amminoacidi. È una batteriocina prodotta da
Lactococcus lactis.
BATTERI COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI
PEPTIDI ANTIMICROBICI DA FONTI NATURALI
Gli anfibi secernono peptidi con proprietà
antimicrobiche dalla loro pelle come parte del loro
sistema di difesa.
MAGAININ II
Le magainine sono di particolare interesse in quanto hanno una potente attività antimicrobica, ad
ampio spettro con attività emolitica. Pexiganan, un analogo di 22 è entrato in studi clinici di fase
III per il trattamento topico delle ulcere diabetiche. L'interesse per le magainine è rivolto alla
ricerca di nuovi antimicrobici, antitumorali e attività antivirali .
PEPTIDI ANTIMICROBICI DA FONTI NATURALI
Bombina variegata
Rana Temporaria
PIANTE COME FONTE DI PEPTIDI TERAPEUTICI
Le piante producono peptidi per difendersi contro i predatori erbivori. Piante
contenenti ciclotidi sono utilizzate per scopi medicinali nella regione del Congo.
I ciclotidi presentano una ciclizzazione testa-coda che li rende particolarmente
stabile e quindi adatti nel drug design. I ciclotidi hanno varie attività biologiche
di rilevanza farmacologica, compresa la tossicità contro le cellule tumorali e le
proprietà anti-HIV. Uno studio recente ha evidenziato il potenziale di queste
molecole nel rallentare il decorso della sclerosi multipla. Nel complesso,
ciclotidi sono peptidi affascinanti che hanno la costituzione chimica delle
proteine, ma le proprietà di stabilità di prodotti chimici organici.
Oldenlandia affinis
CICLOTIDI
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
Gli organismi velenosi (rettili, pesci, anfibi, mammiferi, molluschi, aracnidi e
insetti) producono sostanze per catturare le prede o come un meccanismo di
difesa. I veleni sono tipicamente prodotti come i cocktail mortali, composto da
miscele di peptidi adattati per selezione naturale. Queste tossine compromettono
i sistemi cardiovascolari e neuromuscolari alterando l'attività di enzimi, recettori e
canali ionici.
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
I gasteropodi marini della specie Conus magus sono nativi dell’Oceano Indiano
e dell’Oceano Pacifico, dove si nutrono di piccoli pesci. Le loro prede sono
spesso molto più veloci di loro, e per questo i molluschi usano potenti
neurotossine nel loro veleno, per immobilizzare le prede. Il loro veleno si trova
in una ghiandola all’interno di un “dente”, che viene sparato contro una preda
o un nemico come un arpione. Questi piccoli animali producono centinaia di
diverse conotossine, ciascuna delle quali ha specifici target molecolari: una
caratteristica che rende questi molluschi una delle più interessanti fonti di
possibili nuovi farmaci. Una singola conotossina si lega soltanto a un tipo
specifico di canale ionico nelle cellule nervose. Per questo le conotossine
rappresentano uno strumento molto preciso ed efficace per la ricerca
scientifica.
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
Ziconotide (nome commerciale di Prialt®), è stato approvato dalla FDA nel 2004
ed è usato come trattamento per il dolore cronico. Altre conotossine sono
attualmente in corso di valutazione in studi clinici e preclinici.
FARMACI PEPTIDICI DA FONTI NATURALI
Melittina isolata dal veleno d’api
in grado di interferire con il processo di
replicazione del virus HIV
PEPTIDI BIOATTIVI DI INTERESSE TERAPEUTICO
WO2004011485: STABILIZED BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS OF IDENTIFICATION, SYNTHESIS, AND USE
PEPTIDI BIOATTIVI DI INTERESSE TERAPEUTICO
WO2004011485: STABILIZED BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS OF IDENTIFICATION, SYNTHESIS, AND USE
AMMINOACIDI PROTEINOGENICI
STRUTTURA DEGLI AMMINOACIDI
PROTEINOGENICI
• Ogni amminoacido possiede un carbonio centrale, chiamato carbonio α, al quale
sono legati quattro differenti gruppi:
• un gruppo amminico basico (-NH2)
• un gruppo carbossilico acido (-COOH)
• un atomo di idrogeno (-H)
• una catena laterale, diversa per ciascun amminoacido (-R)
CLASSIFICAZIONE AMMINOACIDI
Gli amminoacidi possono essere classificati in base
alle proprietà chimico-fisiche delle loro catene laterali che
si differenziano considerevolmente per
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Dimensioni
Polarità
Acidità-basicità
Aromaticità
Flessibilità conformazionale
Reattività chimica
Tendenza a formare legami idrogeno.
AMMINOACIDI CON GRUPPI -R ALIFATICI
(NON POLARI)
• Le loro catene laterali sono costituite da una catena idrocarburica satura: sono
idrofobici.
• La metionina è uno dei due amminoacidi contenenti zolfo.
• La prolina ha una caratteristica struttura ad anello, formato dalla catena laterale e dal
suo gruppo amminico.
GLICINA
ALANINA
VALINA
LEUCINA
PROLINA
METIONINA
ISOLEUCINA
AMMINOACIDI CON GRUPPI -R AROMATICI
(RELATIVAMENTE NON POLARI)
TRIPTOFANO
FENILALANINA
TIROSINA
• Le loro catene laterali sono aromatiche
• Sono relativamente non polari (idrofobici)
• Possono partecipare tutti ad interazioni idrofobiche
• I gruppi -OH della tirosina ed NH del triptofano possono formare legami a idrogeno
AMMINOACIDI CON GRUPPI -R POLARI,
NON CARICHI
SERINA
TREONINA
CISTEINA
ASPARAGINA
GLUTAMMINA
• Sono polari ma in condizioni fisiologiche sono privi di carica elettrica.
• I loro gruppi -R sono più idrofilici di quelli degli AA non polari: contengono gruppi
funzionali che formano legami idrogeno con l’acqua.
• La polarità di serina e treonina è dovuta al gruppo ossidrilico (-OH), quella della
cisteina al gruppo sulfidrilico (-SH), quella di asparagina e glutammina ai gruppi
ammidici (-CONH2).
LA CISTEINA PUÒ FORMARE PONTI DISOLFURO
LA CISTEINA PUÒ FORMARE PONTI DISOLFURO
AMMINOACIDI CON GRUPPI -R CARICHI
POSITIVAMENTE (BASICI)
ISTIDINA
LISINA
ARGININA
• Sono accettori di protoni.
• Le loro catene laterali, contenenti gruppi amminici, a pH fisiologico sono
ionizzate ed hanno carica positiva
AMMINOACIDI CON GRUPPI -R CARICHI NEGATIVAMENTE (ACIDI)
ACIDO ASPARTICO
ACIDO GLUTAMMICO
• Sono donatori di protoni.
• I gruppi carbossilici delle loro catene laterali, al pH fisiologico, sono ionizzati ed
hanno carica negativa.
PROTEINE ACIDE E BASICHE
Le proteine nelle quali il rapporto:
(lys + arg ) / (asp + glu ) >1
sono basiche.
Quando tale rapporto
(lys + arg ) / (asp + glu ) <1
sono acide.
NOMENCLATURA AMMINOACIDI
ACRONIMO
INIZIALE
CODONE
NOME
ACRONIMO INIZIALE
CODONE
NOME
Ala
A
GCU, GCC, GCA,
GCG
alanina
Leu
L
UUA, UUG,
CUU, CUC,
CUA, CUG
leucina
Arg
R
arginina
Asn
Asp
Cys
N
D
C
CGU, CGC, CGA,
CGG, AGA, AGG
AAU, AAC
Lys
K
AAA, AAG
lisina
asparagina
Met
Phe
Pro
M
F
P
AUG
metionina
GAU, GAC
aspartico
UUU, UUC
fenilalanina
UGU, UGC
cisteina
CCU, CCC, CCA,
CCG
prolina
Gln
Q
CAA, CAG
glutammina
Ser
S
UCU, UCC,
UCA, UCG,
AGU, AGC
serina
Glu
E
GAA, GAG
glutammico
Thr
T
ACU, ACC, ACA,
ACG
treoninba
Gly
G
GGU, GGC, GGA,
GGG
glicina
Trp
W
UGG
triptofano
His
H
CAU, CAC
istidina
Tyr
Y
UAU, UAC
tirosina
Ile
I
AUU, AUC, AUA
isoleucina
Val
V
GUU, GUC,
GUA, GUG
valina
CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI
PROTEINOGENICI
• Sono tutti chirali (eccetto la glicina)
• Presentano tutti stereochimica L (il C chirale ha la stessa
configurazione del C chirale della L-gliceraldeide)
• Il C chirale ha una configurazione assoluta S (ad eccezione
della cisteina, che è R)
CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI:
LA CISTEINA
Nel caso della cisteina il gruppo R (-CH2SH) ha priorità
rispetto al carbossile e questo residuo pur appartenendo
alla serie sterica L, ha stereochimica assoluta R.
CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI PROTEINOGENICI:
LA TREONINA
CHIRALITÀ DEGLI AMMINOACIDI
PROTEINOGENICI:
LA ISOLEUCINA
L’INTERAZIONE FARMACO RECETTORE PUO’
ESSERE STEREOSPECIFICA
LEGAMI PEPTIDICI
IL DIPEPTIDE È IL PIÙ SEMPLICE PEPTIDE
FORMATO DALL’UNIONE DI DUE AMMINOACIDI
I peptidi si indicano scrivendo i simboli dei due residui
amminoacidici che li costituiscono
PEPTIDI CONVENZIONI
Per convenzione, i peptidi sono rappresentati ponendo a sx
l'amminoacido con il gruppo amminico libero (a.a. N-terminale) e
all'estremità di dx quello con il gruppo carbossilico libero
(a.a. C-terminale)
CONFORMAZIONE BIOATTIVA
NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO
Il legame peptidico si comporta per il 40% come un doppio legame, esso
è perciò rigido e non può ruotare liberamente, limitando notevolmente i
vari tipi di conformazioni proteiche possibili.
I quattro atomi del legame peptidico giacciono nello stesso
piano così come i Cα dei due amminoacidi che lo formano
NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO
La geometria del legame peptidico nella sua forma di risonanza planare
è sempre trans ad eccezione dei legami instaurati dalla Pro.
NATURA PLANARE DEL LEGAME PEPTIDICO
Lo scheletro di una catena polipeptidica può essere
rappresentato come una serie di piani rigidi
ANGOLI DI TORSIONE NEI PEPTIDI
Ogni piano delle unità peptidiche ha due rotazioni possibili
Il legame Cα-C di un
aminoacido definisce un
angolo di rotazione detto
Y "psi“.
Il legame N-Cα di un
amminoacido definisce un
angolo di rotazione F "phi".
ANGOLI DI TORSIONE NEI PEPTIDI
Non tutte le combinazioni degli angoli
diedri Ψ (psi) e Φ (phi) dei residui
amminoacidici sono ammesse all'interno di
una struttura polipeptidica. Questo impone
un limite alle conformazioni assumibili.
Ramachandran plot shows which  & Y angles are allowed for proteins
ALA
GLY
PRO
Il legame peptidico è un legame rigido, d’altro canto i due legami contigui ad esso
(il Cα-C e il NH-Cα) possono compiere rotazioni, formando due angoli,
rispettivamente Ψ (Psi) e φ (phi); questi due angoli teoricamente possono variare da
-180◦ a + 180◦ , anche se in pratica alcuni di questi valori sono proibiti per delle
interferenze che si possono venire a creare tra le catene laterali degli aminoacidi.
Questi elementi di rigidità contribuiscono a limitare lo
spazio conformazionale accessibile alla catena peptidica
Il grafico di Ramachandran dimostra che solo certe conformazioni spaziali a
bassa energia sono disponibili per la maggior parte degli α-aminoacidi (eccetto la
glicina)
STRUTTURA SECONDARIA
Gli studi di Ramachandran evidenziano che le conformazioni accessibili a bassa
energia sono, le α eliche e i β sheets che
definiscono la struttura secondaria delle proteine
STRUTTURA TERZIARIA
Oltre alle proprietà specifiche dei legami intra-aminoacidici, vi sono un insieme
di forze deboli (non covalenti) che guidano il processo di ripiegamento della
proteina nella sua conformazione nativa; questi legami sono: legami H, legami
ionici, attrazioni di Van der Waals. La stabilità complessiva della struttura
dipende dalla somma delle suddette forze agenti.
FOLDING PROTEICO
E’ il processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale
le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale.
A dispetto della loro complessità, le proteine presentano un ben preciso STATO NATIVO
che assumono mediante un rapido processo di ripiegamento (1µs – 1s). Questo
rappresenta la conformazione più stabile cui compete la più bassa energia libera.
CONFORMAZIONE BIOATTIVA
La struttura tridimensionale delle proteine, più della loro
sequenza, definisce la loro funzione biologica.
La struttura tridimensionale dei farmaci peptidici/proteici,
più della sequenza, definisce la loro funzione terapeutica.
La CONFORMAZIONE BIOATTIVA è quella che il farmaco peptidico/proteico
deve assumere per essere riconosciuto dal proprio target farmacologico ed
è quindi quella che promuove una risposta terapeutica
CONFORMAZIONE BIOATTIVA
Conoscere la struttura 3D della conformazione bioattiva aiuta a capire
come un peptide interagisce con il proprio target e fornisce indicazioni
utili alla progettazione di nuovi farmaci peptidici con potenziale
biotecnologico o utilizzo farmaceutico.
Non è facile determinare la struttura 3D di un peptide a partire dalla sola
sequenza amminoacidica.
METODI DI DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DELLE
PROTEINE
La struttura di una proteina può essere
determinata sperimentalmente mediante:
SPETTROSCOPIA DI RISONANZA MAGNETICA
(NMR)
Permette di esaminare una proteina in soluzione e
di generare anche un quadro della sua dinamica ma
è applicabile solo a proteine che non superano i
250-300 residui.
DIFFRAZIONE AI RAGGI X (RX).
Offre dati molto precisi ma le strutture costrette in
cristalli non sempre rappresentano immagini fedeli
di proteine nella loro conformazione attiva.
METODI DI PREDIZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE
In alternativa ai metodi
sperimentali, si sono sviluppati
dei METODI COMPUTAZIONALI
aventi lo scopo di predire la
struttura tridimensionale di una
proteina, data la sua sequenza
primaria e di comprendere
come le proteine si ripiegano
nelle strutture native.
Attualmente ci sono vari metodi
di predizione di struttura
secondaria delle proteine e di
struttura terziaria:
1) MODELLAMENTO PER OMOLOGIA
2) METODI AB-INITIO
MODELLAMENTO PER OMOLOGIA
Proteine con sequenza aminoacidica simile
(struttura primaria) hanno anche una
disposizione spaziale degli atomi simile
(sequenza secondaria e terziaria).
E’ il metodo computazionale più
affidabile per ottenere una predizione
della struttura tridimensionale di una
proteina ed è applicabile quando la
percentuale di identità di sequenza tra
la proteina da modellare e quella di
riferimento è compresa tra il 20-40%.
Occorre considerare che sono
conosciute molte proteine che, pur
avendo un valore di omologia di
sequenza molto basso, hanno
strutture tridimensionali molto simili.
METODI AB-INITIO
Gli approcci ab-initio utilizzano le sole informazioni fornite dalla natura degli
aminoacidi costituenti la proteina da ripiegare
Si basano sulla valutazione teorica di tutti i contributi energetici coinvolti nel
calcolo dell’energia conformazionale:
FATTORI INTRAMOLECOLARI
(legami chimici, interazioni di
van der Waals, legami
idrogeno, interazioni
coulombiane, entropia
conformazionale)
INTERAZIONE CON IL SOLVENTE
(polarizzazione del mezzo,
formazione di cavità, interazioni
soluto-solvente, variazioni di
struttura del solvente)
Gli strumenti computazionali e bioinformatici sono di grande aiuto,
anche se essi devono essere considerati naturalmente complementari
e non alternativi alle normali tecniche sperimentali
L’approccio computazionale
combinato a quello sperimentale
ha contribuito a progettare nuovi
peptidi potenzialmente utili per il
trattamento di
CANCRO
HIV
ALZHEIMER
IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PROTEICO?
“lo stato nativo di una proteina è
codificato nella sua sequenza primaria”.
Proteina
allo stato nativo
Denaturazione
pH
Temperatura
Forza ionica
Proteina
denaturata
Rinaturazione
Proteina
allo stato nativo
IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PEPTIDICO?
Generalmente peptidi di piccole/medie dimensioni (< 30 aa) sono
molto flessibili e non strutturati. Questi esistono in una varietà di
conformazioni in equilibrio dinamico tra loro.
IN QUANTI MODI PUÒ FOLDARE UN FARMACO PEPTIDICO?
IRRIGIDIMENTO GLOBALE
IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO
Incorporazione di amminoacidi non naturali conformazionalmente vincolanti
AMMINOACIDI METILATI
AMMINOACIDI CICLICI
SINTESI PEPTIDICA
PRODUZIONE DI PEPTIDI/PROTEINE
La dimensione delle molecole da sintetizzare determina la miglior tecnologia per
la relativa produzione.
PRODUZIONE DI PEPTIDI TERAPEUTICI
1. VIA SINTETICA
2. ESTRAZIONE DA FONTI NATURALI
3. VIA BIOTECNOLOGICA (DNA RICOMBINANTE)
PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUICHE
1. ESTRAZIONE DA FONTI NATURALI
2. VIA BIOTECNOLOGICA (DNA RICOMBINANTE)
SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI
TERAPEUTICI
VANTAGGI
1. La sintesi chimica è più veloce e più economica
rispetto alle tecniche biotecnologiche di clonaggio e
overespressione di geni in Escherichia coli.
2. Il peptide che si ottiene è ben determinato dal punto
di vista strutturale.
3. Consente l’incorporazione di amminoacidi artificiali.
SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI
TERAPEUTICI
I peptidi possono essere sintetizzati legando tra loro, nella
giusta sequenza, gli amminoacidi di cui sono composti. La
sintesi di peptidi può essere un'operazione complessa
anche se consiste nel realizzare sempre un solo tipo di
legame, quello ammidico, tra il gruppo carbossilico di un
amminoacido e quello amminico del successivo.
Gli amminoacidi infatti sono molecole bifunzionali, e quindi
non è sufficiente realizzare il legame ammidico desiderato,
ma è necessario che non si formi nessuno degli altri legami
possibili.
La sintesi risulta poi ancora più difficile per la presenza di
gruppi funzionali nelle catene laterali degli amminoacidi e
per la necessità di conservare l'attività ottica dei
carboni chirali in posizione α.
SINTESI CHIMICA DI PEPTIDI
TERAPEUTICI
La sintesi di un dipeptide, ad es. alanina-valina, Ala-Val, permette di comprendere il problema
della formazione del legame peptidico. Se si cercasse di ottenere questo dipeptide per semplice
riscaldamento di una miscela dei due amminoacidi, alanina e glicina, si otterrebbe una miscela
complessa di dipeptidi, tripeptidi e oligopeptidi con sequenze casuali.
H
N
H2N
CO2H
- H2O
+
- H2O
H2N
CO2H
H2N
O
Val - Ala
(V - A)
Ala
Val
CO2H
H
N
H2N
O
Ala - Val
(A - V)
CO2H
GRUPPI PROTETTORI NELLA
SINTESI DI PEPTIDI
Per sintetizzare correttamente il dipeptide Ala-Val è necessario che siano liberi di reagire
solo due gruppi funzionali: il gruppo carbossilico dell'alanina e quello amminico della
valina. Gli altri due gruppi funzionali non devono reagire durante la formazione del legame
ammidico e per questo devono essere legati a molecole chiamate gruppi protettori.
Val-Pc
Pn-Ala
Pn-Ala-Val-Pc
Ala-Val
GRUPPI PROTETTORI NELLA
SINTESI DI PEPTIDI
Pn
+
OH
N
H
peptide
coupling
Pn
OPc
H2N
N
H
Ala - Val
(A - V)
Val
Ala
H
N
H2N
peptide
coupling
(-H2O)
O
OPc
Ala - Val
(A - V)
Pn
Ph
O
Pn
OPc
selectively
remove Pn
O
- H2O
O
O
O
H
N
N
H
H
N
Ph
O
N
H
H
N
O
OPc
Repeat
peptide
synthesis
O
OH
O
Phe (F)
Phe - Ala - Val
(F - A - V)
USO DI GRUPPI PROTETTORI ORTOGONALI: il gruppo protettore del
carbossilato deve essere stabile alle condizioni di reazione in cui si
rimuove il gruppo protettore del gruppo amminico e viceversa
SINTESI DEL PEPTIDE
H-Leu-Phe-Ala-Gly-OH
GRUPPI PROTETTORI NELLA
SINTESI DI PEPTIDI
CARATTERISTICHE GENERALI DI UN BUON GRUPPO PROTETTORE
1. Deve essere facilmente introdotto sul gruppo funzionale di interesse;
2. Deve essere stabile ad un ampio range di condizioni di reazione;
3. Deve essere rimosso facilmente alla fine del processo sintetico o
quando il gruppo funzionale richiede manipolazione in condizioni che
non degradino i legami peptidici neoformati;
4. La sua rimozione dovrebbe portare a sottoprodotti facilmente
rimovibili;
NELLA SINTESI PEPTIDICA I GRUPPI PROTETTORI SI SUDDIVIDONO IN:
Gruppi protettori della FUNZIONE AMMINICA
Gruppi protettori della FUNZIONE CARBOSSILICA
Gruppi protettori delle FUNZIONI IN CATENA LATERALE
GRUPPI PROTETTORI DELLA
FUNZIONE AMMINICA
Poiché la maggior parte delle sintesi peptidiche sono condotte
nella direzione C → N, i gruppi protettivi del gruppo α-amino
vengono rimossi diverse volte durante la sintesi, e quindi, la
rimozione deve essere fatta in condizioni blande in modo da non
intaccare i restanti gruppi protettivi.
GRUPPI PROTETTORI DELLA
FUNZIONE AMMINICA
Boc
Uno dei più usati protettori del gruppo amminico in α è il tert-Butil-ossi-carbonile,
Boc. E' un protettore di tipo uretanico che inibisce la reattività del gruppo
amminico trasformandolo in una ammide. La Boc-alanina ha la seguente struttura:
IL GRUPPO PROTETTORE BOC è ACIDO LABILE
Introduzione del gruppo Boc
Boc2O
Rimozione del gruppo Boc
Il Boc è labile in ambiente acido e viene staccato con acido trifluoroacetico, TFA.
La sua labilità agli acidi dipende dal fatto che sono presenti due ottimi gruppi uscenti: la CO2, che
si sottrae all'equilibrio come gas, e il catione tert-butilico.
A
A
B
GRUPPI PROTETTORI DELLA
FUNZIONE AMMINICA
metile
ossi
Fmoc
carbonile
Fmoc-Gly
fluorenil
Il gruppo protettore Fmoc viene rimosso per trattamento con una soluzione al 20%
di piperidina in DMF (ha una emivita calcolata di 6 secondi in questa soluzione)
Introduzione del gruppo Fmoc
Rimozione del gruppo Fmoc
Dibenzofulvene
GRUPPI PROTETTORI DELLA
FUNZIONE AMMINICA
ossi
Z o Cbz
benzil
carbonile
La rimozione avviene per idrogenolisi (che rimuove il gruppo benzilossi) e
successiva decomposizione spontanea del carbammato a CO2 + R-NH2.
Introduzione del gruppo Z
Rimozione del gruppo Z
GRUPPI PROTETTORI DELLA
FUNZIONE CARBOSSILICA
Uno dei più usati protettori del gruppo carbossilico terminale è il gruppo benzilico,
Bzl. Questo inibisce la reattività del carbossile trasformandolo in un estere benzilico.
La glicina protetta come Gly-OBzl ha la seguente struttura
L'estere benzilico è stabile nelle condizioni di sblocco del Boc con TFA / DCM (1:1), ma
viene scisso in HF liquido anidro a 0 °C, ambiente in cui il legame ammidico è stabile, o
tramite idrogenolisi.
GRUPPI PROTETTORI DELLA
CATENE LATERALI
Commonly applied amino acid side chain protecting groups.
Trt: trityl,
Pbf: pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl.
RIMOZIONE FINALE DI TUTTE LE PROTEZIONI
AMMINOACIDO PROTETTO ORTOGONALMENTE
The benzyl ester can be removed by
hydrogenolysis, the fluorenylmethylenoxy
group (Fmoc) by bases (such as piperidine),
and the phenolic tert-butyl ether cleaved
with acids (e.g. with trifluoroacetic acid).
FORMAZIONE DEL LEGAME AMMIDICO
E’ INDISPENSABILE ATTIVARE IL GRUPPO CARBOSSILICO
AFFINCHÈ SI FORMI IL LEGAME PEPTIDICO
STRATEGIE PER LA FORMAZIONE
DEL LEGAME PEPTIDICO
•
•
•
•
Carbodiimmidi
Esteri attivi
Sali di fosfonio
Sali di amminio/uronio
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON CARBODIIMMIDI
DCC
N,N'-dicicloesil carbodiimide
WSC
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON CARBODIIMMIDI
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON CARBODIIMMIDI
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON CARBODIIMMIDI e HOBt
HOBt
N-idrossi benzotriazolo
Usato come additivo nelle condensazioni mediate da carbodiimmidi
determina un aumento dell’efficienza della sintesi peptidica
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON CARBODIIMMIDI e HOBt
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON SALI DI FOSFONIO
I sali di fosfonio sono reagenti di accoppiamento potenti e permettono la
generazione in situ di esteri attivi.
BOP
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON SALI DI FOSFONIO
Mechanism of BOP-mediated coupling reagent.
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON SALI DI URONIO
HBTU
HATU
ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
CON SALI DI URONIO
Mechanism of HATU-mediated coupling reagent.
FASI DELLA SINTESI PEPTIDICA
1. PROTEZIONE DEGLI AMMINOACIDI
2. ATTIVAZIONE DEL GRUPPO CARBOSSILICO
3. FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO
4. RIMOZIONE DEI GRUPPI PROTETTORI
SINTESI DIVERGENTE E SINTESI CONVERGENTE
Nella SINTESI DIVERGENTE di procede step by step aggiungendo un
amminoacido per volta. Essa porta all’allungamento graduale della
catena che consiste nell'incorporare nel peptide un amminoacido alla
volta a partire dal terminale carbossilico.
La SINTESI CONVERGENTE è anche detta sintesi a blocchi e
prevede la sintesi indipendente di frammenti del peptide target
che vengono condensati solo in un’ultima fase
SINTESI DI PEPTIDI IN FASE SOLIDA
Robert Bruce Merrifield (July 15, 1921 – May 14,
2006) was an American biochemist who won
the Nobel Prize in Chemistry in 1984 for the
invention of solid phase peptide synthesis.
Rockefeller University
Representation of protein and peptide synthesis by
biochemical and chemical methods.
Durante la biosintesi le proteine non si trovano in soluzione, ma sono ancorate ad una
molecola di RNA transfer il quale, a sua volta, è legato al complesso ribosoma-RNA
messaggero. Questo costituisce una sorta di supporto solido dal quale le proteine si
staccano solo quando sono state completate .
VR Pattabiraman & JW Bode Nature 480, 471-479 (2011) doi:10.1038/nature10702
+
polymerization
RESINA DI MERRIFIELD/ Boc-CHEMISTRY
Ph
ator
Ph
nitiator
erization
Ph
divinylbenzene
(crosslinker, H
~13COCH
%)
2Cl
Ph
Ph
H3COCH2Cl
Ph
Ph Ph
ZnCl
Ph
Ph
2 Ph
Ph
lymerization
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
H3COCH2Cl
ZnCl2
CHPh
2Cl
Ph
O
BOC
R
Ph
Ph
CF3CO2H
O
O
O
R
H
N
Ph
Ph
Ph
O
Ph
CH2Cl _
Ph
Ph
ZnCl2
Ph
O
NH
BOC
NH2
R
CF3CO2H
O
O
O
R
NH
BOC
O
NH2
R
O l’uso di Boc amminoacidi e la rimozione finale del peptide con HF
Prevedeva in origine
La rimozione
O ripetitiva via TFA può portare ad alterare alcuni peptidi sensibili
114
Fmoc-CHEMISTRY
Questo tipo di sintesi prevede la crescita di catene peptidiche ancorate ad un supporto
polimerico insolubile in presenza di un linker adeguato che permette l'attacco e il distacco del
peptide e di una strategia di protezione/deprotezione di tipo ortogonale per i singoli
monomeri. In questo modo i reagenti in eccesso e i sottoprodotti della sintesi possono essere
rimossi per semplice filtrazione e lavaggio del polimero al quale è legato il peptide.
REQUISITI DI UN SUPPORTO SOLIDO
1. Deve contenere delle funzioni reattive
2. Deve essere stabile nelle condizioni di sintesi
3. Deve permettere un rapido e libero contatto tra i reagenti
4. Deve essere facilmente separabile dalla fase liquida
VANTAGGI DELLA SINTESI PEPTIDICA IN FASE SOLIDA
1. Processi di purificazione più semplici. È sufficiente per ogni stadio di
reazione una semplice filtrazione.
2. Tempi di reazione più brevi. Gli amminoacidi vengono introdotti al
ritmo di uno ogni ora.
3. Minori problemi legati alla solubilità (quando il numero di
amminoacidi è maggiore di 3-4 il peptide può essere poco solubile
nei normali solventi organici)
4. Inoltre, data la semplicità delle operazioni richieste, l'intero processo
può essere automatizzato. Un sintetizzatore automatico di peptidi in
fase solida può introdurre fino a dodici amminoacidi al giorno.
SINTESI MANUALE
SINTETIZZATORE AUTOMATICO
INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE
DI INTERESSE FARMACEUTICO
INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE DI
INTERESSE FARMACEUTICO
I farmaci biosimilari presentano diversi elementi di criticità legati alla loro
• INSTABILITÀ CHIMICA
• INSTABILITÀ FISICA
• FOTOSENSIBILITÀ
INSTABILITÀ CHIMICA DI PEPTIDI E PROTEINE DI
INTERESSE FARMACEUTICO
Una serie di reazioni possono essere responsabili dell’instabilità delle proteine
1.
2.
3.
4.
5.
6.
IDROLISI
DEAMIDAZIONE
RACEMIZZAZIONE
FORMAZIONE DI PIROGLUTAMMATO IN POSIZIONE N-TERMINALE
FORMAZIONE E SCAMBIO DI PONTI DISOLFURO
OSSIDAZIONE
• NELLE FASI DI SINTESI
• IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE
• NELLE FORMULAZIONI
IDROLISI
Per svolgere la loro funzione negli organismi viventi le proteine devono essere
relativamente stabili in soluzione. Si è constatato che, in generale, la reazione
a pH neutro è estremamente lenta, con cinetiche di centinaia di anni.
Negli organismi viventi l'idrolisi è catalizzata da enzimi idrolitici come la tripsina e la
chimotripsina, entrambi specifici per alcune sequenze amminoacidiche.
Gli anticorpi monoclonali sono soggetti a
frammentazione non enzimatica nella regioni cerniera.
La frammentazione si osserva nelle regioni flessibili ed esposte al solvente
di una proteina. Ad esempio regioni ricche di Gly (in particolare la sequenza
Gly-Gly) sono soggette frequentemente a scissione.
Inoltre, buona parte delle frammentazioni in anticorpi monoclonali si verifica
in prossimità di alcuni residui amminoacidici: Asp, Gly, Ser, Thr, Cys or Asn.
Le catene laterali di questi residui possono facilitare la scissione del legame
peptidico tramite meccanismi specifici.
FRAMMENTAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI
Asp
Ser
DEAMIDAZIONE
A
B
B
A
La velocità di deamidazione è superiore per residui di asparagina recanti al Cterminale un residuo amminoacidico poco ingombrato come la glicina
RACEMIZZAZIONE
La racemizzazione è stata sempre un grave problema di stabilità di peptidi
(sia in fase sintetica che in condizioni fisiologiche) e ne ha limitato a lungo
lo sviluppo.
Se l'amminoacido racemizzato si trova in un punto critico della proteina o
se vengono racemizzati più amminoacidi, allora la struttura
tridimensionale della proteina modificata può essere così diversa da quella
nativa da comportare una totale perdita di attività biologica.
Esistono vari meccanismi di racemizzazione/epimerizzazione di un farmaco
peptidico.
RACEMIZZAZIONE PER ENOLIZZAZIONE DIRETTA
In soluzione acquosa neutra a 20 °C la racemizzazione praticamente non
avviene.
Questo meccanismo diventa significativo solo se un peptide è sottoposto a
condizioni molto basiche e/o ad alte temperature. L'idrolisi basica di una
proteina, con NaOH 1M a 100 °C per 1 ora, produce amminoacidi
completamente racemizzati.
RACEMIZZAZIONE VIA ASPARTIMMIDE
5
1
L-ASPARTIMMIDE
D-ASPARTIMMIDE
2
4
3
7
6
I residui di acido aspartico (Asp) in peptidi e proteine sono inclini a racemizzazione non
enzimatica. E’ un processo inevitabile, spontaneo e svolge un ruolo importante nella
biologia molecolare dell'invecchiamento. La racemizzazione di Asp ha anche rilevanza per
molte malattie legate all'età come il morbo di Alzheimer.
Health, 5, 2013, 2018-2021
FORMAZIONE DI PIROGLUTAMMATO IN POSIZIONE N-TERMINALE
La formazione avviene attraverso il riarrangiamento del glutammato o della
glutammina in posizione N terminale. Procede spontaneamente o tramite l’enzima
glutaminil ciclasi che si trova in molte piante e animali, compresi gli esseri umani.
La reazione sia spontanea che catalizzata da enzimi sembra essere
molto più veloce con glutammina che con residui di glutammato.
The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286, 11211-11217.
RIARRANGIAMENTO DI PONTI DISOLFURO
Le disolfuro isomerasi (o PDI) sono una classe di enzimi
che catalizzano reazioni di scambio tra gruppi -S-H e
gruppi S-S-, la formazione o la rottura di ponti di solfuro
OSSIDAZIONE Cys
OSSIDAZIONE Met
OSSIDAZIONE Trp
OSSIDAZIONE His
FOTO-INSTABILITÀ DI PEPTIDI E PROTEINE DI
INTERESSE FARMACEUTICO
JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 96, NO. 6, JUNE 2007
INSTABILITÀ FISICA DI PEPTIDI E PROTEINE DI
INTERESSE FARMACEUTICO
Include fenomeni che comportano modifiche non covalenti come
DENATURAZIONE
ASSORBIMENTO DI SUPERFICIE
AGGREGAZIONE
PRECIPITAZIONE
Superficie idrofobica
aggregati insolubili
monomeri
cristalli
Qualunque evento che porta a denaturazione e aggregazione può inattivare la
proteina terapeutica anche se viene conservata la struttura primaria.
CONSERVAZIONE DI PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI
La formulazione e lo stoccaggio dei farmaci proteici differisce da quella di farmaci
non proteici. Occorre considerare che sono generalmente farmaci molto costosi e
vanno correttamente conservati.
Le scorte di magazzino richiedono una rotazione elevata per la difficoltà di
conservazione. Le proteine hanno in genere un ridotto tempo di stabilità e la
media di conservazione in farmacia per un prodotto biotecnologico è di 12-18
mesi (stabilità media di farmaci non proteici è superiore ai 36 mesi).
Alcuni farmaci fotosensibili vanno protetti dalla luce.
Vengono conservati in frigorifero ad una temperatura di 2-8 °C e non surgelati. Se
il paziente deve percorrere un tragitto dopo la consegna del farmaco in farmacia,
il farmacista dovrebbe fornire una confeziona adatta alla conservazione secondo
indicazioni della ditta produttrice (contenitori con ghiaccio e non ghiaccio secco).
CONSERVAZIONE DI PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI
Attenzione al rispetto della catena del freddo
RACCOMANDAZIONI PER PRODOTTI PEPTIDICI/BIOTECNOLOGICI
Al ricevimento del farmaco il personale sanitario addetto deve verificare
sistematicamente la temperatura del contenitore.
Deve essere effettuata costantemente una valutazione visiva del farmaco
per escludere la presenza di particolato e segni di variazione di colore.
Le ditte producono questi farmaci in soluzioni sterili preferibilmente monodose
o come liofilizzati. Devono essere prodotti in condizioni sterili perché instabili ai
comuni processi di sterilizzazione che prevedono l’impiego di radiazioni
ionizzanti e calore.
I farmaci biologici per via infusionale attualmente disponibili in Italia, prima di
poter essere somministrati, devono essere ricostituiti e/o diluiti secondo le
modalità indicate all’interno delle rispettive schede tecniche. Cura deve
essere prestata alla ricostituzione del farmaco di origine proteica.
ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI
PRODOTTI BIOTECNOLOGICI
AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH
ANTIOSSIDANTI: Per il blocco dell’ossidazione di metionina, cisteina,
triptofano, e istidina. In genere l’ossigeno viene sostituito con un gas
inerte.
AGENTI ANTIAGGREGANTI: Sono necessari per ridurre
l’assorbimento della proteina terapeutica alle superfici della fiala,
siringa, ago. Molto usata l’albumina che agisce come surfattante.
Questa ha natura anfifilica che contribuisce a ridurre l’adsorbimento
della proteina tramite meccanismo competitivo. In questo caso le
fiale non devono essere agitate per evitare la formazione di schiuma
da parte di albumina che causa perdita o inattivazione del farmaco.
PEPTIDI E PROTEINE TERAPEUTICHE:
PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO
FARMACOCINETICA
LA FARMACOLOGIA COMPRENDE
FARMACODINAMICA
Studia i meccanismi
d’azione dei farmaci e gli
effetti biochimici e
fisiologici degli stessi
studia gli effetti del
farmaco sull'organismo
FARMACOCINETICA
ossia i processi che condizionano
il raggiungimento ed il
mantenimento di un'adeguata
concentrazione dei farmaci nei vari
compartimenti
studia gli effetti
dell'organismo sul
farmaco
FARMACOCINETICA
(ADME)
Studia i movimenti del farmaco nell’organismo. Le varie fasi della cinetica di un
farmaco sono:
Assorbimento
Passaggio del farmaco dalla sede di
applicazione al sangue attraverso le
membrane biologiche.
Metabolismo o Biotrasformazione
Modificazioni chimiche che il farmaco
subisce nell’organismo, principalmente ad
opera del fegato.
Distribuzione
Distribuzione del farmaco dal sangue ai
diversi compartimenti dell’organismo.
Escrezione
Eliminazione del farmaco dall’organismo,
prevalentemente avviene ad opera del
rene.
ASSORBIMENTO
ASSORBIMENTO DI FARMACI PEPTIDICI/PROTEICI
Trasporto
attivo
• Barriere fisiche epiteliali
• Barriere metaboliche (enzimi sulla superficie degli epiteli)
LIMITE DI DIMENSIONE E IDROFILIA PER I
FARMACI PEPTIDICI /PROTEICI
Diffusione passiva (-------): limite idrofilia
Assorbimento paracellulare (++++): limite dimensione
Fagocitosi (+)
Trasporto attivo (+)
Ordine decrescente delle principali vie di
somministrazione in relazione alla velocità
ed entità dell’ASSORBIMENTO
L’entità e la velocità di assorbimento di un farmaco dipendono anche
dalla via di somministrazione
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Endovenosa (non c’è la fase di assorbimento)
Inalatoria
Sublinguale
Sottocutanea
Intramuscolare
Intradermica
Rettale
Orale
VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI
La via parenterale è quella di
elezione per peptidi e proteine
terapeutiche
Via parenterale che comprende:
ENDOVENOSA
INTRAMUSCOLARE
SOTTOCUTANEA
In particolare la sottocutanea:
• è quella più impiegata per i peptidi perché
più sicura rispetto all’endovenosa;
• Il volume di iniezione e la profondità di
iniezione influenzano l’assorbimento del
peptide.
• Inoltre la prolungata residenza nel sito
d’iniezione aumenta l’esposizione a reazioni
di degradazione (es.”insulino-resistenza”
dovuta ad alte concentrazioni di peptidasi
tissutali).
PENNE PRE-RIEMPITE PER INSULINA
VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI
Via intranasale:
•
•
•
consente l’assorbimento di peptidi ad
alto peso molecolare (> 2KDa);
no metabolismo di primo passaggio
epatico
il muco tuttavia costituisce barriera
fisica ed elettrostatica (carico
negativamente).
Via polmonare:
•
•
•
•
•
barriere epiteliali più sottili,
ampia superficie esposta (100 m2),
ricca vascolarizzazione,
assenza metabolismo epatico,
presenza di antiproteasi (l'alfa-1antitripsina è una glicoproteina che
costituisce il più importante sistema di
difesa delle vie respiratorie inferiori
contro i danni causati da queste
proteasi sulle pareti degli alveoli).
VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI
Via transdermica:
• barriera fisica dello strato
corneo;
• barriera enzimatica di
epidermide e derma.
SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI PER VIA TRANSDERMICA
Per veicolare un farmaco proteico attraverso la pelle intatta, è
necessario sviluppare tecnologie che facilitino la permeazione
transdermica di molecole che presentano caratteristiche chimicofisiche inadatte al superamento della barriera cutanea. Risultati
particolarmente interessanti per il delivery transdermico di
macromolecole sono stati ottenuti utilizzando iontoforesi,
elettroporazione, sonoforesi e microporazione.
SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI PER VIA TRANSDERMICA
IONOFORESI
Tecnica elettroterapica che utilizza
una corrente continua, prodotta da un
apposito generatore per favorire la
somministrazione transdermica.
MICROPORAZIONE
Il modo comune di applicazione è la
microperforazione seguita da applicazione di un
cerotto medicato o una formulazione liquida.
ELETTROPORAZIONE
VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI PEPTIDI
LA VIA ORALE CONTROINDICATA a causa di:
ELEVATA DEGRADAZIONE
•
•
•
•
pH gastrico
Endopeptidasi presenti a livello intestinale
(pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi)
Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B)
Degradazione da parte della flora batterica
SCARSO ASSORBIMENTO
•
•
•
Molecole di grande dimensioni
Assenza di meccanismi di trasporto attivo
Adsorbimento su cibi non digeribili
PEPTIDI ATTIVI PER VIA ORALE
IN COMMERCIO
DESMOPRESSINA
• E’ analogo della vasopressina, ormone
pituitario, e viene utilizzata per il
trattamento del diabete insipido
• 9 residui amminoacidici
• Ha natura ciclica
• Biodisponibilità 1%
CICLOSPORINA
• E’ un farmaco antirigetto con
effetto immunosoppressivo
• 11 residui amminoacidici
• Ha natura ciclica
• Biodisponibilità 40%
DISTRIBUZIONE
DISTRIBUZIONE DI FARMACI PEPTIDICI
NELL’ORGANISMO
• I peptidi di piccole molecole e (<500 Da) sono distribuiti principalmente per
diffusione. Questo può anche verificarsi per proteine ​più grandi (0,5-10
kDa), sebbene il processo sia più lento e avvenga soprattutto attraverso i
nanopori delle pareti capillari. Ne consegue che il volume di distribuzione è
relativamente piccolo.
• Inoltre, il legame di peptidi alle proteine ​plasmatiche interferisce in
maniera importante con il processo di distribuzione (65% di octreotideacromegalia e 98% di liraglutide-diabete si legano alle proteine
plasmatiche).
• A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio della biodistribuzione
è necessario per evitare l’accumulo di metaboliti tossici in particolari
tessuti, la biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo l’avvenuta
distribuzione del farmaco in un particolare tessuto, dato che gli aminoacidi
della proteina possono essere riutilizzati.
DISTRIBUZIONE DI FARMACI PEPTIDICI
NELL’ORGANISMO
SANGUE
DRUG
La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo iniezione s.c. rappresenta
l’unico meccanismo di trasporto per macromolecole, che raggiungono
il torrente circolatorio indirettamente attraverso il sistema linfatico:
composti con P.M. maggiore di 16kD vengono assorbiti dai vasi
linfatici, mentre i composti inferiori a 1kD non vi penetrano quasi per
nulla
SITO
D’INIEZIONE
LINFA
ELIMINAZIONE
ELIMINAZIONE DI FARMACI
PEPTIDICI/PROTEICI
1. PROTEOLISI
Richiede in genere pochi minuti, il che spiega la loro breve emivita e gli effetti
terapeutici limitati nel tempo. Le peptidasi (eso ed endo) sono ubiquitarie ma la
maggior parte del processo avviene in sangue, fegato, reni, e piccolo intestino.
Possono essere di membrana o solubili (sangue). Porta alla formazione di
amminoacidi che vengono riutilizzati.
2. METABOLISMO EPATICO
Non è la principale via di eliminazione ma contribuisce in caso di piccoli peptidi
(bortezomib) o in caso di peptidi assunti per via orale (ciclosporina).
3. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE
E’ rilevante solo in peptidi modificati che resistono alle peptidasi (exenatide)
4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA
E’ un processo che contraddistingue peptidi e proteine (ORMONI POLIPEPTIDICI).
Si verifica quando una porzione significativa del farmaco è legata al target
farmacologico con alta affinità. Nel caso di peptidi una porzione consistente di
farmaco rimane legato ai recettori che vengono poi internalizzati (uptake) e
metabolizzati a livello cellulare.
CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI
FARMACI PEPTIDICI
SCARSO ASSORBIMENTO
BASSA BIODISPONIBILITÀ
La biodisponibiltà descrivere la
frazione di farmaco somministrato
che raggiunge inalterato la
circolazione sistemica rispetto al
totale somministrato.
METABOLISMO VELOCE
SCARSA EMIVITA PLASMATICA
Per emivita plasmatica si indica il tempo
richiesto per ridurre del 50% la quantità di
un farmaco nel plasma.
LE CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI FARMACI
PEPTIDICI INCIDONO ANCHE SUL LORO PROFILO
FARMACODINAMICO
IN GENERALE I FARMACI PEPTIDICI E PROTEICI HANNO DIFFICOLTÀ A
RAGGIUNGERE RECETTORI INTRACELLULARI E IL SISTEMA NERVOSO
CENTRALE
STRATEGIE PER MIGLIORARE LE
CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI
FARMACI PEPTIDICI
1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE
SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO
• Sistemi depot parenterali
• Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi)
SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO
Per migliorare l'efficacia delle proteine, si utilizzano sistemi iniettabili o
impiantabili che garantiscano il rilascio prolungato delle proteine
terapeutiche per periodi variabili da una settimana fino a diversi mesi.
Un sistema ideale di delivery dovrebbe:
• Proteggere la proteina dalla degradazione in vivo;
• Controllarne anche la velocità di rilascio
I sistemi a rilascio prolungato sono progettati per estendere gli effetti del
farmaco e quindi permettere di avere vantaggi quali:
•
•
•
•
riduzione della frequenza di somministrazione
riduzione degli effetti indesiderati
riduzione della tossicità locale e del dolore al momento della ’iniezione
minori costi rispetto alla formulazione convenzionale
SISTEMI DEPOT PARENTERALI
MICROSFERE
MATRICI POLIMERICHE
IMPIANTI
SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MICROSFERE
Alcuni di questi prodotti parenterali commercializzati sono formulazioni polimeriche di
microsfere che possono essere iniettate per via intramuscolare e sottocutanea per avere
effetti sistemici oppure in un sito specifico dell’organismo per un trattamento localizzato.
Le microsfere sono sistemi polimerici rigidi, con dimensioni micrometriche (3-800 µm). La
matrice polimerica è spesso costituita da polilattico-poliglicolico (PLGA) e deve rispondere
ai seguenti requisiti:
• Deve garantire il mantenimento dell’integrità del farmaco durante le fasi di produzione
e conservazione per preservarne stabilità e bioattività.
• Deve garantire l’elevata incorporazione del farmaco.
• Deve essere sicuro e non tossico
• Deve garantire il controllo del grado di rilascio del farmaco
MICROSFERE A BASE DI PLGA PER IL RILASCIO DI INSULINA
SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MICROSFERE
SISTEMI INIETTABILI DEPOT: MATRICE POLIMERICA
Astra Zeneca ha sviluppato lo Zoladex® a base di PLGA per il rilascio prolungato (28 giorni)
di goserelin acetato (trattamento del carcinoma della prostata in cui sia indicata la
soppressione della produzione di testosterone). Il dispositivo, di forma cilindrica con 1
mm di diametro, è dispensato all’interno di una siringa specializzata per l’iniezione
sottocutanea.
Il goserelin si somministra sotto forma d'iniezione sotto cute nella regione addominale. Di
solito la somministrazione è mensile (ogni 4 settimane).
L'iniezione deve essere eseguita da un medico o un infermiere.
SISTEMI DEPOT IMPIANTABILI
Questi dispositivi, inseriti sottocute mediante piccoli interventi chirurgici, sono
sistemi ideali per il rilascio controllato di farmaci per periodi superiori ai sei mesi.
La tecnologia d’impianto DUROS® è utilizzata nel sistema Viadur® contenente
leuprolide acetato per il trattamento del tumore prostatico. Il Viadur® è un sistema
osmotico che si è rivelato efficace nel ridurre i livelli di testosterone per un periodo
di 12 mesi.
DIMENSIONE: 4x45 mm
MATERIALE: titanio
SISTEMI LIPIDICI PER IL DELIVERY DI PROTEINE
Le formulazioni liposomiali a lunga circolazione
sono state studiate come sistemi di drug
delivery e la letteratura suggerisce che tali
formulazioni possano essere utilizzate anche
per il prolungamento del tempo di circolazione
di proteine e peptidi.
L’incremento dell’emivita può variare tra 2 e
150 volte e dipende da:
• rapporto proteina/lipide;
• dimensioni liposomiali;
• dalla composizione lipidica dei liposomi.
I liposomi hanno la capacità di proteggere il
loro contenuto dall’azione denaturante di
enzimi e ambienti degradanti.
LIPOSOMA
SISTEMI LIPIDICI PER IL DELIVERY DI PROTEINE
Il limite della veicolazione in liposomi convenzionali è dato dalla scarsa capacità di
loading di macromolecole idrosolubili. Per ovviare a questi problemi sono stati
sviluppati sistemi di delivery multivescicolari come il DepoFoam, costituito da
microscopiche particelle sferiche contenenti centinaia di cavità acquose multiple,
non concentriche che incapsulano il farmaco idrofilo. Le singole cavità sono separate
da membrane a doppio strato lipidico formate da lipidi sintetici analoghi a quelli
naturali che consentono di ottenere un carrier biocompatibile e biodegradabile.
Formulazioni DepoFoam di proteine/peptidi quali insulina, leuprolide,
encefaline ed octreotide sono stati già sviluppati e caratterizzati.
DepoFoam
STRATEGIE PER MIGLIORARE LE
CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI
FARMACI PEPTIDICI
1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE
SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO
• Sistemi depot parenterali
• Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi)
2) STRATEGIE FORMULATIVE PER INCREMENTARE IL DELIVERY PER VIA ORALE
• Associazione con molecole che possano inibire la degradazione
• Associazione con molecole che possano incrementare l’assorbimento
SISTEMI STUDIATI PER INCREMENTARE L’ASSORBIMENTO DI PROTEINE
PER VIA ORALE
Inibitori delle proteasi e tecniche di protezione dagli enzimi
Gli inibitori enzimatici come l’aprotinina (inibitore di tripsina/chimotripsina),
amastatina, bestatina, (inibitori delle amminopeptidasi) sono stati oggetto di numerosi
studi che hanno evidenziato la loro efficacia nel preservare le molecole proteiche dal
venire a contatto con il sistema enzimatico. Tuttavia questo approccio ha una limitata
accettabilità pratica e commerciale in quanto la prolungata inattivazione enzimatica
può provocare un incremento dell’attività enzimatica di ritorno e disturbi nella
digestione delle proteine alimentari.
Promotori di assorbimento
I promotori di assorbimento comprendono varie classi di molecole che hanno in
comune la capacità di favorire la penetrazione e/o il trasporto delle molecole
attraverso le membrane biologiche. Molte di queste sostanze, come i sali biliari,
agiscono alterando la fluidità delle mucose e delle membrane.
PROMOTORI DI ASSORBIMENTO
Tecnologia Transient Permeability Enhancer (TPE®)
Si basa sull’utilizzo di sali sodici di acidi grassi a
media catena come promotori di assorbimento.
Il sodio caprato (C10) è la molecola più studiata e
impiegata.
IL SODIO CAPRATO PROMUOVE L’ASSORBIMENTO PARACELLULARE
Tecnologia Peptelligence
Si basa sull’utilizzo di lauroil (C12) carnitina e palmitoil (C16) carnitina come
promotori di assorbimento. Le acil carnitine promuovono l’assorbimento
paracellulare e transcellulare.
lauroyl carnitine
CARNITINA
palmitoyl carnitine
Tecnologia Peptelligence
Tecnologia Eligen®
Si basa sull’utilizzo di diversi carriers il più studiato dei quali viene chiamato SNAC.
SNAC
(sodium N-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino]caprylate)
MECCANISMO
Aumenta la superficie lipofila
di insulina/calcitonina cui si
lega in maniera non covalente
e induce cambiamenti di
conformazione al peptide,
che determinano
l'esposizione di regioni
idrofobiche adatte alla
permeazione transcellulare
STRATEGIE PER MIGLIORARE LE
CARATTERISTICHE FARMACOCINETICHE DI
FARMACI PEPTIDICI
1) STRATEGIE FORMULATIVE PER LA SOMMINISTRAZIONE PARENTERALE
SISTEMI DI RILASCIO CONTROLLATO
• Sistemi depot parenterali
• Dispositivi impiantabili
• Sistemi lipidici per il delivery di proteine (liposomi)
2) STRATEGIE FORMULATIVE PER INCREMENTARE IL DELIVERY PER VIA ORALE
• Associazione con molecole che possano inibire la degradazione
• Associazione con molecole che possano incrementare l’assorbimento
3) MODIFICAZIONI CHIMICHE
DERIVATIZZAZIONE/CONIUGAZIONE
• Coniugazione con cell penetrating peptides
• PEGilazione
• Coniugazione con il frammento Fc di una immunoglobulina G
• Coniugazione con Albumina
PEPTIDOMIMETICI
Cell penetrating peptides (CPP)
• SONO PICCOLI PEPTIDI (MENO DI 30 aa).
• SPESSO CATIONICI
• HANNO LA CAPACITÀ DI ATTRAVERSARE LE MEMBRANE!!!!!
Coniugazione con cell penetrating peptides (CPP)
+
+
+
+
+
+
+
+
Coniugazione con cell penetrating peptides (CPP)
PROTEINA
TERAPEUTICA
CPP
I CPP se funzionalizzati covalentemente
con una macromolecola riescono a
mantenere la capacità di attraversare le
membrane. Per questo vengono
considerati dei validi sistemi di
trasporto di farmaci proteici che
altrimenti non riuscirebbero ad entrare
nella cellula.
Cell penetrating peptides (CPP)
Meccanismo
STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI:
LA CONIUGAZIONE CON POLIMERI IDROFILI
PEGILAZIONE
La strategia più efficace ad oggi è costituita dalla coniugazione della proteina
terapeutica con PEG (PEGilazione) ossia la funzionalizzazione del farmaco con
polimeri di poliossietilene.
l glicole polietilenico (PEG) o poliossietilene (POE) è un polimero preparato
per polimerizzazione dell‘ossido di etilene.
polimerizzazione
OSSIDO DI ETILENE
PEG
GLICOLE ETILENICO
PEGILAZIONE
• Il PEG è un polietere di natura anfifilica
• I PEG possono essere lineari o ramificati
• I PEG possono avere peso molecolari variabili
• I polimeri di PEG sono molecole inerti e non tossiche
• Una stessa proteina terapeutica può essere funzionalizzata con più
catene di PEG
EFFETTI DELLA PEGILAZIONE SULLE PROPRIETÀ DI PROTEINE TERAPEUTICHE
AUMENTO SOLUBILITÀ IN ACQUA
RIDOTTA IMMUNOGENICITÀ
La porzione idrofilica può incorporare un
La flessibilità della porzione idrofilica puo’
elevato numero di molecole di acqua . coprire i determinanti antigenici della proteina.
RIDOTTA ELIMINAZIONE RENALE
La proteina derivatizzata ha una
maggiore dimensione che ostacola
la filtrazione glomerulare.
AUMENTO DELLA RESISTENZA METABOLICA
Le catene di PEG costituiscono uno scudo
protettivo nei confronti degli enzimi
proteolitici.
ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA
L’Interferone alfa-2a (Roferon®) di Hoffman- La Roche è stato approvato dalla FDA nel
1984 per il trattamento dell’epatite C cronica mediante somministrazioni sottocutanee da
ripetersi 3 volte alla settimana per un periodo di 11-12 mesi.
Nel 2002 è stata lanciata una seconda generazione di interferone coniugato con catene di
PEG ramificato (PM 43 KDaltons) noto come Pegasis® (Interferone alfa-2a pegilato)
Il Pegasis® ha mostrato un efficacia clinica di gran lunga superiore al Roferon A® come
conseguenza del rilascio controllato del farmaco che determina livelli sistemici costanti di
interferon alfa-2a. Un ulteriore vantaggio è il miglioramento della compliance del paziente per
effetto di una sola somministrazione alla settimana contro le tre del Roferon A®.
ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA
LINKER
PEG
PEPTIDE
PEGINESATIDE è un peptide sintetico PEGilato. Imita la struttura dell’eritropoietina, la
glicoproteina umana che promuove lo sviluppo di globuli rossi.
ERITROPOIETINA
ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA
PEGVISOMANT (SOMAVERT)
È una proteina contenente 191 residui amminoacidici legata covalentemente a diversi
polimeri di polietilene glicole. Progettato per bloccare il recettore dell'ormone della
crescita. E‘ prodotto utilizzando batteri E. coli geneticamente modificati.
ESEMPI DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGILATE IN TERAPIA
Indicato nel trattamento dell'ipercalcemia associata a tumori maligni, iperparatiroidismo ed
intossicazione da calcio. Come tale ha un’emivita di circa 3 ore mentre la CALCITONINA
PEGILATA ha un’emivita di 15 ore
POSSIBILI SVANTAGGI DELLA PEGILAZIONE
• Perdita di attività
• Il PEG non è biodegradabile
ALTRI APPROCCI DI CONIUGAZIONE CON POLIMERI IDROFILI
BIODEGRADABILI
STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI:
PEPTIBODY
Un’altra strategia per migliorare le caratteristiche farmacocinetiche di un farmaco
peptidico è quella di innestare peptidi sulla regione Fc di una immunoglobulina G
(IgG). Questi peptidi fusi, sviluppati per la prima volta da Amgen sono stati chiamati
peptibodies e rappresentano una nuova classe terapeutica.
L’approccio fornisce una lunga emivita in circolo del peptide terapeutico
PEPTIBODY IN TERAPIA
ROMIPLOSTIM (NPLATE)
Nplate viene utilizzato negli adulti affetti da porpora trombocitopenica
immunitaria (PTI) cronica, una malattia in cui il sistema immunitario del paziente
distrugge le piastrine.
Emulando l'azione della trombopoietina, romiplostim stimola la produzione
di piastrine, aumentando la conta di piastrine nel sangue. Romiplostim non ha
sequenze amminoacidiche omologhe con quelle della TPO endogena.
Nplate deve essere somministrato una volta alla settimana mediante
iniezione sottocutanea
PEPTIBODY IN TERAPIA
ROMIPLOSTIM (NPLATE)
STRATEGIE PER INCREMENTARE LE PROPRIETÀ FARMACOCINETICHE DI PEPTIDI:
FUSIONE CON ALBUMINA
ALBUMINA
L’albumina è la proteina plasmatica del peso approssimativo di 67kDa.
Ha un’emivita di 19 giorni.
La fusione di una proteina terapeutica con albumina ne aumenta l’emivita plasmatica.
PROTEINE FUSE CON ALBUMINA IN TERAPIA
Albiglutide (Eperzan o Tanzeum)
Agisce legandosi ai recettori di una sostanza,
denominata peptide glucagone-simile 1 (GLP1), che si trovano sulla superficie delle cellule
del pancreas, stimolandoli a rilasciare insulina.
La fusione con albumina porta l’emivita
plasmatica del peptide da poche ore a giorni.
Richiede somministrazione sottocutanea
settimanale.
Perché le strategie PEPTIBODY e di fusione con ALBUMINA allungano l’emivita
plasmatica di una proteina terapeutica?
FcRn (Neonatal Fc receptor) o recettore di Brambell, è un recettore per la regione
costante delle immunoglobuline
PEPTIDOMIMETICI
PEPTIDOMIMETICI: DEFINIZIONE
Peptidi modificati chimicamente con caratteristiche strutturali
analoghe a quelle dei peptidi naturali ma con migliori proprietà
farmacologiche tra cui un’aumentata stabilità in vivo per una
MAGGIORE RESISTENZA ALLE PEPTIDASI
Alcune altre proprietà, come la selettività recettoriale o la
potenza, spesso possono essere notevolmente migliorate
rispetto al peptide di riferimento.
Quindi i peptidomimetici hanno un grande potenziale nel
campo della drug discovery.
PEPTIDOMIMETICI: COSA MIMANO
Un qualsiasi peptide di varia origine che svolga una funzione
biologica di possibile interesse farmaceutico e di cui si conosca
l’esatta sequenza amminoacidica:
• Peptidi endogeni umani
• Peptidi di origine vegetale
• Peptidi di origine batterica
• Peptidi di origine animale
AZIONE BIOLOGICA
PEPTIDOMIMETICI
La modifica chimica di un peptide ne cambia sia la struttura primaria che quella
secondaria e terziaria. Entrambi gli aspetti contribuiscono alla stabilizzazione in
quanto gli enzimi responsabili della degradazione riconoscono sia la sequenza
amminoacidica che la struttura tridimensionale di un peptide.
La modifica chimica può essere fatta al fine di
favorire la conformazione bioattiva e sfavorire
conformazioni che invece sono soggette a
degradazione enzimatica
La modifica chimica può essere fatta al
fine di mascherare le sequenze
riconosciute dalle peptidasi
PEPTIDOMIMETICI
Tutte le possibili modifiche della sequenza peptidica per
l’ottenimento di un peptidomimetico sono quindi finalizzate a:
• Imporre delle restrizioni conformazionali
• Modificare la catena laterale degli amminoacidi
• Modificare il backbone e in particolare il legame ammidico
Come stabilire quale parte della molecola è possibile
modificare senza perdere attività biologica?
Dobbiamo conoscere il FARMACOFORO
FARMACOFORO
È la più piccola unità strutturale della molecola di un farmaco responsabile
della sua attività biologica.
E’ la regione che media l’attività biologica in quanto identifica la superficie
tridimensionale coinvolta nell’interazione con il recettore.
RECETTORE
In un farmaco peptidico/proteico questa può comprendere sia una
sequenza di amminoacidi vicini tra loro che residui amminoacidici separati
tra loro nella sequenza lineare del peptide che però si trovano ad essere
vicini nella struttura tridimensionale della conformazione bioattiva
FARMACOFORO
Catene laterali
1
2
3
4
5
6
H2N
COOH
4
2
3
1
Legami ammidici labili
3
1
5
5
R
MODELLO FARMACOFORICO
H2N
COOH
R
RECETTORE
6
In cui si irrigidiscono i residui fondamentali
in scheletri molecolari con migliore
resistenza rispetto al peptide
IDENTIFICAZIONE DEL FARMACOFORO
CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X
Idealmente, l’analisi delle strutture cristalline mediante cristallografia a raggi X fornisce
conferma accurata e visiva di residui amminoacidici coinvolti all'interfaccia ligando
recettore. Tuttavia, l'ottenimento di strutture cristalline è lento, impegnativo e non è
sempre applicabile. Inoltre, una singola struttura cristallina può rivelare solo una delle
possibili conformazioni in equilibrio di un peptide.
RISONANZA MAGNETICA
Se effettuata sul complesso peptide-recettore può fornire indicazioni su quali residui
amminoacidici siano coinvolti nel legame.
MODELLISTICA MOLECOLARE
Il docking molecolare, nel campo della modellistica molecolare, è un metodo che predice
l'orientamento preferito di un ligando verso una recettore quando questi si legano fra di
loro per formare un complesso stabile.
STUDIO SAR
Gli studi di relazione struttura-attività (SAR) possono identificare i principali farmacofori e i
residui chiave che sono responsabili per l'effetto biologico. È l’approccio più veloce e di più
semplice applicazione.
SAR: IDENTIFICAZIONE DELLA MINIMA SEQUENZA ATTIVA
Lo studio di relazione struttura-attività (SAR) può definire in una prima fase la minima
sequenza attiva del peptide di interesse.
PEPTIDE DI INTERESSE
N- e C-terminal truncation
or deletion approach
IDENTIFICAZIONE DEL FARMACOFORO: ALANINE SCANNING
La sistematica sostituzione nella sequenza primaria con un residuo di Alanina
(Ala-scan), permette di avere informazioni riguardo l’importanza delle singole
funzioni chimiche degli aminoacidi per l’interazione recettoriale. L’alanina
è utilizzata in quanto presenta un gruppo metilico non ingombrato chimicamente
e inerte. Questa tecnica è rapida, perché molte catene laterali vengono
analizzate simultaneamente.
Peptide Scanning for Studying Structure-Activity
Relationships in Drug Discovery
D-SCAN
La sostituzione sistematica di
ogni residuo con il suo
enantiomero fornisce
informazioni sull'importanza
della configurazione di ogni
amminoacido in termini di
attività biologica
Prolina SCAN
N-CH3 SCAN
La sostituzione sistematica del
gruppo NH del legame ammidico
con CH3 aiuta a definire
l’eventuale coinvolgimento in
ponti H con il recettore.
La scansione con prolina
è stata utilizzata per
studiare la relazione tra
conformazione e attività
in quanto la prolina
tende a favorire
determinate
conformazioni.
INFORMAZIONI PROVENIENTI DALLO STUDIO SAR
Uno studio SAR può portare ad avere indicazioni riguardanti:
•
•
•
•
•
LA SEQUENZA MESSAGE
LA SEQUENZA ADDRESS
I REQUISITI STEREOCHIMICI DI OGNI SINGOLO AMMINOACIDO
HOT SPOTS
POSSIBILE CONFORMAZIONE BIOATTIVA
ADDRESS
MESSAGE
PROGETTAZIONE PEPTIDOMIMETICI
MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE
INFORMAZIONI SAR
1. Restrizioni conformazionali
2. Modifiche della catena laterale degli
amminoacidi
3. Modificare il backbone e in particolare il
legame ammidico
CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI
PEPTIDE DI PARTENZA
PONTI DISOLFURO
LATTAMI
CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI
A
B
C
B
A
C
CICLIZZAZIONE DI PEPTIDI LINEARI
La Bifalina è un peptide oppioide dimerico (Tyr-Ala-Gly-Phe-NH)2. La presenza di due
distinti farmacofori conferisce alla Bifalina un'elevata affinità sia per i recettori oppioidi μ
che per i δ mostrando quindi un'attività analgesica.
IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO
Incorporazione di amminoacidi non naturali conformazionalmente vincolanti. Gli
amminoacidi metilati in varie posizioni e gli amminoacidi ciclici hanno come
effetto quello di restringere severamente la rotazione attorno ai legami phi e psi.
AMMINOACIDI METILATI
β
α
AMMINOACIDI CICLICI
Atc
IRRIGIDIMENTO LOCALIZZATO
Gli amminoacidi N-metilati hanno come effetto quello di restringere severamente la
rotazione attorno ai legami phi e psi.
MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE INFORMAZIONI SAR
1. Restrizioni conformazionali
2. Modifiche della catena laterale degli
amminoacidi
3. Modificare il backbone e in particolare il
legame ammidico
INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI NON NATURALI
INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI GLICOSILATI
(glicopeptidi)
La glicosilazione di peptidi porta a
•
aumentare la stabilità metabolica in quanto maschera le catena laterali;
•
ostacolare processi di ossidazione;
•
facilitare il trasporto attivo di composti modificati attraverso le membrane cellulari
mediante interazione con trasportatori di glucosio sulla superficie delle membrane.
β-D-Glucosio
Ser
Ser
INTRODUZIONE DI AMMINOACIDI GLICOSILATI
(glicopeptidi)
derivato dell’encefalina
non glicosilato
derivato dell’encefalina
glicosilato
Il derivato glicosilato dell’encefalina 2, produce effetti analgesici anche se
somministrato a livello periferico in topi.
INTRODUZIONE DI D-AMMINOACIDI
INTRODUZIONE DI D-AMMINOACIDI
H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
La dermorfina è un epta-peptide isolato per la prima volta dalla pelle di
alcune rane del sudamerica.
MODIFICA DEL PEPTIDE IN BASE ALLE INFORMAZIONI SAR
1. Restrizioni conformazionali
2. Modifiche della catena laterale degli
amminoacidi
3. Modificare il backbone e in particolare il
legame ammidico
SOSTITUZIONI DEL LEGAME PEPTIDICO CON
BIOISOSTERI DEL LEGAME AMMIDICO
Il concetto di BIOISOSTERIA
Friedmann (1951) definisce bioisosteri gruppi funzionali aventi analogie
chimiche e fisiche e che quindi producono effetti biologici spiccatamente
simili
Depsipeptidi
La sostituzione isosterica di almeno un gruppo amminico in catena peptidica da un
atomo di ossigeno porta alla formazione di depsipeptidi. Questi sono in pratica
peptidi in cui uno o più legami ammidici sono sostituiti da un gruppo estereo.
L’ eliminazione dei gruppi NH porta ad una riduzione della capacità di donare legami
idrogeno provocando variazioni conformazionali importanti.
Hanno strutture più flessibili in quanto il legame estereo è meno rigido del legame
peptidico.
Depsipeptidi
A
B
Romidepsin, noto anche come Istodax, è un agente antitumorale utilizzato in
terapia per il trattamento di alcune forme di linfoma.
Romidepsin è un prodotto naturale ottenuto da un batterio, e agisce bloccando
gli enzimi noti come istone deacetilasi, in tal modo inducendo l'apoptosi.
Tiodepsipeptidi
La sostituzione dell'azoto ammidico da un atomo di zolfo genera una nuova
classe di peptidi noti come tiodepsipeptidi. Tiodepsipeptidi macrociclici sono stati
isolati da fonti naturali e hanno trovato applicazioni preziose in medicina.
Sostanza naturale antitumorale
AZAPEPTIDI
La sostituzione del carbonio α di un amminoacido di un peptide con
azoto genera una nuova classe di composti chiamati azapeptidi. Sono
analoghi semicarbazidici dei corrispondenti peptidi. La sostituzione provoca
cambiamenti significativi sia chimici che relativamente alle proprietà
biologiche del peptide di riferimento. Questa sostituzione elimina la chiralità
del residuo modificato.
ATAZANAVIR
Anti HIV
ISOSTERI DEL LEGAME AMMIDICO
RETROPEPTIDI E PEPTIDI RETROINVERSI
Si definisce retropeptide un peptidomimetico in cui uno o più legami peptidici CONH- è sostituito da -NHCO-. Se anche le configurazioni dei centri alfa-chirale sono
invertiti, allora peptide viene definito retroinverso.
INTRODUZIONE DI β-AMMINOACIDI
RIASSUNTO MODIFICHE LEGAME AMMIDICO
PEPTIDOMIMETICI DI TIPO I:
Sono anche noti come pseudo-peptidi e hanno una sequenza
amminoacidica modificata rispetto a quella dei composti peptidici di
riferimento ma mantengono la parte bioattivo responsabile
dell’interazione con il sito di legame con il recettore.
PEPTIDOMIMETICI DI TIPO II:
Questo tipo di peptidomimetici sono in realtà delle small-molecules che si
legano al recettore del peptide progenitore con cui condividono solo
alcune analogie strutturali