Relazione Finale Borsa SIF per soggiorno all`estero

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MODELLOPERINVIORELAZIONEDIMETÀEFINEPERIODO
NOMEECOGNOME:___CeciliaVitali_________________________________________________________
UNIVERSITÀ:___Universita’degliStudidiMilano______________________________________________
DIPARTIMENTO(incasodiborsapersoggiornoall’esterospecificarel’entepressocuisièsvoltala
ricerca):UniversityofPennsylvania,DivisionofTranslationalMedicineandHumanGeneticsPerelman
SchoolofMedicine(USA)________________________________________
TUTOR(incasodiborsapersoggiornoall’esterospecificareiltutordell’entepressocuisièsvoltala
ricerca):ProfessorDanielJRader___________________________________________________________
TIPOLOGIADIBORSARICEVUTA:borsapersoggiornoall’estero____________________________
TIPOLOGIADIRELAZIONE(es.:metàperiodoofinale):__fineperiodo____________________________
TITOLODELLARELAZIONE:RoleofLCATinbrainlipoproteinmetabolism________________________
_______________________________________________________________________________________
RELAZIONE:
Ilcolesteroloe’uncomponenteessenzialedelSistemaNervosoCentrale(SNC)ePerifericodeimammiferi
[1].Circail25%delcolesterolocorporeototalee’contenutonelcervelloede’presenteinformaperlopiu’
non esterificata (90-95%)[1]. La presenza della Barriera Emato-Encefalica (BEE) fa si’ che il SNC sia
funzionalmente parzialmente isolato dalla circolazione periferica, pertanto cambiamenti nella
concentrazione del colesterolo plasmatico influenzano in modo marginale il contenuto di colesterolo
cerebrale [2]. Nel cervello adulto la maggior parte del colesterolo viene sintetizzata in situ da parte di
astrocitiedoligodendrociti[3,4].Ilcolesteroloneosintetizzatovieneincorporatoinlipoproteine,similiper
dimensione e contenuto lipidico alle HDL (High Density lipoproteins) nascenti e pertanto talora
denominate particelle “HDL-like”[5]. Contrariamente a quanto osservato per le HDL, tuttavia, il
componenteproteicoprincipaledellelipoproteinecerebralie’l’ApolipoproteinaE(apoE),chevienesecreta
ed associata a lipidi attraverso un processo mediato dal trasportatore di membrana ABCA1 [2]. E’ stato
dimostratoinoltrecheunapiccolafrazionedellelipoproteinecerebralie’costituitadaHDLplasmatichedi
piccoledimensionichevengonoacquisitedallacircolazionegrazieall’attivita’delrecettoreSR-BIpresente
a livello della BEE[4, 5]. Nel SNC, neuroni ed altre popolazioni di cellule possono captare le lipoproteine
presentinelparenchimaattraversol’attivazionedidiversirecettoriqualiLDL-ReLRP1,entrambiingradodi
legareapoE[4,5].E’statoipotizzatoche,analogamenteaquantoosservatonellacircolazioneperiferica,le
particelle nascenti vadano incontro ad un processo di rimodellamento e maturazione catalizzato da
numerosi enzimi e trasportatori. La Lecitina:Colesterolo Aciltrasferasi (LCAT) e’l’unico enzima in grado di
esterificareilcolestroloneifluidibiologiciesvolgeunruolochiavenelmetabolismodelleHDLplasmatiche
[6].Sebbeneessovengasintetizzatoprincipalmentenelfegato,studiinvitroedinvivohannodimostrato
che gli astrociti sono in grado di sintetizzare LCAT, e quest’ultimo si e’ rivelato attivo nell’esterificazione
dellelipoproteinedioriginegliale[7].
Dainviarea:SocietàItalianadiFarmacologia–e-mail:[email protected];[email protected]
Inoltre l’analisi del liquido cefalo-rachidiano umano ha evidenziato la presenza dell’enzima a una
concentrazioneparial2-5%diquellaplasmatica[2][8].Ilpresenteprogettoe’finalizzatoadinvestigareil
ruolodiLCATnelmetabolismodellelipoproteinecerebraliattraversol’utilizzodimetodiinvitroedinvivo.
Al fine di valutare la funzione fisiologica di LCAT nel SNC ho potuto avvalermi dello studio di topi LCAT
wholebodyKO,neiqualiilgenecodificanteLCATe’statoinattivato.L’analisideilipidiedellelipoproteine
plasmatici ha evidenziato che, in assenza dell’enzima, i livelli di HDL colesterolo, apoA-I e la frazione di
colestrolo esterificato rispetto al colesterolo totale sono significativamente ridotti. La maturazione delle
HDL e’ stata analizzata tramite elettroforesi bidimensionale, tecnica che consente di separare le
lipoproteine in base a carica superficiale e dimensione [9]. Il diametro medio delle particelle contenenti
apoA-I risulta drammaticamente ridotto nei topi LCAT KO e la percentuale di lipoproteine alpha migranti
(arricchiteincolesteroloesterificato)e’significativamentediminuita.Lapresenzadipotenzialialterazioni
delmetabolismolipoproteicoalivellocerebralee’stataeffettuatatramitelamisurazionedeilivellicorticali
ed ippocampali di apolipoproteine e recettori coinvolti nell’omeostasi del colesterolo. L’espressione dei
trasportatoriABCA1,SR-BI,LDLRandLRPIediapoEeapoA-I,e’statavalutatatramiterealtimeqPCRe
western blotting (figura A) . Questo fenotipo molecolare suggerisce un potenziale deficit di maturazione
delle lipoproteine cerebrali. Questi risultati indicano che in assenza di LCAT i livelli genici e proteici di
ABCA1,apoE,LRP1eLDL-RsonosignificativamenteaumentatineitopiLCATKOrispettoaWT(p<0.005).
Questa osservazione e’ in accordo con l’ipotesi secondo cui l’attivita di LCAT a livello del SNC possa
promuovere l’esterificazione del colesterolo lipoproteico inducendo un vasto rimodellamento delle
particellenascenti.Neltentativodiconfermarequestaipotesi,abbiamoraccoltoilliquidocerebrospinaledi
topi WT e KO. 6 campioni per gruppo sono stati uniti in pool e sono stati analizzati tramite gel nativo in
gradiente,seguitodaimmunoblotting[9].Questatecnicaconsentedisepararelelipoproteineinbasealla
loro dimensione e di determinarne il contenuto apolipoproteico. I risultati indicano che, analogamente a
quanto osservato nel plasma, nei topi con deficit di LCAT le lipoproteine contenenti apoE sono
significativamentepiu’piccole(figuraB)[8].Nell’uomoapoEesistein3diverseisoforme(E2,E3,E4)[10].
Le tre isoforme sembrano avere differenti propreta’ chimico-fisiche, come ad esempio la capacita’ di
acquisirelipidiesonostatevariamenteassociatealrischiodisvilupparemalattieneurologiche,adesempio
lamalattiadiAlzheimer[11,12].Alfinediinvestigareulteriormentelarilevanzadell’esterificazionealivello
cerebraleeditraslareleosservazionicheabbiamorilevatoinvivo,abbiamodisegnatodeisaggiinvitroper
determinareladiversacapacita’delletreisoformediattivareLCAT.Abbiamopercio’eseguitounsaggiodi
esterificazione, utilizzando come substrato delle HDL sintetiche contenenti apoE ricombinante e LCAT
ricombinantecomefontedienzima[13].Irisultatiindicanochetutteleisoformesonoingradodiattivare
LCAT. la capacita’ di attivazione (espressa come area sotto la curva CE/mL/h) e’ pari a 30.1 % (ApoE2),
22.7%(ApoE3) e 21.36% (ApoE4) rispetto ad A-I. In un secondo esperimento abbiamo incubato
concentrazioni crescenti di substrato con una quantita’ costante di LCAT per 30 minuti. Questo disegno
sperimentale permette di descrivere la cinetica della reazione secondo il modello di Michaelis–Menten. I
risultatiindicanoche,comeattesoApoA-Ie’ilpiu’efficaceattivatorediLCATmentretraleisoformeapoE,
apoE2esibiscelapiu’altaVmax(figureCeD).
Questi risultati complessivamente supportano l’idea che LCAT, in aggiunta al ben noto ruolo
nell’esterificazionedelclesteroloplasmatico,potrebberivestireunruoloimportantenellaregolazionedel
pool di colesterolo esterificato cerebrale. In questo modello, in assenza di LCAT le lipoproteine cerebrali
sarebberodunquepoveredicolesteroloesterificatoepotrebberoavereunaridottaaffinita’perirecettori
dellafamigliadelLDL-R.Studisuccessiviaiuterannoachiarireseleosservazionidanoiriportateinvitroe
nel modello animale possano avere un significato fisiologico e patologico per la funzionalita’ cerebrale
umana.
Dainviarea:SocietàItalianadiFarmacologia–e-mail:[email protected];[email protected]
A
B
C
D
Dainviarea:SocietàItalianadiFarmacologia–e-mail:[email protected];[email protected]
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