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Spettroscopia Raman
Quando una radiazione monocromatica di frequenza no e’ incidente ad un sistema molecolare
la luce viene:
•assorbita se ha energia pari ad una possibile transizione ad un livello energetico superiore (es.
Uv-vis, IR);
•riflessa se non interagisce con la materia;
•diffusa se interagisce senza causare transizioni energetiche
Riflessione
Trasmissione-assorbimento
Diffusione
La diffusione della luce e’ uno dei più evidenti effetti ottici, e si verifica perché gli “oggetti”
responsabili della diffusione (le molecole) hanno dimensioni molto piccole rispetto alla
lunghezza d’onda della radiazione visibile (400 - 800 nm).
Spettroscopia Raman
La spettroscopia Raman e’ una spettroscopia di tipo vibrazionale
ed è basata sul processo di diffusione Raman.
Spettroscopia Raman
La tecnica sfrutta un fenomeno fisico
scoperto nel 1928 dal fisico Indiano C.V.
Raman, che gli valse il premio Nobel nel
1931.
Egli scoprì che una piccola frazione della
radiazione diffusa da certe molecole aveva
energia diversa da quella della radiazione
incidente, e che la differenza di energia era
legata alla struttura chimica delle molecole
responsabili della diffusione: l’effetto Raman,
Spettroscopia Raman
Quando un raggio laser, di lunghezza d’onda λo monocromatica, colpisce una molecola ovvero
un insieme di molecole, la maggior parte della intensità luminosa verrà diffusa in tutto lo spazio
senza cambiamento di lunghezza d’onda. Solo una piccolissima porzione dell’energia luminosa
verrà diffusa con lunghezze d’onda diverse da quella laser.
hn
un piccola parte della radiazione
diffonde elasticamente in tutte le direzioni
senza perdita di energia, cioè alla stessa frequenza
della radiazione incidente
(diffusione elastica o Rayleigh).
hn
la maggior parte della radiazione
passa attraverso il campione
hn’
una parte ancora più piccola viene
diffusa anelasticamente cedendo (diffusione Raman
Stokes) o acquisendo (diffusione Raman antiStokes) energia nell'interazione con la molecola,
Effetto Raman
Il fenomeno Raman e’ interpretato ammettendo che
il sistema sia eccitato ad un livello molto instabile
(livello virtuale, che non corrisponde a nessun livello stazionario della molecola):
La luce incidente induce il
movimento degli elettroni
di legame.
Tali elettroni in movimento
riemettono luce.
Il livello e’ talmente instabile che nel
tempo di 10-14 sec, prima cioe’ che
avvenga un qualsiasi urto, la stessa
radiazione
e’
spontaneamente
riemessa ed il sistema ritorna allo stato
fondamentale.
Diffusione della luce
Considerando l’interazione luce-materia in termini di particelle, possiamo
immaginarla come una
collisione tra i fotoni e le particelle che formano il campione irraggiato.
I fotoni che interagiscono con le particelle del campione
e vengono retrodiffusi possono essere di due tipi:
• se la diffusione avviene per interazione elastica,
cioè senza trasferimento netto di energia, i fotoni
(ovvero la radiazione diffusa) hanno la stessa energia
di quelli incidenti: questo fenomeno è noto come
diffusione Rayleigh e costituisce l’evento più frequente
• se la diffusione è conseguenza di una interazione
anelastica, cioè con trasferimento di energia dal
fotone ad una particella o viceversa, il fotone
diffuso ha energia rispettivamente minore o maggiore
di quello incidente: questo è la diffusione Raman o effetto
Raman, che avviene su un numero assai limitato di
eventi, circa 1 su 106
Effetto Raman
Effetto Raman
se la molecola assorbe parte dell’energia del
fotone per passare ad uno stato eccitato, il
fotone riemergerà con un’energia (frequenza)
minore di quella d’incidenza andando a
formare le cosiddette righe Stokes dello
spettro Raman
Effetto Raman
se invece la molecola si trova già in
uno stato vibrazionale eccitato, a
causa dell'eccitazione termica, può
cedere energia al fotone incidente
che riemergerà dall’urto con
un’energia maggiore andando a
formare le righe anti-Stokes.
Spettro Raman
Spettro Raman di CCl4 eseguito utilizzando
per l’eccitazione una riga laser con l=488 nm
Spettro Raman
La maggior parte delle collisioni tra la radiazione eccitatrice e le
molecole è di tipo elastico, solo circa 1 su 106 collisioni è anelastica
La riga con la stessa frequenza della sorgente, derivante dalla diffusione
Raleigh della radiazione incidente, è la componente di gran lunga più
intensa dello spettro Raman e deve essere allontanata.
Spettro Raman
Poiché a temperatura ambiente il livello vibrazionale V0 è più popolato di V1, il
passaggio dallo stato vibrazionale fondamentale al primo eccitato è più
probabile del passaggio inverso e quindi le linee Stokes sono più intense di
quelle anti-Stokes
Sorgente di Eccitazione
Nella diffusione Raman, la luce incidente può
avere una qualsiasi frequenza.
La differenza Dn e’ indipendente
dalla frequenza della luce incidente n.
Sorgente di Eccitazione
Nella diffusione Raman, la luce incidente può
avere una qualsiasi frequenza.
La differenza Dn e’ indipendente
dalla frequenza della luce incidente n.
FASCIO MONOCROMATICO
E
INTENSO
Gli spostamenti in frequenza della
radiazione diffusa dalla radiazione incidente
sono molto piccoli e di conseguenza la
radiazione
incidente
deve
essere
monocromatica per poterli osservare.
Inoltre l’intensità della radiazione diffusa è
molto bassa, quindi è necessario che il
fascio incidente sia anche molto intenso.
Sorgente di Eccitazione
Si osservano spettri Raman adoperando sorgenti
nel visibile o nell’UV.
Nella maggior parte dei campioni reali, i deboli segnali Raman sono
oscurati dalla fluorescenza di fondo.
In generale, la fluorescenza diminuisce se la lunghezza d'onda
passa dal visibile alla regione del vicino IR (NIR), cioè se
diminuisce l'energia della sorgente di eccitazione. Questo fa sì che,
come sorgenti di eccitazione, si scelgano comunemente il laser o i
diodi laser (che emettono nel rosso lontano e nel NIR, riducendo la
fluorescenza di fondo)
SpettroRaman
Numeri d'onda (cm-1)
20450
20500
20550
20600
1.E+07
1.E+06
Intensità
Nello spettro Raman si ha in ordinata
l’intensità di emissione luminosa e
in ascissa la frequenza assoluta in
cm-1 oppure, più comunemente, lo
spostamento Raman o Raman shift, cioè la
differenza in numeri d’onda tra la
radiazione osservata e la radiazione
incidente.
1.E+05
1.E+04
1.E+03
1.E+02
1.E+01
1.E+00
-20
0
20
40
Raman shift (cm-1)
60
80
Spettroscopia IR e Raman
Lo spettro Raman è quindi uno spettro vibrazionale, come lo
spettro IR, ma da questo differisce per due motivi fondamentali:
1. lo spettro Raman viene generato dalla
differenza di due livelli elettronici (la cui
differenza è pari ad un livello vibrazionale); la
sorgente dello spettrometro è perciò nel
visibile, anche se ora sono molto diffuse
sorgenti nel NIR .
2. gli spettri Raman ed IR
differiscono per le regole di
selezione delle transizioni.
Spettroscopia IR e Raman
Le due tecniche sono perciò complementari:
nello spettro FT-IR del Dicloro-acetofenone è evidente lo stiramento del legame
C=O a circa 1700 cm-1, che è quasi assente nello spettro FT-Raman.
Regola di selezione
la polarizzabilità molecolare deve
variare con la distanza internucleare.
Regola di selezione
b
+
+
a
Gli elettroni in una molecola
formano una ”nuvola” di carica
elettronica intorno ai nuclei che
costituiscono
lo
scheletro
molecolare (figura a).
+
E
-
Sotto l’effetto del campo elettrico (E) della
radiazione elettromagnetica questa nuvola viene
deformata (figura b) in modo tale che si forma un
momento di dipolo elettrico μ proporzionale al
campo secondo la relazione: m=aE
Regola di selezione
b
+
+
E
-
La polarizzabilita’ e’ una misura della distorsione della nuvola elettronica,
ossia della mobilità degli elettroni, in presenza del campo elettrico :
tanto maggiore è la polarizzabilità, tanto piu’ facilmente la nuvola
elettronica si orienta secondo la direzione del campo in modo da generare
un momento indotto piu’ grande.
Regola di selezione
b
+
+
E
-
Per effetto della distorsione determinata nella distribuzione dei loro elettroni
e nella posizione dei loro nuclei,
le molecola apolari possono acquistare un momento dipolare quando sono
poste in un campo elettrico (momento di dipolo indotto)
Regola di selezione
la polarizzabilità molecolare deve
variare con la distanza internucleare.
Per legami con un forte momento di dipolo (che sono attivi all’IR) la mobilità
per polarizzabilità è generalmente bassa.
Per legami che hanno un debole momento di dipolo, la polarizzabilità è
generalmente alta e gli stati vibrazionali di tale legame sono Raman attivi.
REGOLA DI SELEZIONE GENERALE PER L’OSSERVAZIONE
DEGLI SPETTRI RAMAN VIBRAZIONALI:
•la polarizzabilità molecolare deve variare con la distanza internucleare.
•La regola di selezione specifica per le transizioni vibrazionali Raman
nell’ambito dell’approssimazione armonica è
Dv = ± 1
Raman + IR: 3657 cm–1
H2O
Raman + IR: 3756 cm–1
Raman + IR: 1594 cm–1
Variazione di dipolo elettrico
Variazione di polarizzabilità
Lo stiramento simmetrico è una
vibrazione inattiva in infrarosso.
Comporta però una variazione della
polarizzabilità per cui questa
vibrazione e‘ Raman attiva.
Lo stiramento anti-simmetrico è
una vibrazione infrarosso attiva.
E' invece Raman inattiva in
quanto non varia la
polarizzabilità.
A vantaggio della tecnica Raman
sono il fatto che l’acqua e il vetro non causano interferenze,
diversamente dall’IR, e che le linee dello spettro Raman sono
generalmente più strette e quindi più semplici da identificare.
A vantaggio della tecnica IR
è invece il fatto che gli spettri siano solitamente più ricchi di
segnali e quindi la tecnica risulta di più generale applicazione
Spettroscopia Raman Risonante
Se la luce di eccitazione utilizzata per un esperimento Raman
coincide con la banda di assorbimento per una transizione
elettronica, si osserva una grande aumento di intensità dello spettro
Raman.
Questa tecnica si chiamata spettroscopia Raman Risonante (RR).
Ne segue che il processo di risonanza Raman è accoppiato al
processo della transizione elettronica con intensificazione del segnale
Raman che può essere anche di ordini di grandezza rispetto alla
spettroscopia Raman.
L’intensificazione del segnale dipende dal coefficiente molare di
assorbimento della banda elettronica e dalla vicinanza della
lunghezza d’onda di eccitazione con la lunghezza d’onda della
transizione elettronica.
Spettroscopia Raman Risonante
Spettroscopia Raman Risonante
Questa tecnica trova utilizzo nello studio di biomolecole che
presentano un forte assorbimento nel visibile e nell'ultravioletto.
Possibilità di misurare selettivamente lo spettro di assorbimento di
un cromoforo anche in presenza di un forte background di altre
bande vibrazionali
Spettroscopia Raman Risonante
Molti aminoacidi hanno transizioni elettroniche con massimi di
assorbimento nella stessa regione dell'assorbimento del gruppo
peptidico.
Perciò, se gli aminoacidi fanno parte di una catena polipeptidica, è
difficile osservarne gli spettri di RR, poiché le loro transizioni
elettroniche hanno un coefficiente di estinzione molare minore di
quella del gruppo peptidico e sono inoltre in numero minore
rispetto ai legami peptidici.
Ne segue che gli aminoacidi che meglio si rivelano in RR
sono quelli che assorbono a l>230 nm e cioè gli aminoacidi
aromatici.
Spettroscopia Raman Risonante
Gli spettri di RR della Phe, Tyr e Trp,
ottenuti con varie frequenze di eccitazione
sono dominati dai modi dell'anello
benzenico.
Variando semplicemente la lunghezza
d'onda della radiazione incidente, che e'
in risonanza con i diversi stati elettronici
eccitati, nei tre spettri sono intensificati
modi differenti (hanno cioe’ profili di
eccitazione differenti).
Perciò e' possibile distinguere le bande
dei diversi cromofori aromatici, anche
in spettri di proteine molto complicate,
semplicemente variando la lunghezza
d'onda della radiazione incidente.
Spettroscopia Raman Risonante
Spettroscopia Raman Risonante
Il rapporto tra le intensità
tra le bande, I850/I830,
della tirosina e’ una sonda
sensibile dello stato del
legame ad idrogeno e di
ionizzazione del gruppo
OH della tirosina. Si ha
variazione di intensità del
doppietto a seconda che la
tirosina sia esposta al
solvente
o
sepolta
all’interno della proteina.
Spettroscopia Raman Risonante
Il riscaldamento porta alla rottura dei legami a H
delle catene polipeptidiche e delle interazioni
idrofobiche e idrofiliche, comportando una
esposizione della tirosina.
Spettri Raman del DNA
La spettroscopia Raman e' sicuramente una metodica molto
importante per lo studio del DNA.
Entrambe le spettroscopie Raman convenzionale e
risonante forniscono informazioni strutturali.
Per un esperimento di RR la lunghezza d'onda della
radiazione eccitatrice deve cadere all'interno della
banda di assorbimento della molecola, che per gli acidi
nucleici va tra 200 e 280nm. D'altra parte, pero' in
questa maniera si perdono tutte le informazioni
strutturali provenienti dalle vibrazioni dello scheletro.
E‘ per questa ragione che la maggior parte degli studi
sul DNA e RNA sono stati eseguiti utilizzando
l'effetto Raman classico, adoperando righe eccitatrici
nel visibile.
Spettri Raman del DNA
La spettroscopia Raman e' sicuramente una metodica molto
importante per lo studio del DNA.
La spettroscopia si è rivelata molto utile per
distinguere i vari tipi di DNA grazie a bande
marker sensibili sia al tipo di base sia alla
conformazione dello zucchero
Le vibrazioni delle basi contengono
informazioni strutturali concernenti le
interazioni di stacking delle basi ed i legami ad
idrogeno fra le basi. Le alterazioni indotte nello
spettro Raman delle basi sono dovute a
cambiamenti conformazionali.
Spettri Raman del DNA