METALLOPROTEINE COME CATALIZZATORI BIOLOGICI
Alla realizzazione di questo progetto concorreranno cinque Unità Operative, in cui sono
localizzati i gruppi di ricerca con competenze specifiche e complementari, in particolare:
Unità Operativa dell’Università di Roma Tor Vergata,
Unità Operativa dell’Università di Pavia,
Unità Operativa dell’Università di Firenze,
Unità Operativa dell’Università di Napoli “Federico II”,
Unità Operativa dell’Università di Roma “La Sapienza”.
Unità Operativa dell’Università di Roma Tor Vergata
L’Unità Operativa dell’Università di Roma Tor Vergata intende svolgere il suo progetto sulle
seguenti direttrici:
- Perossidasi di origine vegetale ed animale
- Folding/unfolding di emoproteine
- Metalloproteinasi e metallopeptidasi
Perossidasi di origine vegetale ed animale
L’indagine intende focalizzarsi sull’espressione della forma ricombinante dell’eosinofilo
perossidasi (EPO) umana sia nella forma “wild type” che di mutanti sito-specifici. Tale proteina è di
estrema importanza funzionale, in quanto svolge un ruolo di antibatterico durante i processi
infiammatori, ossidando dei substrati naturali molto comuni, quali cloruri (producendo ipocloriti),
bromuri (producendo ipobromiti) e tiocianati (producendo ipotiocianiti) (1). Inoltre, essa sembra
essere coinvolta, tramiti questi prodotti, nell’attivazione di enzimi della matrice extracellulare, che
oltre a processare molecole coinvolte nei processi infiammatori, quali citochine e chemochine, sono
coinvolti in processi angiogenetici (2). Tale proteina, che agisce insieme alla mieloperossidasi
(MPO), anch’essa disponibile al nostro gruppo, viene attualmente espressa in Pichia pastoris, ma si
intende caratterizzare le proprietà funzionali e strutturali di questa proteina ricombinante, che noi
abbiamo espresso per primi, e di caratterizzarne meglio il ruolo in sistemi cellulari modello, quali
neutrofili e linfociti. In questo ambito, si prevede di effettuare un’indagine sull’evoluzione
temporale di alcuni metaboliti cellulari, mediante HPLC, a seguito dell’induzione dell’attività
perossidasica. Inoltre, si intende proseguire nella caratterizzazione di perossidasi fungine, di cui
sono disponibili anche dei mutanti sito-specifici (3). Su tali molecole si intende completare lo studio
del ruolo funzionale dei residui aminoacidici dell’intorno dell’eme.
Folding/unfolding di emoproteine
Si intende effettuare una serie di indagini sui processi di folding/unfolding di mioglobina e di
citocromo c sia in soluzione che in matrice sol-gel. In particolare, per quanto riguarda la
mioglobina, si intende indagare sull’effetto del pH, della forza ionica e di un denaturante quale la
guanidina-idrocloruro sulle cinetiche di unfolding della oloproteina sia in soluzione che in sol-gel.
Per quanto riguarda il citocromo c, invece l’attenzione sarà posta sulle cinetiche di “refolding” in
soluzione attraverso la diluizione del denaturante o il salto di pH. Inoltre, la possibilità di avere
frammenti del citocromo c e mutanti sito-specifici permetterà di indagare sul ruolo di specifici
residui o domini strutturali sulla dinamica di “refolding” della proteina, così da chiarire meglio il
ruolo di leganti alternativi dell’eme durante il processo di “refolding” (4).
1
Metalloproteinasi e metallopeptidasi
Le MetalloProteinasi e MetalloPeptidasi sono coinvolte in molti processi sia fisiologici che
patologici. In particolare, vogliamo focalizzarci su:
1) MetalloProteinasi di matrice coinvolte nei processi metastatici ed angiogenetici
Le MetalloProteinasi di matrice (MMPs) sono una famiglia di enzimi coinvolti in numerosi
processi fisiologici e patologici concernenti la matrice extracellulare (ECM), quali lo sviluppo,
l’infiammazione, la crescita e l’invasività tumorale. Attualmente, sono state identificate 22 MMPs
umane (5), le quali presentano le seguenti omologie strutturali: un peptide segnale, un dominio
propeptidico, un dominio catalitico (contenente l’atomo di Zn++ catalitico coordinato a 3 His) ed un
dominio emopessina-simile (collegato al dominio catalitico da una regione a cerniera). L’azione
enzimatica delle MMPs è cruciale per l’attuarsi della crescita ed invasione tumorale e per qualsiasi
forma di infiammazione acuta e/o cronica (6). Le MMPs sono secrete in quantità particolarmente
elevata da parte delle cellule tumorali di un’ampia varietà di tumori maligni (7) e, in misura minore,
anche da cellule non neoplastiche. Tuttavia, alcune MMPs, quali la MMP-13, MMP-14 e MMP-7,
sono secrete solo da cellule trasformate (8), quindi sono dei marcatori specifici di trasformazione
neoplastica, e la MMP-2, la cui secrezione è in genere associata ad una prognosi infausta in molti
processi tumorali (9). Nel caso delle gelatinasi, sia la MMP-2 che la MMP-9 sono associate allo
sviluppo angiogenetico necessario per la diffusione metastatica (10,11).
Il processo di attivazione della (pro)MMP-2 si attua attraverso la formazione di un composto
ternario tra la (pro)MMP-2, il TIMP-2 (un inibitore naturale delle MMPs) e la MMP-14 (12). In tale
interazione il TIMP-2 funge da ponte fra la (pro)MMP-2, il cui dominio emopexinico lega il
dominio C-terminale del TIMP-2 (13) e la MMP-14, che interagisce con il dominio N-terminale del
TIMP-2 (14). L’attività angiogenetica della MMP-2 attivata è fortemente inibita dall’endostatina
(15) e questo permette di correlare l’attività angiogenetica della MMP-2 e quella antiangiogenetica
dell’endostatina (16). L’endostatina viene prodotta dal processamento del Collagene XV e del
Collagene XVIII e possiede caratteristiche antiangiogenetiche molto simili a quelle
dell’angiostatina (17), la quale viene prodotta dal processamento del plasminogeno. Questi
processamenti sono effettuati da proteasi sia a serina che metalloproteasi; in particolare, la
produzione di angiostatina da plasminogeno avviene principalmente da parte della metalloelastasi
MMP-12 (18). Quindi, il processo angiogenetico è il risultato di un bilanciamento positivo e
negativo fra l’attività di diverse metalloproteinasi. L’interazione fra queste metalloproteinasi e le
proteine che le attivano o che fungono da substrati è estremamente importante per comprendere la
regolazione e l’evoluzione dell'angiogenesi.
La nostra Unità Operativa dedicherà la sua attività alla comprensione delle interazioni fra
(pro)MMP-2, TIMP-2 e MMP-14 (MT1-MMP), al fine di chiarire i meccanismi di modulazione di
queste interazioni nel processo di attivazione della MMP-2. Si intende investigare tali interazioni,
seguendo il segnale di fluorescenza correlato al processamento di substrati sintetici fluorogenici. Lo
studio prevede la determinazione dei parametri termodinamici e cinetici di tali interazioni in
funzione del valore di pH in un ambito fisiologicamente ragionevole tra 5 e 10, utilizzando sia un
fluorimetro che l’apparato di mescolamento rapido (stopped-flow), che sono già disponibili
all’Unità. Una volta ottenute informazioni concernenti l’interazione dei complessi binari
(pro)MMP-2:TIMP-2 e MMP-14:TIMP-2 si passerà all’analisi termodinamica e cinetica della
formazione del complesso ternario, necessario per l’attivazione della MMP-2. Lo studio, che verrà
effettuato in diverse condizioni di pH e temperatura, consisterà nel far reagire un complesso binario
con il terzo componente rispettivamente (cioè (pro)MMP-2:TIMP-2 + MMP-14, MMP-14:TIMP-2
+ (pro)MMP-2 e (pro)MMP-2:MMP-14 + TIMP-2), seguendo poi il processo interattivo sempre
tramite la fluorescenza collegata al processamento di substrati sintetici fluorogenici. Una volta
2
ottenute le necessarie informazioni funzionali sulla formazione del complesso ternario in soluzione,
si prevede anche l’estensione alla successiva attivazione di (pro)MMP-2 a MMP-2 attivata.
Inoltre, si intende studiare dal punto di vista termodinamico e cinetico l’interazione, in
funzione di pH e temperatura, di angiostatina ed endostatina sia con MMP-2 che con MMP-14, al
fine di determinare i parametri funzionali ed il meccanismo con cui tali molecole interferiscono con
l’attività delle MetalloProteinasi, inibendo il processo angiogenetico connesso con l’attività di
MMP-2. Tali misure, che verranno inizialmente effettuate utilizzando substrati sintetici
fluorogenici, verranno quindi estese a substrati naturali, quali collagene I, collagene IV,
fibronectina, laminina V e vitronectina, in modo da evidenziare meglio su quali processi enzimatici
tali molecole vanno ad interferire.
2) MetalloPeptidasi cerebrali
La carnosina è un dipeptide costituito dall’unione fra β-alanina ed istidina, è localizzato
ubiquitariamente con particolare abbondanza nel muscolo e nel cervello, dove può raggiungere
concentrazioni fino a 20 mM (19,20). La carnosina non deriva dall’idrolisi di precursori proteici o
peptidici a più alto peso molecolare, ma viene sintetizzata dall’enzima carnosin-sintetasi (21) e
degradata dall’enzima carnosinasi (22). Questo enzima, che appartiene alla classe delle
metalloproteinasi, è sintetizzato in due isoforme, una presente inmolti tessuti non cerebrali, ed una,
che ha una specificità quasi totale per la carnosina, che è sintetizzata solo nei tessuti cerebrali
(23,24). Assai recentemente si è sequenziato il cDNA dei due geni che codificano le due isoforme
della carnosinasi (25), permettendo la determinazione della sequenza aminoacidica delle due
proteine. Si sono così definitivamente mostrate le caratteristiche strutturali che permettono di
assegnare con certezza l’appartenenza della carnosinasi alla classe delle metalloproteinasi.
Infine, si intende studiare l’attività di questo enzima nei confronti della carnosina, al fine di
caratterizzarne i parametri catalitici in varie condizioni di pH e temperatura.
Unità Operativa dell’Università di Pavia
Enzimologia di metalloproteine
Nel corso del prossimo triennio verranno espansi gli studi su eme proteine e rame proteine
condotti nel triennio scorso, la ricerca verrà in generale indirizzata sempre di più verso aspetti che
possono avere rilevanza in campo medico o farmacologico.
Come prosecuzione degli studi sulla nitrazione di proteine prodotta da specie reattive all’azoto
si esaminerà la nitrazione della mioglobina umana, la cui espressione in E. coli è stata già messa a
punto nel nostro laboratorio, e di suoi mutanti. Come è noto, la mioglobina umana differisce dalle
altre per la presenza di un residuo di cisteina, che è esposto e può quindi essere implicato nella
reazione di nitrazione. Il sistema di nitrazione studiato dal nostro gruppo si basa sulla coppia
nitrito/perossido di idrogeno, che in seguito ad attivazione da parte del gruppo ferro-eme, in
reazioni di tipo perossidasico, produce come specie nitranti, a seconda delle condizioni, biossido di
azoto o un perossinitrito legato (26,27). La capacità nitrante viene esibita sia verso substrati esogeni
sia, in assenza o a basse concentrazioni di questi, verso il gruppo eme e residui proteici quali
tirosine e triptofani (26-28). Lo studio verrà esteso anche alla emoglobina umana, esaminando in
particolare il comportamento delle singole catene alfa e beta che formano il tetramero. Sempre
nell’ambito della chimica delle eme proteine, l’attuale studio sui mutanti della mioglobina
ricostituiti con gruppi eme modificati, che incrementano in modo apprezzabile l’attività catalitica
ossidativa (29,30) verrà esteso alla ricostituzione della proteina con nuovi derivati eminici, in grado
di amplificare ulteriormente la capacità catalitica e gli effetti di stereoselettività nelle reazioni verso
substrati esterni. Verrà infine aperto un nuovo filone di indagine sulle eme proteine, con la
3
produzione di mutanti del citocromo c da lievito, la cui espressione in E. coli è ormai disponibile
nel nostro gruppo. Si vuole verificare se l’ingegnerizzazione del citocromo c, con un diverso folding
rispetto alle globine, sia potenzialmente più adatta ad ottenere proteine con attività catalitica. Come
è consuetudine nel nostro gruppo, gli studi sulle eme proteine verranno accoppiati a indagini su
sistemi modello, che in questo caso si basano su complessi eme-peptidici sintetici o ricavati dalla
digestione controllata del citocromo c (31,32).
Nel campo dello studio dei rame enzimi si intende approfondire il meccanismo molecolare di
azione della tirosinasi, del quale non si ha alcuna evidenza diretta. A questo scopo ci si propone di
effettuare studi a temperature criogeniche in solvente misto acquoso-organico. Verranno esaminate
varie miscele solventi criogeniche scegliendo quella che garantisce un optimum di funzionamento
dell’enzima. Quindi si effettueranno misure spettroscopiche a basse temperature (fino a -80 °C)
sulle varie forme dell’enzima (ossigenata, ossidata) in presenza e in assenza di substrati fenolici e
catecolici. In queste condizioni l’attività enzimatica dovrebbe essere parzialmente o completamente
bloccata, ma comunque sufficientemente lenta da consentire l’osservazione dei complessi enzimasubstrato. Queste indagini saranno accoppiate a studi paralleli, condotti nelle stesse condizioni, su
sistemi modello della tirosinasi costituiti da complessi binucleari di rame con leganti poliazotati,
che tradizionalmente sono uno dei punti di forza dell’attività del nostro gruppo (33-35), che
dovrebbero consentire di caratterizzare in modo più dettagliato, anche a livello strutturale, il modo
di legame dei substrati.
Un nuovo campo di indagine che si intende aprire utilizzando la tirosinasi è quello sulla
modificazione di residui di proteine da parte dei derivati chinonici prodotti dalla reazione di
ossidazione della dopammina e del suo precursore L-dopa. Questo tipo di modificazione può
avvenire a carico dei residui polari di lisina, istidina, cisteina, serina, tirosina e triptofano esposti
della proteina bersaglio e può indurre modificazioni conformazionali locali e globali di questa,
causandone l’inattivazione. Si ritiene che questa modificazione possa contribuire ai processi di
misfolding e fibrillazione di alcune proteine coinvolte in patologie neurodegenerative quali i morbi
di Alzheimer e di Parkinson. Per caratterizzare gli addotti chinonici delle proteine si sfrutterà
inizialmente l’ossidazione enzimatica dei fluorofenoli, che risulta più facilmente controllabile a
causa del sostituente fortemente elettron attrattore presente sul nucleo aromatico, la quale è stata
studiata in dettaglio recentemente dal nostro gruppo (36). In alternativa alla tirosinasi altri enzimi
possono partecipare alla formazione di derivati chinonici da substrati catecolici, particolarmente le
eme perossidasi, in condizioni di stress ossidativo, e la ceruloplasmina. Anche in questo caso studi
su modelli di basso peso molecolare potranno servire a chiarire aspetti meccanicistici e strutturali
delle reazioni di modificazione delle proteine.
Unità Operativa dell’Università di Firenze
Il Laboratorio di Chimica Bioinorganica del Dipartimento di Chimica dell’Università di
Firenze è coinvolto da svariati anni nello studio ed utilizzo di sistemi enzimatici ossidativi coinvolti
in processi biodegradativi di sostanze aromatiche: ossigenasi ed ossidasi.
Questi enzimi, isolati e purificati da microrganismi quali Pseudomonas, Alcaligenes,
Rhodococcus, Streptomyces, Acinetobacter, Pleurotus, svolgono un ruolo chiave nella
biodegradazione di sostanze xenobiotiche; ad esempio, ossigenasi idrossilanti trasformano composti
aromatici in dioli rendendo l’anello aromatico suscettibile al successivo attacco di ossigenasi “ring
cleaving” che aprendo l’anello determinano la completa detossificazione di una grande varietà di
composti altamente nocivi per l’ambiente (37-40).
La nostra unità operativa è coinvolta nella caratterizzazione strutturale e meccanicistica di
alcuni di questi enzimi mediante tecniche cinetiche, spettroscopiche e cristallografiche,
fondamentale per la comprensione dei meccanismi di biodegradazione e bioconversione di
composti organici e per l’ottimizzazione di tali processi.
4
Oltre ad un forte interesse per le problematiche legate al disinquinamento ambientale mediante
tecniche biologiche, ha recentemente assunto particolare rilevanza il possibile utilizzo dei sistemi
enzimatici ossigenanti presenti in questi microorganismi nella produzione di “fine chemicals” di
difficile sintesi chimica. Quest’ultimo aspetto e’ principalmente legato al fatto che questi sistemi
enzimatici catalizzano la trasformazione di una varietà di sostanze aromatiche in composti chirali ad
alta purezza enantiomerica di estremo valore per la sintesi asimmetrica ed utili per la produzione di
una varietà di nuove molecole di interesse farmaceutico ecc. (41).
Molti nostri studi sono stati focalizzati sull’ottimizzazione di reattori microstrutturati che
hanno permesso di ottenere alte velocità di conversione ed alte rese finali per i prodotti ossigenati
da svariati idrocarburi quali naftalene, antracene, fenantrene, toluene, xileni ecc utilizzando ceppi
batterici naturali o geneticamente modificati esprimenti le ossigenasi d’interesse. Tali sistemi hanno
consentito di misurare con alte riproducibilità e precisione l’influenza di ciascun fattore che
controlla il processo (concentrazione delle cellule, loro vitalità, livello di espressione enzimatica,
concentrazione del substrato ecc.) e quindi ottimizzare il valore di ciascun parametro. Si è inoltre
evidenziato e razionalizzato l’effetto protettivo di vari tensioattivi non ionici nei confronti della
documentata tossicità di molti idrocarburi aromatici sui microrganismi investigati (42).
Un secondo gruppo di enzimi, le ossidasi fungine, posseggono, in termini di capacità
ossidative, proprietà catalitiche complementari a quelle delle ossigenasi batteriche (43). Sono
coinvolte in una moltitudine di processi di biotrasformazione che spaziano dalla conversione di una
varietà di molecole tossiche in composti utili (a tossicità altamente ridotta) a processi di
detossificazione coinvolgenti la formazione di polimeri stabili. L’utilizzazione di ossidasi (in
particolare le ossidasi fungine) per la biodegradazione di pesticidi, fenoli, coloranti ecc. è un
argomento di crescente interesse.
Recenti studi del nostro laboratorio sono tesi ad ottimizzare processi che sfruttano l’uso
combinato di laccasi fungine da Pleurotus ostreatus e monoossigenasi batteriche in sistemi
microcompartimentalizzati per biodegradazioni ad ampio spettro di azione.
Unità Operativa dell’Università di Napoli “Federico II”
Gli obiettivi di questo programma di ricerca sono :
1) progettazione, sintesi e caratterizzazione di peptidi/peptidomimetici capaci di interferire con
il riconoscimento molecolare tra MMP-2, TIMP-2 e MMP14;
2) progettazione, sintesi e caratterizzazione di peptidi/peptidomimetici capaci di interferire con
il riconoscimento molecolare tra MMP-2 (e/o MMP-14) e angiostatina (e/o endostatina);
3) progettazione, sintesi e caratterizzazione di peptidi/peptidomimetici carnosina-simili;
4) caratterizzazione strutturale in soluzione (NMR) e/o allo stato solido (diffrazione di raggi x)
dei complessi binari e/o ternari tra MMP-2, TIMP-2 e MMP14;
5) caratterizzazione strutturale in soluzione (NMR) e/o allo stato solido (diffrazione di raggi x)
dei complessi tra MMP-2 (e/o MMP-14) e angiostatina (e/o endostatina);
6) caratterizzazione strutturale in soluzione (NMR) e/o allo stato solido (diffrazione di raggi x)
dell’enzima carnosinasi;
7) caratterizzazione strutturale in soluzione (NMR) e/o allo stato solido (diffrazione di raggi x)
dei complessi tra i peptidi sintetici ed i loro target.
La ricerca sarà articolata nelle seguenti fasi
I Fase
Nella prima parte inizierà la progettazione delle molecole peptidiche per quei sistemi
molecolari di cui sono disponibili in letteratura i dati strutturali e funzionali. In particolare, verrà
analizzato il riconoscimento molecolare tra MMP-2, TIMP-2 e MMP14 al fine di determinare le
proprietà strutturali e chimico-fisiche delle proteina target, dei suoi inibitori naturali e sintetici, e
5
dell’interfaccia di riconoscimento proteina-proteina. Queste informazioni permetteranno di definire
diverse famiglie di sequenze peptidiche e di costruire i corrispondenti modelli molecolari. Questi
ultimi verranno raffinati mediante cicli di minimizzazione energetica e dinamica molecolare, in
solvente in presenza del recettore, così da verificare la tenuta conformazionale delle nuove
molecole. Contemporaneamente inizierà lo studio dei sistemi MMP-2 (e/o MMP-14) e angiostatina
(e/o endostatina).
La prima serie di composti per il sistema MMP-2/TIMP-2/MMP14 verranno, quindi,
sintetizzate in fase solida. La strategia sintetica verrà opportunamente modificata rispetto alle
procedure standard qualora si dovessero sintetizzare sequenze che causano l’aggregazione del
peptide in crescita sulla resina o nel caso in cui gli accoppiamenti siano particolarmente difficili. I
peptidi verranno analizzati e purificati mediante HPLC a fase inversa e l’identità verrà accertata
mediante spettrometria di massa MALDI-ToF. Le molecole con promettente attività biologica
saranno sintetizzate in quantità sufficienti per effettuare gli studi di tipo strutturale.
Per quei sistemi di cui non è nota la struttura tridimensionale, eventualmente, si cercherà di
ottenere dei modelli tridimensionali teorici a bassa risoluzione, ricorrendo a metodiche di homology
modeling, che permetteranno di formulare delle ipotesi per il riconoscimento molecolare.
II Fase
In questo periodo verranno sintetizzati i peptidi angiostatina- ed endostatina-simili progettati
nella fase precedente. I vari peptidi sintetizzati saranno preliminarmente caratterizzati in soluzione
mediante tecniche spettroscopiche come dicroismo circolare e spettrofluorimetria. In particolare, il
dicroismo circolare potrà fornire informazioni sulla conformazione assunta dalle varie molecole in
soluzione. Se l’interazione tra macromolecola e il peptide avviene con una variazione
conformazionale sarà possibile eseguire delle titolazioni per determinare le costanti di legame.
Analogamente l’interazione potrà essere monitorata mediante spettrofluorimetria se avviene con
variazione della fluorescenza di cromofori intrinseci.
In questa fase si prevede di iniziare gli studi strutturali in soluzione (NMR) ed allo stato solido
(diffrazione di raggi x). In soluzione saranno effettuati esperimenti in diversi sistemi solvente, sulle
proteine purificate e marcate con 15N e/o 13C, mettendo anche a punto sequenze mono e
bidimensionali. La caratterizzazione strutturale allo stato solido sarà eseguita effettuando
esperimenti di cristallizzazione in condizioni controllate di pH e di temperatura in vari sistemi
tampone. Una volta effettuato lo screening ed ottenuto cristalli di dimensioni adatte saranno
eseguite raccolte di dati di diffrazione di raggi-X anche a bassa temperatura, utilizzando un
diffrattometro quattro cerchi o un diffrattometro anodo rotante con image plate in dipendenza della
complessità della molecola studiata. Quindi, si procederà alla risoluzione della struttura con diverse
tecniche ed approcci metodologici e al successivo raffinamento deidati. In tutti i casi in cui non sarà
sufficiente per la raccolta dei dati la potenza fornita dal generatore ad anodo rotante si utilizzerà il
tempo macchina presso la linea di luce di sincrotrone ELETTRA, Trieste, cui questa unità ha
accesso.
Gli studi strutturali saranno effettuati anche sul sistema MMP-2 (e/o MMP-14) e angiostatina
(e/o endostatina). Analogamente, saranno effettuate le cristallizzazioni dei complessi delle molecole
di natura peptidica, per i quali è stata dimostrata la formazione di addotti stabili, con i propri target
proteici.
I risultati dell’ indagine strutturale insieme alle informazione di carattere biologico forniranno
la base per modificare le molecole bioattive, permettendo sia di migliorare la capacità di binding sia
di variare le proprietà chimico-fisiche (solubilità, stabilità in vivo) lasciando inalterate le proprietà
biologiche.
III Fase
Nell’ultima fase di questo progetto verranno progettati e sintetizzati dei nuovi peptidi
carnosina-simili. Se possibile si cercherà di cristallizzare l’enzima carnosinasi.
In questa fase si completerà la caratterizzazione strutturale in soluzione e/o allo stato solido dei
complessi tra i peptidi sintetizzati ed i loro target. Per quei sistemi peptidici per i quali fossero
6
disponibili le informazioni strutturali e/o funzionali si procederà alla fase di ottimizzazione del
ligando e quindi di sintesi delle nuove molecole in modo che siano più specifiche e che abbiano una
maggiore affinità. In tale fase le molecole bioattive saranno modificate, sulla base delle
informazioni di tipo strutturale e dei saggi biologici, utilizzando amminoacidi non naturali,
sintetizzando derivati ciclici, ramificati, retroinversi e peptidi in cui il legame peptidico è
modificato.
Unità Operativa dell’Università di Roma “La Sapienza”
Sistemi Tetraazoporfirinici come Modelli per Studi di Problematiche attinenti alla
Biochimica
E’ da lungo tempo che il gruppo si occupa dello studio di sistemi macrociclici tetrapirrolici ad
alta delocalizzazione elettronica quali le porfirine ed analoghi tetraazaporfirinici (ftalocianine,
porfirazine, etc.). Una delle linee di lavoro di maggiore interesse attuale, che fa seguito a sviluppi
già presenti nella letteratura più e meno recente (44), è quello di avere nuovi sistemi macrociclici
che abbiano buone proprietà di solubilità in acqua, premessa necessaria per poter affrontare
processi di tipo biochimico per i quali il mezzo acquoso costituisce la sede naturale di
svolgimento.
Il gruppo di lavoro si è di recente interessato alla costruzione in laboratorio di molecole
macrocicliche di tipo tetraazaporfirinico che per la loro struttura di base permettono di subire
trasformazioni chimiche adatte a renderle solubili in acqua. Un esempio di molecola di recente
studiata in modo approfondito è l’ottapiridinotetrapirazinoporfirazina, I, una macromolecola che è
costituita da un sistema centrale tetrapirazinoporfirazinico ad alta delocalizzazione elettronica con
anelli piridinici agganciati all’esterno. Attraverso processi di quaternarizzazione degli N atomi
piridinici si è potuto giungere alla specie supercarica ottacationica II. Sia la specie I che la specie
II (M = 2H), come i loro derivati metallici di metalli bivalenti di transizione e non, sono state
approfonditamente studiate in termini di stabilità come materiali solidi ed in soluzione; ne è stato
esaminato il comportamento spettroscopico UV-visibile per una interpretazione della loro struttura
elettronica ed è stato compiuto un approfondito studio del loro comportamento elettrochimico
(quest’ultimo solo per la specie I e relativi metallo-derivati). Della specie II e suoi metalloderivati è prevista a breve un’indagine elettrochimica per evidenziare un comportamento redox
che sarà interessante confrontare con quello dei corrispondenti prodotti non quaternarizzati.
N
N
N
N
N
H3C
H3C
N
N
N
N
N
+
N
N
N
N
N
N
N
+
N
I
CH3
N
N
N
N
CH3
N
M
N
N
NH
N
N
N
N
+
N
N
HN
N+
H3C
N
N
N
N
CH3
N
+
N
N
N
N
+
N
N
N
+
N
CH3 H3C
+
N
II
Le specie quaternarizzate acquosolubili sono molto interessanti per una prossima
programmazione di studi di possibili forme di contatto con biomolecole quali le metalloproteine o
gli acidi nucleici. E’ in corso uno studio preliminare per una rappresentazione completa di ciò che
7
è stato fatto in letteratura al riguardo, limitatamente ai sistemi porfirinici o ad analoghi macrocicli
porfirazinici. E’ recente un’indagine condotta su un sistema supercarico di tipo porfirazinico, il
2,3,7,8,12,13,17,18-ottakis(N-metil-4-piridiniumil)porfirazina (45), ed il suo binding al double
stranded calf thymus (CT) DNA (46), studi nei quali è stato messo in evidenza un forte legame del
macrociclo supercarico con lo stesso DNA.
Nell’esperienza del gruppo di lavoro rientrano anche progetti riguardanti la sintesi di
cosiddetti “sistemi a bassa simmetria “, dei quali è riportato un esempio qui di seguito.
+
N CH
3
+
H3C N
N
N
N
+
N
CH3
N
N
N
M
N
CH3
+
N
N
N
N
N
+
H3C
N
N
N
N
N
N
Se
N + CH3
III
I tentativi di giungere alla sintesi di questo macrociclo sono stati iniziati già da tempo. Da essi
emerge una grande difficoltà nell’isolamento e purificazione della corrispondente specie non
quaternarizzata, la tris(dipiridinopirazino)mono(seleno-diazolo)porfirazina. Il superamento delle
difficoltà di purificazione possono aprire la strada al processo di deselenazione dell’anello
selenodiazolico, con formazione di un gruppo esterno di tipo cis-diamminico in grado di
coordinare PtCl2 con l’ottenimento di un sistema di tipo cis-platino. Il successivo processo di
quaternarizzazione dei sei anelli piridinici esterni a dare la specie III, avente caratteristiche di
solubilità in H2O, risulterebbe nella formazione di una specie rappresentata schematicamente qui di
seguito (IV, M = 2H o metallo bivalente). Tale specie potrebbe essere adatta ad affrontare alcune
problematiche legate all’esame della sua risposta biochimica come agente anticancro.
N
N
N
N
N
M
N
N
NH 2
N
H2N
Pt
Cl
Cl
(IV)
8
Il gruppo di lavoro si propone altresì, nell’arco del triennio 2005-2007, di verificare la
possibilità di sviluppare una chimica innovativa legata alla presenza dei gruppi cis-diamminici sul
macrociclo porfirazinico per la preparazione di ulteriori specie macrocicliche solubili nel mezzo
acquoso.
L'uso della Spettroscopia d'Assorbimento dei raggi X (XAS) come mezzo utile ed unico per
la caratterizzazione strutturale di metalloproteine o proteine attivate da metallo e di composti
modello correlati.
La caratterizzazione strutturale e l'accurata determinazione delle proprietà geometriche dei siti
attivi delle proteine sono fondamentali per la comprensione della funzione e del meccanismo
catalitico presente. Per le metalloproteine o per i composti biologici attivati da metalli è importante
descrivere le correlazioni tra lo stato di coordinazione del metallo, lo stato elettronico del metallo e
la funzione della proteina o macromolecola.
Con campioni cristallini la Diffrazione a raggi X (XRD) può lasciare ambiguità sulla
coordinazione del metallo, specialmente alla presenza di piccole molecole leganti, o non legate o
parzialmente legate, e non può provare lo stato redox del metallo. L'uso della Radiazione di
Sincrotrone (SR) ha permesso la determinazione delle strutture XRD di proteine a risoluzione
atomica (dove i legami C-C sono visibili), ma è difficile l'applicazione della XRD a studi
conformazionali legati a fattori redox, di pH, di solvente, ed allosterici.
Con campioni non cristallini, tuttavia, è difficile estrarre accurate informazioni sui dettagli
strutturali dello stato di coordinazione anche con le usuali spettroscopie. Infatti, la spettroscopia
UV/Vis può essere poco sensibile alla presenza di una simmetria assiale e l'interpretazione
strutturale è dipendente dalla temperatura a causa delle vibrazioni nucleari. La correlata
spettroscopia di Risonanza Elettronica Paramagnetica (EPR) può rilevare dettagli strutturali solo a
bassa temperatura. La Spettroscopia di Risonanza Raman può essere molto sensibile all'intorno del
metallo, ma le frequenze Raman di stretching e bending metallo-legante ed i loro shifts solo in
pochi casi sono stati assegnati e correlati, senza ambiguità, con i legami e con variazioni della loro
lunghezza.
La Spettroscopia d'Assorbimento dei raggi X (XAS) è un'importante tecnica di SR che con lo
studio dello spettro d'assorbimento consente di investigare la struttura locale dei centri metallici nei
materiali.
XAS comprende sia la spettroscopia XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure), che
studia lo spettro d'assorbimento X della soglia fino a 50-100 eV, sia la spettroscopia EXAFS
(Extended X-ray Absorption Fine Structure), che analizza un'estesa regione d'energia sopra la
soglia. L'estensione della regione d'energia degli spettri XAS da 50-100 eV è limitata dal rapporto
segnale-rumore dei dati raccolti.
Le proprietà della sorgente di SR sono uniche e rendono la spettroscopia XAS unica.
Di seguito sono riportate le proprietà del mezzo XAS.
1) XAS è adoperabile in ogni stato fisico del campione.
2) XAS è adoperabile in qualsiasi condizione di intorno.
3) XAS può essere applicata a qualsiasi elemento (in principio) ed è elemento-specifica.
4) Elementi, silenti o difficili per le spettroscopie UV/Vis o EPR e NMR, sono accessibili a
XAS.
5) XAS è sensibile allo stato redox dell'elemento.
6) XAS è molto sensibile ai dettagli strutturali (coordinazione, simmetria complessiva,
distanze ed angoli di legame) ed è un indicatore di strutturale locale.
7) Gli spettri XAS alla soglia (regione XANES) non hanno diretta dipendenza dalla
temperatura (nessun effetto di vibrazione nucleare).
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Per tutte queste ragioni XAS può essere applicata per studiare sia la struttura geometrica ed
elettronica sia il comportamento dinamico di molti sistemi biologici e di composti modello correlati.
L'approccio XAS permette di determinare la struttura dei centri metallici a risoluzione subatomica
e permette di distinguere lo stato redox del centro metallico. Cambiando le condizioni di intorno,
differenti conformazioni del metallo modulate da stati d'equilibrio possono essere caratterizzate.
Dall'analisi dei dati sperimentali della regione EXAFS e maggiormente dalla regione XANES,
essendo le strutture XANES indicatori dell'ossidazione e dello stato di spin del metallo e della
struttura locale metallo-legante, è possibile ottenere la struttura geometrica del sito assorbitore entro
5-6 Å.
Molti dei primi studi EXAFS sono stati condotti con l'approccio dell'approssimazione a singola
diffusione (single scattering, SS), una teoria che è stata dimostrata essere errata specialmente nel
caso di siti attivi circondati da istidine. Per questo motivo negli anni sono apparse delle difformità
tra i risultati EXAFS e XRD. Il recente sviluppo di nuovi approcci analitici, basati sulla teoria a
diffusione multipla (multiple scattering, MS) di onde sferiche, permette di migliorare lo studio degli
spettri XAS e, oggi, parecchi avanzati programmi sono capaci di analizzare la regione EXAFS degli
spettri in modo soddisfacente (47-54).
Lo studio della regione XANES è difficile, dal momento che piccole differenze nella
geometria di coordinazione (cioè differenti conformazioni legate a variazioni d'angoli di legame o
movimenti di legante assiale attorno al centro metallico) possono produrre importanti cambiamenti
nella forma e nell'intensità delle strutture di soglia. Quindi, per razionalizzare quantitativamente i
segnali XAS nella regione di soglia degli spettri sperimentali d'assorbimento è necessario usare la
teoria di MS completo. Le difficoltà di un'analisi quantitativa completa degli spettri XANES
derivano, principalmente, dall'approssimazione teorica usata per il potenziale. Per questo motivo
l'analisi XANES è stata usata, in modo qualitativo, come un supporto agli studi EXAFS e correlata
a composti a struttura nota. Negli ultimi anni calcoli MS nella regione di soglia sono stati resi
possibili da differenti programmi di calcolo. L'abilità di analizzare in modo quantitativo o semiquantitativo la parte XANES di uno spettro XAS permette di ottenere una rappresentazione
strutturale completa del campione determinandone i dati strutturali come gli angoli di legame che
sono molto difficili da ottenere con l'EXAFS ed ad una risoluzione paragonabile a quella degli studi
di XRD. Molte applicazioni d'analisi XAS, con entrambi gli approcci EXAFS e XANES, sono state
presentate in questi anni (55-60). Tuttavia solo recentemente con una nuova procedura di calcolo,
chiamata MXAN (61), è stato possibile ottenere un completo fit geometrico anche per questa
regione in tempi di calcolo ragionevoli.
Recentemente abbiamo considerato e risolto alcuni aspetti fondamentali del sito binucleare a rame
di tipo 3 per i derivati met- e met-azide d'emocianine (Hcs) da Octopus vulgaris (mollusco) e
Carcinus aestuarii (artropode) a pH 7.5 (cioè corretti valori delle distanze Cu-Cu, distorsione
assiale se presente al sito a rame, presenza e tipo di gruppi a ponte) (62). In quel lavoro abbiamo
riportato risultati EXAFS di SS con il metodo a filtro di Fourier per la prima shell e risultati parziali
di un'analisi EXAFS di MS dell'intero spettro. Per confermare l'analisi della regione EXAFS è stato
anche riportato un approccio XANES qualitativo. L'accuratezza dell'analisi dei dati è stata testata
con i correlati composti modello dei sistemi leganti a poli(benzoimidazolo) 2-BB (63), L-5,5 e L6,6 (64), mononucleari e binucleari rispettivamente. Per il problema biologico connesso alla
caratterizzazione strutturale di questi derivati di Hcs e per le implicazioni biofisiche dei risultati
XAS ottenuti si rimanda a quello studio.
In un lavoro in pubblicazione (65) abbiamo presentato e focalizzato l'attenzione sui calcoli MS
che sono stati usati per raggiunger i risultati EXAFS delle forme met-Hc dei due phyla a pH 7.5 e
sulle possibilità aperte dai calcoli MS nella regione XANES (66). Per rifinire la modulazione
EXAFS dello spettro d'assorbimento abbiamo utilizzato un approccio composito ed avanzato con il
cui è stato possibile superare alcuni complessi problemi dovuti sia alla presenza di due atomi
assorbitori sia al fatto che nello spettro il contributo metallo-metallo si sovrappone ai segnali Cu-
10
His. Con calcoli XANES di MS è possibile estrarre informazioni quantitative dalla zona di soglia
dello spettro in modo da rifinire la struttura del sito anche nel caso di un centro binucleare.
Alla luce dei risultati attenuti con le simulazioni XANES di MS sulle forme met-Hc (65), abbiamo
iniziato ad usare il programma MXAN per ottenere il fit della regione XANES dello spettro
sperimentale della forma met-Hc da O. vulgaris a partire dalla struttura 1LL1 del codice PDB. I
risultati preliminari dei fit geometrico della regione XANES di questo spettro sono stati pubblicati
(67). Questi dati preliminari sono il primo tentativo di ottenere risultati quantitativi con la
spettroscopia XANES applicata al sito binucleare a rame di tipo 3 di una forma met-Hc da O.
vulgaris. Il raffinamento del best-fit dei due centri a Cu(II) della forma met-Hc da O. vulgaris è in
corso, ma è importante rilevare che le due minimazzioni (ottenute con procedure differenti) portano
a due differenti strutture per i due siti a Cu(II) ma allo stesso minimo per la distanza Cu-Cu. Ciò è
in accordo con il fatto che l'applicazione di questo codice di calcolo a parecchi casi-test ha mostrato
che la soluzione di best-fit è indipendente dalle condizioni di partenza e dalla strategia di
minimizzazione. Prima di iniziare questa serie di fits, abbiamo testato l'accuratezza
dell'applicazione dell'analisi con MXAN sullo spettro del complesso cationico mononucleare [Cu(2BB)-N3]+ (63) con dati XRD (dati da pubblicare). Una simile procedura di best-fit è anche in corso
per la forma met-Hc di C. aestuarii a pH 7.5.
Le simulazioni XANES MS ed i fits saranno estesi ai derivati met- e met-azide di Hcs degli
stessi phyla a pH 5.5 ed ai composti modello binucleari dei leganti L-5,5 e L-6,6 (64) da noi
considerati (62). Partendo dai calcoli MS (dati da pubblicare) che sono stati usati per ottenere i
risultati EXAFS per questi siti binucleari a rame 3 (62), vogliamo raggiungere, con l'applicazione
della spettroscopia XANES MS, un'accurata determinazione quantitativa dei contributi strutturali
locali e quindi la caratterizzazione della struttura fine del sito.
I derivati met- delle proteine manifestano un'effettiva interazione di superscambio tra i centri
metallici vicini (no EPR). Per i complessi bis(idrosso)- dei leganti L-5,5 e L-6,6 (64) che sono dei
buoni modelli di queste forme delle proteine Hcs, lo spettro NMR di protone è osservabile. In alcuni
casi sono stati osservati segnali stretti, indicativi di un effettivo forte accoppiamento
antiferromagnetico, in altri casi dai segnali NMR relativamente stretti si può supporre la presenza di
gruppi a ponte tra i due ioni metallici. Le caratteristiche XANES dei complessi bis(idrosso)- e
bis(aquo)- sono molto diverse (62) e, quindi, si possono ipotizzare diversità nella disposizione degli
orbitali magnetici del rame. Con calcoli MS nella regione di soglia, sarà possibile dedurre per la
struttura dello stato fondamentale lo stato (tripletto o singoletto) della polarizzazione di spin e la
separazione energetica tra i due stati. Nel caso degli addotti con azide, tramite la caratterizzazione
XAS della struttura e la descrizione, in termini di spin polarizzazione, del modo specifico di legame
dell'azide si può arrivare ad un'interpretazione delle proprietà magnetiche della loro unità
binucleare.
L'esperienza maturata sarà messa a disposizione dei ricercatori delle unità del CIRCMSB
qualora siano interessati a risolvere, quantitativamente, la coordinazione e la geometria di centri
metallo-leganti in sistemi biologici ed in composti modello correlati. Gli esperimenti potrebbero
essere eseguiti, dopo presentazione di progetto, presso la struttura ESRF dove abbiamo condotto il
progetto sulle Hcs (ESRF proposal LS-861).
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