Training Course 2007
“Stem Cell Differentiation!
Training course”!
Napoli, 9 -12 Novembre
DIFFERENZIAMENTO !
NEURALE E CARDIACO !
DI CELLULE STAMINALI !
EMBRIONALI MURINE !
Genesia Manganelli!
Cellule staminali embrionali
+LIF!
+feeder
autoreplicazione!
blastocisti!
+LIF!
+feeder
+LIF
mesoderma
+feeder
ectoderma
endoderma
Cellule cardiache
Cellule epiteliali
Cellule muscolari
Cellule neurali
Cellule pancreatiche
Cellule eritroidi
(Brook 1997,Evans and Kaufman 1981, Martin 1981, Smith
2001) Metodi di differenziamento “in vitro”!
• Metil cellulosa!
Differenziamento cardiaco!
• Co-coltura su cellule stromali!
• Monostep!
• Goccia pendente!
• Co-coltura con cellule stromali
(PA6) in terreno senza siero!
Differenziamento neurale !
• Metodo della goccia pendente:!
con aggiunta di RA o in terreno!
senza siero!
• In singolo strato con aggiunta di
fattori di crescita!
• Monostep!
Metil cellulosa
Crescita su cellule !
stromali
(OP9)!
Monostep!
Acido Ascorbico!
5-azacitidina !
Wiles MV. and Keller GM., 1991!
Lieber et al., 2003!
Takahashi T, 2003; Choi,2004!
Goccia pendente!
0-2 g
2-5 g
5-14 g
Minamino T. et al., 1999!
Lavoro sperimentale!
mESCs su fedeer!
mESCs su gelatina
Tripsina!
Conta cellulare differenziamento
Formazione dei corpi embrioidi!
300 cellule!
30µl!
0-2 g
2-5 g
5-14 g
Er
E
cardiomiociti!
C
cardiomiociti!
Differenziamento neurale !
Co-coltura con cellule
stromali (PA6)!
in terreno senza siero!
Formazione di corpi embrioidi
mediante :!
• aggregazione di cellule ES con
aggiunta di RA!
(Bibel, 2004) (Okada, 2004)!
• metodo della goccia pendente in
terreno senza siero!
(Parisi, 2006)!
0-2 g
In singolo strato con
aggiunta !
di fattori di crescita
in terreno senza siero!
fattori di
crescita!
2-5 g
5-14 g
(Kawasaki, 2000, Barbery, 2003)!
(Ying 2003; Tropepe, 2006)!
PROTOCOLLO DI DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE ES !
IN CELLULE NEURALI IN MONO-STEP
Piastrare 1000cells/
cm2 in un mezzo
specifico!
- 2
Cellule ES
indifferenziate
Cellule piastrate
su gelatina!
0
2
Cambio mezzo
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Giorni di differenziamento
High-Throughput Screening-Compatible Single-step Protocol
to Differentiate Embryonic Stem Cells in Neurons*
ANNALISA FICO, GENESIA MANGANELLI, MARINO SIMEONE,
STEFANO GUIDO, GABRIELLA MINCHIOTTI, and STEFANIA FILOSA
Neuroni
maturi e
glia
DIFFERENZIAMENTO NEURALE Perché 1000cell/cm2 ?
Differenziamento neurale a diverse confluenze cellulari
x 103 cells/cm2
U
1
3
7
10
C
Pax6
NF-L
GATA4
T
αMHC
Sox 17
HPRT
Cosa succede durante il differenziamento?
Analisi di alcuni marcatori
giorni
0 2
4
6 8 10 13
Oct4
Nanog
nestin
NF-L
blbp
GFAP
HPRT
Cellule !
indifferenziate
neuroni
glia!
Si formano anche cellule provenienti dagli altri foglietti embrionali?
Analisi mediante RT-PCR di marcatori specifici di altri
tipi cellulari!
giorni 0 3 5 8 10 13 15 C
T
Mesoderma!
Nkx 2.5
αMHC
Endoderma
GATA 4
TDO
HPRT
Quali tipi di neuroni si formano?!
DOPAMINERGICI
TH DAPI
GABAERGICI
GABA DAPI
GABA/
5-HT DAPI
50µm
Islet NF-M DAPI
MOTONEURONI !
SEROTONERGICI
50µm
50µm
20µm
Lavoro sperimentale!
Cellule mESCs su feeder !
Cellule mESCs su gelatina!
Sospensione cellulare
BUON LAVORO…!
