IDROLISI ENZIMAT1CA
DEL LATTOSIO CON BIOREATTORI
A MEMBRANA
M. PIZZICHINI, R. PILLOTON
-
ENEA Area Energia e Innovazione
Dipartimento Processi Chimic e Materiali
Centro Rtcerche Energia Casacia, Roma
M. PONTECORVO, G. MIGNOGNA, A FORTUNATO, F. BEONE
Ospiti ENEA
ultrafiltrating).
Amicon VitaFiber), for bioreactoi
Specific membrane modu!es
enzyme has succesfully been
applications are commercialized, j3-galctosidase
ules io hydroiize iactose in
immobilized in a hollow fiber and in a ceiamic rnod
treatment is considered by
waste whey. The generai problem of the waste whey
and increase of product
different points of view: environmental pollution
quality.
geneial properties and
In this technical report me presentd the
washing procedures. idraulic configurations
performances (perrneability.
ceramic, supports
ieniical properties) of hoth, polvmeric and
1
physical nd c
obilization rnathematic
the enzyme kinetic, its phisical and eoa1ent imm
process
model of the bioreacior and on line morneoring of the
Riassunto
zzazione di enzimi o
I bioreattori a membrana. ottenuti per immobili
anici offrono molti vantaggi
cellule in supporti polimerici (membrane) o inorg
re un processo separativo
rispetto ai processi in batch. Consentono di accoppia
riducendo in tal modo gh
con una trasformazione enzimatica iii continuo,
attori consentono inoltre
effetto di inibizione enzimatica da prodotto. I biore
ere Uottimizzazione del
una vasta scelta di configurazioni idrauliche per otten
un adeguato metodo di
processo. Lo sviluppo del bioreattore richiede
cinetici. chimico fisici e
immobilizzazione e la correlazione fra paiametri
le fibre cave asinimetriche
idrodinamici, Moduli a membrana polirnerica, come
ici da laboratorio (Amicon
sono commercializzate anche come sistemi reattorist
-
Vitafiber).
nel siero di latte con un
Oggetto di questo lavoro e l’idrolisi del lattosio
quadro dei problema piu
bioreattore a membrana ad attivita’ lattasica nel
industria iatierocasearia.
generale del trattamento di questo effluente dell’
differenti supporti: uno
L enzima b-galattosidasi e’ stato immobilizzato su due
L In questo rapporto
polirnerico (polisolfone) e l’altro inorganico (allumina
i supporti (permeabilita’,
vengono considerate le proprieta’ generali di entiambi
ica
steIiizzaLione\ la cinet
configurazioni idrauliche, procedure di lavaggio e
covalente, il modello
e
dell’enzima utilizzato Fi sua nvnobilìzz izFin iea
de p C
o I
1 I oratj e il run, ,r gg,
IPi e mrt’c
i 6 Materiali, metodi e rrumeniazone
1 7 Bibliogiafia
2 SUPPORTI E MODULI A MENIBkNA
2.1
2
a.3
2.4
Barriere ceramiche
Membrane a fibre cae OIi5Ol miche
Schema del processo e appatecchiature di
Permeabilitadi membrana
e sterIiizaz ne ‘le m )dul
2 q Rigenerazione
2.6 Conclusioni
2.7 Bibliografia
Meccanismo di reazione
Fonti della f3-galartosidasi
La cinetica della [3galattosidasi
Determinazione dell’attix’it’ enzjmatca
Determinazione delle costanti cinetichc
Effetto dello k ne calcio sull’a ti vi ci ziinat
3 LA GALATTOS1DASI
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3 6
ca
4.1.5 immobilizzazione della f3-galattosdasi
4.1.5.1 Immobiiziazione con aliuinina
4 1.5.2 irnrnobilizzazionc per reticolazione
4.2 kastazionj del bioreattore lattasico
4.2.1 Tempo di vita medio del bioreattoie
4.2.2 Effetto del caricamento enzimatico
4.2.3 Effetto della concentrazione di substrato
4 2 4 Effetto della portata sulla conversione
4 2.5 Effetto termico
4.2 6 Impiego dei siero di latte
-1.3 Conclusioni
4 4 Bibliogiafia
5 MODELLO MATEMATICO DEL BIOREATTORE
5.1 Tempo di permanenza degli elementi di fluido. 2
5 2 Modello matematico e confronto con i dati sperimentali
4 5
5 3 Determinazione dello stadio controliante
6 IMMOBiLIZZAZIONE ENZIMATICA SU BARRIERE CERAMICHE
‘
6 1 Immobilizzazione enzimatica
6.1.1 Procedura di immobilizzazione
6.1.2 Controllo dellilnmohilizzazione
6, .3 Influenza deilimmobihzzazione sulla permeabiiita
4
6.2 Tempo di residenza e modello fluidodinamico
6 3 Presta»tmt del bicn’eatto,c
6 3 1 C’wvcsione e veìcita di produzione
ffe odel
i,i
v
rc
ior
let nrlla -np iv
nll (S
7 SVILUPPO DI B1OSENSORI PER IL CONTROLLO IN LINEA DEL
PROCESSO
7.111 sistema biosensore
7.2 Biosensori a glucosio e lattosio
7.3 Sistema elettrochimico di misura
7.4 Interferenze chimiche
7.5 Procedimento di immobilizzazione enzimatica
7.6 FIow lnjection Analysis (HA)
7.7 Rigenerazione del tampone
7.8 Automazione del sensore
7.9 Conclusioni
7.10 Bibliografia
-
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A recupei
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ndustriaii iimnizza
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materie prime seconue,
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ii’
Bioreattori e bosensoi
operativamente ci itici pci CLII de bit. due ‘in aetcvulc srorzo dl ricerca per
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essere concretamente apphcati a
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questo arar mento di Irondera e r itica
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crgal, n’a u eri
Sul tema ip oggc i ‘E\L A
molo “Bioeatalizzato e ra ec ce, e’ e cnr’ e ami ca/Ioni ‘a’rnate di studio.
seminari coinvu!genPo ma via en1nt ,‘r’hbiic di ticeca e ie principali
E. i:.;eaze, Mciana iiccigna e
universita’ Italiane (Universi.ia di Pa ma :
L’Aquila).
Fra i docenti direttanente rinvoli n Il i i d’ere i ui bwcaù lizzatui i
enti ‘Ao, il Piof
citiamo, ringiaziandoli per il li ro aleziosissinie eiiri ru o
(ampanella, il Prof, Bec ar il Piol Marconi, il Prof Milazo il I ro Rolle, il
Prof, Tomassetti, il Proi. PalPo, il Piof, Fronnili I Piof Mascini, il
Dr,Palleschi, il Prof,Violante, il i rof.Avigliano Il Prof.Miianda,
L’oggetto del piesente lavoro. svolto smerimcnttdniente piesso i iaboratoii
ENEA, CRE Casaccia. Area Innovazione Tecnologica. Dipaitimento Processi
chimici e materiali, Progetto FESE e PLTRI ha ,teessato io svolgimento di sei
tesi di laurea in Chimica, Chimica inoustrale e Scienze Biologiche.
li rapporto con il mondo u uve isitario e ‘n particolare con i laureandi e
stato
enorme
di
stimolo
W
grande slancio eniotiv’ per la ri erca
intellettuale
e
Un nncraziameno particolaie
al Dott Claudio I ahiani (ENE/) che
sviup d la nceica
con la sua sapiente supe ision’ a onseniifl
prodotti del metabolismo cellulare (ac. lattico, etanolo, antibiotici)
Nati inizialmente sul modello operativo che impiega le tecnologie
chimiche tradizionali, i bioprocessi si vanno evolvendo dalla filosofia di
reazione in batch a quella di processo continuo allo stato stazionario.
Nel processo in batch il recipiente di reazione contiene oltre al substrato
da trasformare, le specie nutrienti, tamponi, in un mezzo sterilizzato nel quale
si aggiunge il biocatalizzatore. Il processo puo’ durare da qualche ora a diversi
giorni. Durante questo periodo, la vasca di reazione viene alimentata con le
sostanze necessarie alla reazione cataliztata mentre vengono rimossi i prodotti
di reazione come gas, precipitati Quando la reazione e completa il recipiente
di reazione viene svuotato e inizia la fase di purificazione dei prodotti. Tutte
queste fasi impegnano un turn over di processo piuttosto lungo.
Alcuni degli inconvenienti dei processi in batdh possono essere ridotti
con l’immobilizzazione del catalizzatore su supporti di varia natura
consentendo di ottenere una unita’ specifica (bioreattore) per realizzare processi
continui. Cio’ comporta evidenti vantaggi pratici:
-uso razionale del catalizzatore (minori quantita’separazione dai
prodotti,riuso)
agevole controllo dei parametri di processo in unita’ modulari
-composizione del prodotto stabile nel tempo
-uso di minori quantita’ di reattivi (minore impatto ambientale)
modularita’ impiantistica, minore investimento di capitale
impiego piu’ efficace di tecnologie a DNAr per sviluppare nuovi prodotti
A favore dei processi continui a biocatalizzatore inimobilizzato sono
anche altri fattori di carattere cinetico e termodinamico:
-possibile attivazione enzimatica da parte del supporto
-possibile trasformazione di stato fisico del catalizzatore (gel) a cui
possono essere associate minori energie di attivazione
-spostamento dell’equilibrio verso la formazione del prodotto che viene
costantemente rimosso
-nel caso di una inibizione da prodotto, la rimozione di quest’ultimo
inter iene anche sulla cinetica della reazione
Applicazioni
dell’ attivita’ originaria. A questo scopo sono state messe a punto numerose
metodologie e tecniche di immobilizzazione comprendenti sia un largo spettro
di enzimi che di matrici dì supporto.
L’immobilizzazione dei biocatalizzatore consente di realizzare un
bioprocesso con notevoli vantaggi economici sia per la semplificazione e la
riduzione delle dimensioni impiantistiche. che per il minor impiego e la
possibilita’ di recupero de! biocatalizzatore (Pizzichini, 1985).
Alcune applicazioni su larga scala dei biopiocessi basati sugli enzimi
immobilizzati sono rip rtate in tabella
Enzima (I=’imrnobilizzato)
Penicillina acilasi (I)
Produzione di 6-APA da penicillina G o V
Glucosio isomerasi (1)
Produzione di fruttosio
Lattasi (i)
Idrolisi del lattosio nel latte e nel siero
Melibiasi (I)
Idrolisi del raffinosio nella melassa
Aspartasi
Produzione di acido L- aspartico da acido fumarico
Fumarasi (I)
Produzione di acido L-malico da acido fumarico
:
vili
pro(’es( separativm a membrana si ha.a sulle poL)rieta’ permseiettive
oli n ‘nec inemfran q’v rdo a noi ti
la o enga reata un’
I rsptimembrana
Nel capitolo successivo
verranno descritte le tecniche di
immobilizzazione chimica e fisica dei biocatalizzatori, i supporti utilizzati e le
perform ances dei sistemi immobilizzati,
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2assivo rr i una politica di ilovazune tecnologica e di qualificazione dei
prodcttt
Per svoigeie ma profi ua azione innovativa nei seitore alimentare e in
br si de ‘ono sviluppate e mettere a punto
olio attiero caseario in rai
,rocess: sepaiati”i e di tiasf’wnazione in (100000. sviluppare sistemi di
1
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a par e an a i
cgurt. panna.
eo --1 va ore aggun’ alci predone ,latte elczionato, burro.
or ed è infatti quello in cui i processi sem’rativ’ e di irasforrna;oone con
niag io’ mente sta ati e si luppati a livello
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(biorea Scie l4tasi €1.
Questo schema di piocesso ha un-i notevole ‘mpostas’za apphcativa
poiche’ puo’ esserc impiegato sia pa la ‘alci inazioni. dei o tituent
i del Jatt
quando si parte da questa materia prima per scopi alimentari, sia
per il
trattamtato del siero e di altri reflui a scopo depura
tivo. Infatti oltre al siero
l’industria lattiero-casearia produce teflui a compoi7ione variabi
le
ma
ad alto
carico inqi manie che pi ssono cssere ii&ualmente depurati second questo
o
schema.
I aspet o signi... catiso dello s..he fla d t,atta.iIcntc. dcl s.em
on
le
tecnologie di membrana consiste rei -lepuraìe il reflr attraverso un recupe
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differenziato dei sing li componeni. «‘n’e eropro.ein. sai irtina1i, sciropp
o
di glucidi e acqua terila
eettrodUs
cfroppo d
Di seguito sono discusse le singole operazioni unitarie previste dallo
schema di trattamento del siero.
Microfiltrazione
Tale processo consiste nell’impiego di membrane polirneriche o
ceramiche con dimensioni dei pori di l3 t aventi Io scopo di trattenere le
frazioni di coagulo residue del siero. La pressione di esercizio e’ di circa 0.51 .0 atm a temperatura ambiente, L’effluente concentrato di questo processo
contiene grasso e coaguli proteici che possono essere riutilizzati nel caseificio
per incrementare le rese di caseificazione. Il permeato passa alla fase di
ultrafiltrazione.
Ulirafiltrazione
Questa
operazione, comporta la rimozione ed il recupero delle
sieroproteine dal siero, con conseguente abbattimento del carico inquinante, e
soprattutto permette la valorizzazione economica di questa componente ad
elevatissimo valore biologico. Le sieroproteine trovano infatti impiego
nell’industria alimentare per i prodotti dolciari e dietetici, per l’alimentazione
neonatale e infantile e come additivi per bevande gassate, etc. 11 permeato di
questa operazione e” costituto pr’nioalmente da una soluzione di lattosio
al minerali
4 8%)
di concentrazione e recupero dei glucidi. Tale rimozione nuo’ essere realizzata
con tecniche che impiegano Io scambio ionico o lelettrodiahisi. I dati
sperimentali dimostrano che l’elettrodialisi e in grado di rimuovere anche il
90% di sodio, potassio. cloruri, fosfati,
Osmosi inversa
Mediante l’osmosj inversa si ottiene acqua demmeralizzata utilizzabile nei
cicli sterili di lavorazione del latte e contemporaneamente la separazione di uno
sciroppo dì glucidi. La caratteristica principale dell’osmosi inversa consiste
nell’operare a bassa temperatura (4070C), nel concentrare la soluzione
glucidica di circa 20 volte, nel produrre acqua sterile con un risparmio
energetico di circa il 90 rispetto alla distil1azione duo stesso tempo previefle
la degradazione termica dei prodotti (cararnellìzzazione dei glucidiL
L’oggetto di questo lavoro si inserisce nei quadro generale appena
descritto poiche’ affronta l’ottimizzazione del bioreattore lattasico per
l’impiego. in scala pilota, nel processo di trasformazione e valorizzazione del
siero dj latte,
Il presente lavoro ha lo scopo di descrivere e di correlare i parametri
operativi del sistema bioreattore enzimatico a membrana per applicazioni in
campo agro-alimentare, biomedico e in generale nel campo delle biotecnologie.
L6 Materiali metodi e strumentazione
Materiali
L’enzima galattosidasi, estratto da Aspergillus oryzae, e’ stabilizzato in
amido Viene prodotto in forma liofilizzata dalla Sigma Ch.Co,, gradoXl. lot
25F-0633. Attivita’ specifica con onitrofenil galattoside (ONPG) 5,3 U/mg,
con lattosio 4. U/rng a 30°C e pH 45.
I
1_I ‘rìg
er il hiosens
glucosio e a o utiiii;ato l’or ima 3glucos o ossidasi
ottenere dd ;-soerij’T \ioer e odtt n foni u’d,hz7ata Sieei Lh CO
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azi ini’cc li ri;ranonc sermostatato a 90°C;
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‘nii i:’: i’ c t’i compIesi cnn la inne (a+
pi aente iella fase stazione ta (
’oli ti i rti ‘lato on divinil-bcnzene).
1
Con tale sstema si oossono esu,une t campioni/ora.
2 Beckman Gli’cose Analyzer —. per le ina1isi discontinue del glucosio
su campioni raccolti. Il pnncipio di t
unzionamento si basa sulla seguente
reaziope:
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Le misure di assorbanza vengono condotte allo spemofotometro a 280
aminoacidi aromatici (Tirosina, Triptofano.
nm (le proteine contenenti
Fenilalanina) assorbono nella regione da 250 a 300 nrn (UV). La retta di
taratura (fig.6) viene costruita per diluizioni progressive di una SOiUZOflC
enzimatica (2 g/I) in tampone citrato. Le misure sono condotte con cuvette in
quarzo con cammino ottico di 10 mm
Questo tipo di controllo non & specifico per l’enzima e puo’ dare un
nsultato positivo per qualsiasi altra proteina contenuta nel preparato
enzimatioco,
Le misure di attivita’ vengono effettuate diluendo 1:5 il permeato in una
soluzione di lattosio al 5qc e misurando dopo 30 minuti di reazione l’eventuale
produzione di glucosio che indica la presenza dell’enzima flCi permeato. La
verifica dell’attivita’ e’ un controllo specifico per l’enzima
LZibliorafia
Fabiani C., Pizzichini M., ENEA, RTliCfli’83I22 (1983)
Pizzichini M., Le biotecnologie in campo internazionale,
ENEA RT/TIB/85/24 (1985)
Vismara R4 Depurazione Biologica, teoria e processi. Ed. Hoepli (1978)
2 SUPPORTI A MEMBRANA
I bioreattori a membrana impiegano come supporto di immobilizzazione
una membrana polimerica o inorganica da micro o ultrafiltrazione. In questi
sistemi parallelamente al processo di tiasformazione enzimatica si pUO’
Ai fini
realizzare quello separativo ad opera della membrana
dell immobilizzazione i pohmeri acetato di cellulosa, polisolfone, nylon
cellulc a t.
oossono eaere funzioralizzati e n radi a i carbossi ic
o’ ea1i ar un iegan chimico
amm ci ossid ci ee I
I modo
Applicazione
enzima o substrato tipo di
bioreattore
ai finì di una migliore condizione di immobilizzazione.
Infatti la struttura asimmetrjca e’ caratterizzata, come si vedra’ sia nelle
membrane poiimeriche che nelle barrire ceramiche utilizzate in questo lavoro,
da una parte spugnosa di supporto e da uno strato denso che determina il
MW CO
li supporto spugnoso puo’ intrappolare in vario modo il biocatalizzatore,
mentre io skin denso assicura le pecifiche di MWCO.
Sono disponibili sul mercato moduli a membrana fabbricati con una vasta
gamma di polimeri e con differenti geometrie idrauliche che consentono di
scegliere il supporto piu’ adatto alle specifiche del biocatalizzatore.
Nella seguente tabella si riportano alcuni esempi appiicativi dei
biorcattori a membrana nei settori farmaceuitico e agroalimentare. In
questultimo campo Io studio dei bioreattori a membrana e’ indirizzato
principalmente alla produzione di bevande zuccherine, succhi di frutta,
dolcificanti a base di fruttosio e/o glucosio.
Farmaceutica
HFR
PP
TC
CSTR
CSTR
HFR
CSTR
CSTR
HFR
HFR
CSTR
HFR
HFR
Lipasi
Catalasi
Ureasi
Penicillinasi
Proteasi
Invertasi
Alimentare
uami1asi
(iluc, isomerasi
Maltoiasi
13-naiattosidasi
cellotdasi
poroso. resi ne dì fenolo-formaldeide, acciaio inossidabile pt di acrilammide,
cellulosa, allumina e collagene (Knopf, 1979). Nonostante tutti questi supporti
siano stati impiegati con successo nell’immobilizzazione dePa lattaio, nessuno
di questi sistemi e stato industrialmente applicato.
In questo lavoro sono stati utilizzati due tipi di supporto per
l’immobilizzazione della [3-Galattosidasi. uno di rnateiiale ceiamico ed un altro
polisolfonico.
2J Barriere ceramiche
Il supporto di materiale ceramico ha una geomeuia tubolare cilindrica
(i2mm diametro esterno. 400-600mm lunghezza) come si vede nella foto
ottenuta a! microscopio elettronico il materiale e’ costiwitr’ da uno strato
esterno di .-allunìina (spessore 1.5-2 0 mm). e da uno interno microporoso di
y-allumina (spessore i5-25prn costtuio da particelle da 2Onrn) che determina
le carattenstiche di selettivita’ e perineabilha’ del materIale,
Per la preparazione del supporto si i manda a Fabiani, Nannetti,
Vatteroni, 1989. 11 supporto e’ caratterizzato d una porosit& dei 35-40% e da
un diametro medio dei pori dello strato microporoso di circa l5-2Otm. Questi
moduli,
in oriine erano stati sviluppati per l’arricchimento per diffusione
che
gassosa dell’UF
28 (Fabiani, Nannetti, Vatteroni. 1989), ora hanno trovato
6
applicazioni come moduli da microfiltrazione e parzialmente come reatori
enzimatici
a
•.
o
:11 mlcrcoscopio elettronico d una sezione longitudi
nale del modulo
ccianhico
2_Meiihrane a fibre cae.poiisofoniche
[1 modulo a fibre ca e polisoiloniche e LSttUtO
da un fascio dì fibre
di polisolfone. L polimero ha come unita ripetitiva
il difenil—solfone:
.
i
.-
.
-.
iT gruppo -SO, risulta stabilizzato per risonanza grazie alla vicin
anza
dedi anelli aromatici I bue pairs degli atomi di ossig
eno garantiscono buoni
lcanìi idrogeno con le molecole di soluto e solv
ente. La presenza degli anelli
aromatici e dei sostituenti R, impedisce la rotazione
intorno ai legami C-C.
Questo polimero mostra interessanti caratteristiche
di resistenza alla T
rnax 75 C), e unottinia tolleranza alle variazion
i di pI--I (1-13). 1 moduli
commercial contengono membrane con un diam
etro medio dei pori che varia
da 10 a ?OOA, corrispondenti ad un cut-off (MW
CO) da 1000 a 500000. Le
fihie cav
engono prod tte con la tecnic della filabi a a secc
o e ad umido
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Sezione trasversa di una fibra cava polisolfonica.
I moduli a fibre cave, essenzialmente commercializzati per
ultrafiltrazione, possono essere impiegati per l’immobilizzazione di enzimi e
cellule. Nell’utilizzare i moduli a fibre cave come reattore catalitico si possono
adottare diversi schem.i di flusso idraulici (ultrafiltrazione, backflushing,
ricircolo, in fig.) a seconda delle esigenze
II
Imckfiushng
uitra1Htriio ne
t
ricircolo
Il mercato delle membrane offre una notevole gamma di moduli
caratterizzati da materiali polimerici diversi, struttura e geometria delle
membrane variabili. permeabilta e sv:uriro superficiale differente. La tabella
6 riporta le caratteristiche principah di alcuni moduli Amicon a fibre cave
impiegati come supporto di immobilizzazione per la J3-galattosidasi.
tipo
30.000
3OO00
10.000
30,000
cut-off
(dalton)
300
600
600
1000
superficie
(cm
)
2
n. fibre
1.1
0.5
0.5
0.2
d.e.
d,i.
(mm) (mm)
2.1
0.74
0.74
0.4
55
250
250
1000
Caratteristiche fisiche di alcuni moduli Amicon a fibre cave
H1P3O-43
HlP3O20*
HiPi0-20
VF2 P30*
utilizzati nel presente lavoro
i moduli a hbre cave utilizzati nel piesenee lavoro sono prodotti dalla
AmiconGrace e comnercbdizzati principalmente per ultrafiltrazione o per
perifusione di colture cellulari (Weiman, 1983).
Nel VF2 P30, il modulo cilindrie, ‘ungo 23 cm, con un diametro di 2.3
cm & compostr ò 1000 fibre cave pohsolfoniche poste al centro di un
rontcnitore di peiptx
un “it volume hbcro intorno all’insieme
che
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Nella figura e’ rappresentato il modulo a fibre cave polkolfoniche
VitaFiber lI P30 che mostra caratteristiche comuni ad altri moouli Amicon ma
anche alcune peculiarita’ nella particolare geometria dello shell side che in
questo modulo e’ localizzato al centro di un fascio di fibre cave polisolfoniche.
Questa particolarita’ comporta il miglioramento della fluidodinamica e la
riduzione del volume morto del modulo.
r
Pn”
Sezione del modulo VF2 P30
L’unita’ modulare che costituisce il reattore ceramico tubolare (Ra) e’
costruita montando la barriera ceramica, come e’ mostrato in figura, all’intento
di un housing di perspex o di acciaio Per la sperimenta7ione preliminare in
laboratorio il perspcx e’ stato preferito all’acciaio p’r le sue caratteristiuche di
trasparenza, leggerezza e isolamento teimico. Il prototipo e’ stato utilizzato per
la caratterizzazione delle presta7ionl dcl niateriale ceramico in scala di
laboratorio. Il volume morto all’interno di questo reattore e’ 240 cm’.
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Lattosio
o
Sezione longitudinale di una fibra cava,
O’
Lo studio di questo bioprocesso richiede un controllo accurato dei
parametri operativi per consentire al biocatalizzatore di svolgere la sua attivita”
specifica nelle condizioni di massima efficienza,
Temperatura pressione pII del mezzzo, oncentrazione del substrato,
tempo di reazione, sono i parametri ontrollati durante le prose di idrplisi in
continuo
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frazioni programmabile (tempo, numero degli eventi e oiume delle frazionbL
Tale coilettore puo’ conu oliare la contata della pompa in modo da
programmare opportunamente le fasi di avoro. Il peimeato cosi’ rac olio viene
analizzato con il Glucose Analyzei li.
Nel secondo aso le analisi ve we n
enuite i continuo da un
biosensore ai glucosio s ileppato apposir- mente.
4YeaIitaHii membrana
La pcrmeabilit& di membrana e definita dalla r lazi me
Jl AI
1
dove J C il flusso attravers la meinbfana (cin/see), Lr la permeabtlita’ di
volume 1
di membrana (sec cm!g)
i’ e la pression di trasmembrana
(dyn!cmi.
L’inverso della permeabilita di meinhiane e la resistenza di membrana:
R =l/L
La resistenza di membrana pu esserk emaciata alla viscosita’ dalla
relazione seguente:
R =
dove
e’ la viscosita’ (gicmsec) dei solvente ed A il coefficiente di
penneabilita’ di membrana, che dipende dai parametri caratteristici della
membrana, quali la porosita’ il diametro dei pori, li spessore, etc
Nelle fibre cave polisolfoniche, a pressioni di transmernbrana supenori a
L8 bar. si assiste alla deformazione strutturale della fibra e alla conseguente
perdita delle propriet& intriffseche del materiale (permeabilita’, dimensione dei
pon) fino alla rottura.
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-
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-
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Le barriere ceramiche possono sopportare pression: -di uansrnemhrana
iroito scpenoni (lO2O bar) e rappiesentano, per noto mof vo per altrl di cui
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Nella figura la permeabilita’ iniziale de mod
ulo VFIIP3O viene
confrontata con quella ottenuta dopo rigenerazi
one (lavaggio in contro
corrente con NaOH O,1M). La permeabilit& di un
modulo VFHP3O rigenerato
con questa procedura e’ pari al 34% di quel
la iniziale (1.7x1Og/sec cm
).
2
Sebbene la perdita di permeabilita’ sia cosp
icua il modulo mostra
caratteristiche tali da consentirne il riuso,
La buona permeabilita’ del VF2P3O rispetto ad altri
moduli a membrana
polisolfonica AMICON (H1P1O-20) ha creato presu
pposti interessanti per la
realizzazione di un bioreattore lattasicoin scala di
laboratorio
L’alta resistenza di membrana esibita dal mate
riale ceramico e’
onseguenza dello spessore elevato (1-2 mm) ma
non rappresenta un limite
operativo poiche’. come si e detto, con
questo materiale e’ possibile
raggiungere pressioni molto elevate e flussi di perm
eato consistenti,
-semplicita’ di trattamento
-uso limitato di reattivi e di solvente (acqua)
-tempi ridotti di trattamento
-recupero della permeabilita’ iniziale del modulo
Nella maggior parte dei casi la sterilita’ del supporto e’ un requisito
importante per il processo e raramente e’ possibile rigenerare il modul
o con
trattamenti che siano semplici, rapidi, poco inquinanti e nello stesso tempo
efficaci, E’ richiesta allora una fase di studio e di ottimizzazion
e delle
operazioni di lavaggio.
Nei moduli polisolfonici, la presenza del fouling di membrana non
consente il recupero totale della permeabilita’ iniziale, Nella rigenerazione
del
modulo VHIP3O, condotta con NaOH 0.1 M, dopo l’immo
bilizzazione
enzimatica si ha una riduzione della permeabilita’ iniziale del 60%. Dopo
un
successivo ciclo di lavorazione sullo stesso modulo si ha una perdita
di
permabilita’ del 65% rispetto a quella iniziale Cio’ evidenzia che la
rigenerazione del modulo non e’ completa e un suo limite oggettivo risulta
dal
fatto che la permeabilita’ diminuisce nel tempo.
La procedura di rigenerazione si effettua in flusso nella direzio lumen
ne
side-shell side con reattivi idrolitici (NaOH, NaCIO), e in alcuni casi
con
enzimi proteolitici. Il trattamento richiede alcuni giorni e una notevo
le quantita’
di reattivo.
Le operazioni di sterilizzazione del modulo polisolfonico richiedono l’uso
di reattivi chimici battericidi o batteriostatici (formaldeide, alcool
etilico,
ossido di etilene) o l’impiego di radiazioni (UV) poiche’ la steriliz
zazione
termica danneggia in modo irreversibile il modulo nelle sue caratte
ristiche
peculiari di permeabilita’, porosita’ e dimensioni dei pori.
Il materiale ceramico, dotato come si e’ visto di minore permeabilita’, ma
di maggiore resistenza alle alte pressioni, mostra caratteristiche interes
santi per
lo scale up di processo anche per quanto riguarda le procedure di rigener
azione
e sterilizzazione,
I moduli ceramici possono essere rigenerati termicamente a 900 °C in
muffola. A questa temperatura tutto il materiale organico viene ossidat
o ed
cI m nat Otto f riva di CO
2
O e SO. n un teripo re ati amente breve
t 7 ore’ deternunandn allo steo ter.po la te,;i:iz’ìzior’c
dei noduw’ I a
tecniche di immobilizzazione enzimatica.
I moduli ceramici si sono rivelati convenienti perche’ consen
tono di
lavorare in condiziont di pressione e temperatura che sono
mai sopportate dai
moduli polisoifonici. Inoltre la proedura di rigenerazione steriliz
e
zazione nei
moduli ceramici si presenta molto piu’ semplice e rapida, e,
senza consumo di
reattivi consente anche la sterilizzazione del modul
o. Pe rquesti motivi
moduli ceramici morrano caratteristiche interessanti non
solo per i processi
cataliticì ma anche per quelli separativi.
2.7 BIBI IOCRAFIA
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‘lu c sto t D galittoo
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Il mccc •ii odi ieat arie pmst i.. in(stIatn ti igura
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‘
I
ftidelILa1attosidasi
La 3-gaIattosidasi e stata isolata da animali, pian
te e microrganismi,
questi ultimi sono generalmente preferiti come fonte quan
do si vuole ottenere
una elevata quantita di enzima, Batteri, funghi
e lieviti sono tutti buone fonti
di 3-galattosidasi, Le proprieta’ di enzimi prov
enienti da fonti differenti
possono essere considerevolmente diverse (N.A
.Greenberg et al., 1981). La
tabella mostra alcune proprieta’ delUenzim
a proveniente da varie fonti
microbiche,
6.9-7.3
6.6
50
3 45
p1 I
opt
40
35
37
50-55
55-60
n,d.
NatK
Mn’,Na’
Mn ,K
nessuno
nessuno
Temp,
(ofattori
optimurn necessari I’M
n.d
540,000
540.000
135.000
201.000
9(1.000
124.(.XK)
n.d.
n.d.
4
1
2-10
n.d.
n.d.
Subunita’
7.2
55
nessuno
+
6.2
6(1
+
6,5
Proprieta della b-galattosidasi ottenuta da diverse
fonti nucroliche
fonte
non detrrminato
Aspergillus
niger
AspergiUus
oryzae
Kluyveromices
fragiiis
Kluyveromices
Iactis
Escherichia
(‘oli
Lactohacillus
termophilus
Leuconostoc
“itrovomm
n d.
Le differenti poptieta della -galattosidasi debb
ono essere considerate
quando si scegli il tipo di enzima da ut lizz r
‘I p oces Infatti fe wnra
tte mtc da urghì. che
pre’ema 1
condi loro t.na’i a p’-l ac’do a t”fflpertUn_
a aìt rita pc ere ut ‘a.,u
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3.3Lati4eIlga1attosidasi
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reazione di inibizione
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Dove:
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101
IRote °
La descrizione completa della cinetica di reazione dell’idrolisi del lattosio
o’ illustrata nel seguente schema (Flaschel, 1982).
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-
-tjttGc
K
li ìhi Lione e i eversthtle e di tipo coknpetitivo.
(mt; ore eompetoo per io sta \0 sito d; iegame:
La roir rcazoni consde ate sono:
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ottenbi1e daula ielazone \=K-9L). dne
1 presenta il nmers di siti attivi che partecipano alla reazione.
m
Tale custante, che tappi serita il numeio di tui nover” di tiri enzima. p
essere ifettiva li’ flt O 00 LtV ‘01
:11 1wepi ato enzimatico molto puro e I
ai itteriziat
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Itiene una ostante cm ‘tiea appai ente,
quaato (E) rappresent li r intit
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dt ,.c’tandc IaffinjLa
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V
eimmnione gmfire dtt parameW :tqetjcj
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Consideriamone i’invaso pci la dt
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-
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e con.iaoni
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i h) tud; cielI’, costanti &naiehe a l’atch vanno indisklui’is
1 e concdntrazionc dell’enzima.
‘)peraine attawfl di tenipeiatura p
LeI¼t.• ce! all sull’aulvita’ kl’nl’tica e mostrato nella tigurr della ptg!na
seguente lle ia1co mette in evidenza un massimo l attivita’ peeifi? PC
i; lattosw
un pII int.’tt’c a 4,S (ad un’i ttinperatura dì 40T ‘4 una concentrazione 1
del 5%).
L’effctto della temperatura sulla reaaone ‘idizzata daIfri Bgalatt.nsidasi
(lattosio 5% a pH 45) C mostrato nella ligura della pagina rcguente.
L’andamento ettenuto mostra un mas mio di atthita” a circa 50T
! incremento della temperatura provoca pero anche la ai ziaic denaturazier’e
erinica dell’enzima (Peteron. 19891.
Nella Jeterrnirazione dellattivua’ spec.ifica e’ stati utilizzata la minimi
ali&cainente rivelabile,
1
c”ltitt oi enzima che peiinette di cttenere un segnale ai
L’! ‘oncentrazione d’ enzima e percan kgata ai limite di iilevabilita’ della tecnica
anilitica utilizzata.
U/rng
13
20
i
Temperatura
30
40
50
Attivit& specifica in funzione del pII.
::
4
O
60
Attivita specifica in funzione della temperatura
+
(mM/min)
1
(mM)
(mM/min)
(mm)
40°C, 50°C). tutte a pH 4.5 in tampone citrato. La quantita’di enzima nel batch
statico di reazione e’ di I mg in un volume complessivo di 11 ml.
Il tempo di reazione e’ di 25 minuti, l’interruzione della reilzione avviene per
shock termico a 90°C per 8 minuti. Viene misurato il glucosio prodotto in
funzione della concentrazione iniziale di substrato. Il risultato e’ ottenuto dalla
media aritmetica di quattro valori.
Con il metodo dei minimi quadrati si ricava un’equazione lineare del tipo Y
b, i cui parametri hanno il seguente significato:
= aX
Y=1IV
X=1I(S)
b=l/Vmax
a=KmlVmax(l+(1)IKi)
La tabella mostra i valori di 1/V in funzione di 11(S) per una cinetica
condotta a 30°C in assenza di inibitore iniziale.
11(V)
(P)
(mM/min) (g/i)
1
Tabella: Idrolisi in assenza di inibitore condotta a 30°C
(S)
(g/i)
4.949
3.194
2.697
2.422
2,252
0.91
1.41
1.67
1.86
2.00
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
(S)
‘g/l)
1511
8.04
5.82
476
3.93
3.29
11(V)
(P)
(mM/ininY (gli)
1
30.30
30.56
40.78
30.97
1114
11.29
101)
200
30.0
400
500
60,0
T
(°C)
Vmax
mM/min)
52,01
5517
59.65
67.ì4
73,52
Krn
(mM)
6,26
8.82
12,60
16.55
22,97
(mm)
Costanti cinetiche in assenza di inihitoie con
10,0
20,0
30,0
404.)
0.316
0.445
0,639
0.835
1,156
50,0
i
R
0,998
0,998
0,999
0.997
0,997
1
f
i
suI
l
ti ottenuti
Le prove cinetiche fin qui esposte sono state condotte con un tempo di
reatiurie di 25 miiti per ovviare all’elevato L o.d, del sistema ad ossigeno.
In un tempo di reazione cosi’ elevato, i galattosio prodotto puo inibire in
modo rilevante i enzima e incidere notevolmente sulla determinazione della
velocita’ iniziale e dile altre c’o. tanti cinetiche. Le costanti cinetiche ottenute in
assenza di inibitore potrebbero essere percio affette da un errore e risultare
costanti cinetiche apparenti. Per ovviare a questo problema e’ necessario ridurre il
tempo delle prove cinetiche con l’ausilio di un sistema analitico piu’ sensibile.
Utilizzando un. sensore al glucosio basato su un elettrodo ad acqua
ossigenata (1 o4. i 0 M) sul campione non diluito si riesce ad abbassare il 1.o4.
ai un fattore 500. Un sensore di questo genere permette percio’ laccquisiziOfle dei
nati relativi alla cinetica enzimatica di idrolisi nei primi minuti di reazione. 11
sensore, di cui si dar& ampia descrizione in un capitolo successivo, e’ stato
assemblato nel circuito a flusso schematizzato in figura che consente di seguire in
continuo la reazione di idrolisi.
Una pompa peristaltica preleva dal batch di reazione (50 ml), immerso in un
termostato, una piccola quantita di soluzione che viene inviata al sensore per la
misura. Prima dì arrivare al sensore, il campione attraversa due serpentine in
accaio (lunghezza 10 cm. id=1 mm) che consentono di operare lo shock termice
(90’ C) per fermare la reazione, e. successivamente, il raffredamento del campione
a 30’ (‘ Dal momento del prelievo alla misurai operata in continuo sui batch di
reazione, passano circa 4 minuti e ciascuna prova cinetica puo’ essere percio’
completata in circa 10 minuti. Le prove vengono condotte a T=30’C, pH=4.5 in
tamponé citrato, con concentrazioni variabili di substrato (lattosio 0 5, 1,0, 2.0,
di reazione
NN
Quenceddaento
Pompa
peristaltica
Sistema in flusso per lo studio della cinetica di reazione in batch
*
d[G]=A dt
Nell’analisi differenziale dei dati ciiietici, la causa principale di errore deriva
dalla accuratezza con cui sono determinate le tangenti alle curve concentrazione
tempo. E’ per questo che per ogni valore di [S
], sono state effettuate tre curve
0
concentrazioneempo in modo che (-rs)
0 e’ rappresentato come media aritmetica
di tre valori di tangente all’istante iniziale. I dati sperimentali sono stati elaborati
col metodo dei minimi quadrati, valutando l’incertezza sui parametri a, b della
retta di regressione e determinando come questa incertezza si propaga sui valori
numerici dei parametri cinetici Vmax e
Il fascio di curve della prima figura (pagina seguente) segue nel primo tratto
un andamento esponenziale (cinetica del primo ordine), nel secondo tratto (di
raccordo) la cinetica e’ di ordine variabile, infine la reazione raggiunge lo stato
stazionario in cui la concentrazione di glucosio aumenta linearmente nel tempo
(cinetica di ordine zero):
d[G]=A:
*
[Gj=At+[Gj At =At+B
a
o
i
•
o’
te.
I
T3OC
t (miri)
.
Il
1/(—rs)o=(106f6.6)I/[S014 (1546±211)
tXyZ_094
Lt’
1’
M
2
j$fl
4
Vm
t
1
ax_
/4
(6•5jO
••
•9)It
SIO
K=(6.Btt.4)
+1”
i C
13.9mM
i.
con il
Lah
‘oiridono.
ma librio
e (Stanti detarmi at
primo metodo, in presenza e in a se iza di inbitore, non sono afCte dllerrore
ipo0zzato (imbi
attivita’ enzimatica) e saranno confrontate
ione
del
galatiosio
‘aili
attasico
oi quelle dclU’nzirna in mobilizzato sul reattore 1
16 Effetto_dello io te Calcio suiFidrolisì enzimatica
‘
WMai
orn
ad
altri
(1980),
in
un
Iav
ro ull’idrolisi del lattosio nel siero di
e
atte con enzimi immobihzzati, rrette
videnza l’inibizu ne della l
in
ba1attsdasi
io viene
esenti flCL siero
(fonte non specificata) da p
deli toi i ca ci
evauenziato dal conitonto del g ad di idrolisi del siero trattato in diversi modi
espresso in percentuale rpe o a
1 valoie 100 relativo all’idrolisi di una soluzione
di lattosio con la stessa concentrazione del sieio i a questi dati risulta che il siero
intero presenta il 49% di idrolisi, il siero deproteinizzato il 53% il siero
deionizzato /c,
88 Sulla btse di queste rforn azioni si e’ ritenuto necessario
F
enicare sia in batch che nel bioreattore l’evei tuale inibizione del calcio
Nel presente lavoro la determinazion della concentrazione del calcio in
campioni reali di siero ultrafiltrato messi a disposizIone da una industria lattiero
asearia e’ stata effettuata con un metodo potenziometnico diretto.
SViiLppat( dall ENEA, in
Ti sistea di misura c (cstìtuit da un ekitrod
ettivo all ioie (
collaboraìione con la ditta IDRONAUT (Brugberi Mii mo Il oste na la uso di o naforo disperso
(ETH 1001, FLUKA 21192) in una membrana d PV(’, di un elettrodo di riferimento di Ag/AgCI isolato
dalla soluzloi e campione da una membrana di acciaio di cellulosa e da un poten7ometro. E’ da
ricordare c v. ur ne odo potenziemetiico diretto con ISE in grado d stabibre l’atdvlta’ di uno zone in
da iic ‘e mm la sua concentrazin ‘ meno di tra’tanìent’ (dIIc,71 I Vr7 ur del pii eicvaa forza
ionica ecc i che consentano di rendre 11 c ff i n
i att ita un ca in Egura e rapptentat2 E retta
a++ co. imita c 11 SOI rioni Ci aIcio
i
d taratura utilizzata pcr fr misur (1 mV)
10 I og L
t
(E) oandard in una soluzione Na( iO ‘M
-A
1E3
/
/
E-i
-
E
E
2E1
7
il siero acido :pi14.6) utilizzato, ha un contenuto di (a(H) libero pari a 346 ppm. Questo valore
e piuttosto basso rispetto a quelli nportati In letteratura (500-1500 ppn0 (Robinson, 1’76). Nei campioni
di siero il calcio Obero diffensce da quello totale per una serie d equilibri di precipitazione c
compiesa7one con gli ameni inorganici e le proteine cariche negatiamente
L.
2
o-
2
—______
Cme
s
vede
netta
figura il pii determina la variazione deilattivita’ dello iene calcio che
raggiunee un mas’nio intornoapH=2.0-2
.
5
Nel siero in esame il calce’ Obero si aggira intorno ai 2 lo ppm.
Il calcio totale (670 ppm) e’ stato determinato acidificando il campione a pH=2O. A pi-i piu’ acidi
si nota una diminuzione della f.e rn.. Questo andamento e’ gia stato osservato in letteratura con elettrodi
calcio spectfìci costruiti con il rnedesirn ionoforo. Questo effetio potrebbe essere spiegato con una
modficazene strutturale pH dipendente dello innoforo (base sO Lewod che perde la sua specificita per
i
1
one
ca1co
(A:amam,
riir1
197).
40<pIfr5.-6
A
pH
pie’
si
o
la
diminuzione del calcio libeo e
da
a pii’( 0 Is piccipitazione dell’ldro?em lo i do sii caIro’ (pK
2 4
P
3
1
)
=721)
0
Ca’lO
100
200
350
SicrotF
.M;min;
3i0
2.2i0
2.21(0
4
Rio
Da questi dati risulta che la [3-galattosidasi da Aspergillus oiyzae non
subisce alcuna inibizione da parte degli ioni calcio.
3.7 Bibliografia
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5CCi).
Lo scopo de1iimmchii:zzazone consite neifa.ncorare saldamente il
mediatore biologico al supporto mantenendo la sua attivita’ per lungo
tempo.
srta preposta ui a vasta
Per I imir obilizzazione enzin
arica
1
gamma di iateriali di supporto e dl metodiche allo scopo di reahzzaie un
proces o continuo (l.Chibata, 1976, K Mosbach, 1976 11 A Messing,
19 6’ W,Marcon
989)
Questi metodi possono essere cosP riassnntb
i Legame covalente fra enzima e supporto polimerico tramite una
reazione con gruppi funzionali dell’enzima non coinvolti
nell’attivtK catalitica.
2 (‘rosslinking cosalente dell’enzima con polimeri naturali o
macromolecole sintetiche per reazione con rcagenti bifunzionali
3 Adsorbimento u una matrice insolubile tramite legami
eettrostatici interazioni idi ofobiche e legame idrogeno.
3.intrappolamento fisico in matrici pohmeriche. microeapsule.
fibre cave o fibre spugnose.
4AJgrnesykn±e
Questo metodo e’ il piu’ comunemente usato per processi di
immobilizzazione enzimatica in scala di laboratorio. Ji legame forte con il
supporto polimerico conferisce stabilita’ all’enzima nei confronti delle
tariazioni di temperatura, pH. foiza ionica, concentrazione del substrato.
etc.
Gli svantaggi deI metodo derivano dalla laboriosa e costosa
ocedura di immobilizzazione e dal fatto che molto spesso si ha una
g uificatis’a disattivazione dell’eniima dovuta al coinvolgimento dei siti
attivi nei legair i di ancoragg’o
-
-
-
I gruppi funzionali enzimatici disponibili per legami covalenti sono:
gruppi aminici delle catene laterali della lisina e arginina e gli
N-terminali delle catene polipeptidiche
gruppi carbossilici in alfa dell’acido aspartico e glutamico e i
C-terminali delle catene polipeptidiche
anello fenulico della tirosina
gruppo solfidrico della cisteina
gruppi idrossilici della senna. treonina e tirosina
gruppo imidazolico dell’istidina
gruppo indolo dei tnptofano
Per attivare legami covalenti fra enzima e polimero insolubile
engono seguite due strategie generali. La prima consiste nell’attivare il
gruppo funzionale del materiale di supporto e quindi consentire una
reazione con i gruppi della proteina enzimatica, la seconda nell’usare un
reagente bifunzionale per legare l’enzima direttamente al supporto.
4dCrossLiflkiDg
Il
reagente piu’ impiegato per questo tipo di legame & la
glutaraldeide. I metodi di immobilizzazione con questo reagente possono
essere di due tipi:
1) reticolazione intermolecolare fra molecole dello stesso enzima
2) adsorbimento dell’enzima su un materiale di supporto (polimero
naturale o artificiale) seguito da una reazione chimica che consente di
legare stabilmente l’enzima adsorbito,
Il primo metodo, nonostante le difficolta’ incontrate nel controllo di
un gran numero di parametri (concentrazione dell’enzima e del reagente,
pH. forza ionica, temperatura. tempo di reazione, etc.), ha il vantaggio di
fornire aggregati voluminosi che sono attivi e insolubili.
In
questo modo sono state ottenote importanti applicazioni
industriali glucosin isonerasi della Novo tWCarasik et aL 1983)
Collagene
Cellulosa
Bentonite
Sepharosio
Poliacrilamide
Glutaraldeide
Glutaraldeide
Tricloro-triazina
Tricloro-triazina
Glutaraldeide
4d,3 Adsorbimento
isomerasì
Invertasi
Chimotripsina
Fosfatasi
Glucosio ossidasi
Tripsina
Laltasi
i ripsina
Aldolasi
Papaina
Ureasi
Glucosio ossidasi
Gli enzimi possono essere adsorbiti su materiali insolubili organici
o inorganici. I piu’ comuni supporti usati sono chitina, sepharosio,
cellulosa, allumina, collagene, etc,
Tabella: Materiali di supporto per l’immobilizzazione per adsorbimento
Polimeri
sintetici
Proteine
Inorganici
Polisaccaridi
Polifenolo
Polistirene
Collagene Bentonite
Vetro
Allumina
Magnetite
Organici
Chitina
Carragenano
Cellulosa
Amido
Sepharosio
Agarosio
Alginato
4J4_Intra9kiento
Questo metodo e basato sull inclusione dell’enzima nella matrice di
un polmero di supporto. Il polimero consente la diffusione dei substrato.
ma non la fuoriuscita dell’enzima quando le dimensioni molecolari sono
maggiori del diametro medio dei pori dei supporto. Poiche’ non c’e’ la
formazrone di un legame fra enzima e matrice non si ha perdita di
attivita dovuta a impedimenti sterici o a modifiche dei sito attivo, come
nei caso frequente del legame covalente. Gli enzimi possono essere
intrappolati ali Interno di mrcro apsuie. liposoini. fibre cave e membrane
in generale costituite da vari supporti (organici e inorganici).
-
I maggiori vantaggi di questa tecmca sono:
semplicita’ operativa e basso costo di immobilizzazione,
elvvata resa di intrappolamento enzimatico,
possibilita’ di immobilizzare piu’ di un enzima a vari
livelli di purificazione.
facile recupero dei prodotti di reazione.
possibilita’ di confinamento e recupero di cellule.
-
4.1.5 1rnmobihz4one della -galattosidasi
E’ stata sperimentata (Pizzichini e altri 1988) l’immobilizzazione
della lattasi su fibre cave polisolfoniche principalmente per via fisica
Moduli Amicon del tipo HIP1O-43, H1PIO-20. HIP3O-43 assicurano, in
configurazione back-flushing, la completa ritenzione dell’enzima, ma
mostrano dei limiti operativi in termini di permeabilita’ idrauiica Questi
moduli infatti ad una densira’ di carica intorno a ‘2 mg/cm a cui
coirisponde una resa dei 47% con lattosio 5%, presentano una sensibile
riduzione della per ieab’l’ta’ id aule i cht ron fO( essere compensata
dell enzima permeano attraverso la mambrana. Cio e’ spiegabile con li
F2
1
significato statisbco del valore di cutoff, che evidentemente nel \
presenta una curva gaussiana piu’ allargata.
Per cercare di conciliare la buona permeabilira’ del modulo VF2
con la necessita’ di ritenere quantitativamente la [3—galattosidasi, si e’
impiegata una polvere inicrocristallina come lallurnina in modo da unire
il fenomeno di adsorbimento (enzirna-allumina) all’immobilizzazione
fisica sulla membrana.
-
quantita di enzima: 0.05g. 0.lOg, O 20g,
0.30g. Le sospensioni vengono
agitate per 30 minuti e poi centrifu
gate per 2 ore a 3500 rpm, per
permettere la sedimentazione dellallumin
a e dell’eventuale enzima
adsorbito. 11 supernatante viene analizz
ato all’UV (280 nm) e, dopo aver
aggiunto lattosio 5% al Glucose Analyze
r li. Le misure all’UV vengono
confrontate con una retta di taratura
fatta con lo stesso enzima a
concentrazioni che vanno da 0.01 g/I a 0.2
g/I.
Entrambe le procedure di controllo hanno dim
ostrato che in batch il
rapporto stechiometrico tra allumin
a e galattosidasi e’ rispettivamente
21.
La carica enzimatica viene preparata invia
ndo una sospensione di
500 mi d tampone ritrato (25 mM
, pIi 4,5) contenente 0.5 g di
gaiattosidasi e I g di allumina.
Questa soluzione viene trasferita nel reatt
ore a temperatura costante
(30°C) e ad una portata piu’ elevata di
quella di lavoro (5 mllmin) per
permettere una distribuzione piu’
uniforme del complesso enzima
allumina sulla superficie delle fibre. Il
caricamento e’ avvenuto inviando
i 500 ml di sospensione enzimatica
e ricircolando successivamente il
permeato per almeno 4 ore, I con
trolli dell’immobilizzazione hanno
mostrato la completa ritenzione dell’enzim
a all’interno del bioreattore.
Come osservato in precedenza lint
rappolamento fisico e
l’immobilizzazione chimica hanno,
in linea di principio, effetti
contrastanti sull’a.ttivita’ e sulla stabi
lita’ dell’enzima. L’esigenza di
ottenere i vantaggi dell’una e dell’altra
tecnica d’immobilizzazione ha
suggerito di condurre una procedura di
tipo misto (fisico-chimico).
Per far questo si e sfruttata la reaz
ione di reticolazione (cross
hnking) tra l’enzima e la BSA ad oper
a di un reagente bifunzionale quale
J
Tempi di reazione: L’effetto della reticolazione sull’attivit&
enzimatica e’ stato seguito nell’arco delle ventiquattro ore. Per
concentrazioni di glutaraldeide pari allo 0.1 qc non si hanno
effetti negativi nelle prime sei ore di reazione.
considerate
Concentrazione della glutaraldeide: Sono state
diverse concentrazioni di agente reticotante (0.1 1 0 %). Dalle
prove rìsulta che concentrazioni di glutaraldeide inferiori al I %
non determinano la denaturazione dell’enzima,
Prima di procedere allimmobilizzazone. & stata e.eguita
dell’attivita enzirnatica in batch in diverse condizioni di reazione. Sono
stati valutati i seguenti parametri:
-
-
Composizione delle soluzioni di lavaggio per determinare il
quenching della reticolazione: poiche la reazione di
reticolazione, se prolungata nel tempo. puo’ avere effetti dannosi
sull’attivita’ enzimatica, si e’ realizzato un sistema di lavaggio
che allontana la glutaraldeide e contemporaneamente reagìsce
con essa bloccando i suoi gruppi funzionali. Per questo si usa
una soluzione di lavaggio a base di glicina (0.03 moii/L in
tampone citrato). I gruppi amminici della glicina reagiscono con i
gruppi carbonilici liberi della glutaialdeide fermando la reazione
di reticolazione.
La valutazione di questi parametri e’ stata effettuata impiegando un
biosensore per misurare il glucosio piodotto nelle diverse condizioni
dopo l’aggiunta di lattosio 5
/c
Nella figura seguente e’ riportato lo schema delle reazioni coinvolte
nell’immobilizzazione condotta con la pi ocedura 135 A -gi utaraldeide
Gli esperimenti pieliminari condotti in batch hanno consentito la
+
2
Q
)
—
HCC
—
H
(C
&
i{
11--
-
1
rIfti [iI
4
C II (CH) CHC
rt) +no
4
tiO
4
e analisi & attivita’ su’ permeato
con il bioseusore a glucosio e le
misure di assorbanza allo spettro
fotoinetio 1V a 280 unì hanno permes
so
di fermare la reazione di reticola
zione solo quando la f3-galattosidas
i era
stata totalmentc trattenuta dal
modulo. Ailinizio del ricircolo infatti
e”
possibile riscontrare nel permeato
il passaggio di [3-galattosidasi e di BSA
che decresce nel tempo fino ad anu
llarsi in ui tempo massimo di 5 ore.
Concluso il nei colo si puo
procedere al lavaggio della glutara
ldeide
libera con ghcina 0.03’moli/L
in tampone citrato.
(I’)
i,fl;
90
100
80
I
3
9
i)
1000
9C
Ore
?
Th3
1500
h
27
2000
La figura successiva mostra il funzionamento per 2300
01-e in
conimuo
del bioreattore, nella prova di immobilizzazione per
reticolazione; nel grafico sono riportati i valori di resa
idrolitica nelle
seguenti condizioni operative: temperatura 30°C, porta
ti di alimentazione
I mi/mio, lattosio 2. Il controllo della resa idrolitica
e’ stato effettuato
con un sistema appositamente studiato per il mon
itoraggio on line. Le
analisi del glucosio prodotto sono compiute ogni 3 rninu
tiin questo caso,
non e’ possibile valutare il tempo di decadimento dell’at
tivita’ enziinatica
o la vita media del bioreattore perche’ il siste
ma in 3 mesi di
funzionamento non ha mostrato nessun decremento delle
sue prestazioni.
n
in
500
Questo risultato e’ pai ticolai mente interessante perc
he olti e ad
evidenziare la stabilita reattiva nei tempo a valoi
i elevati di rendimento
-
0
0
0
=-It !j
T3C C
1,0 ‘,t
¶2’ 3
balt
c
4
1dc
¶,A
¶,E
,0
resa idrolitica a parita’ di altri parametri operativi.
Sono state adottate le seguenti condizioni:
temperatura 30 C
portata i mi/min
substrato, lattosio 2% e 5%
Sono state effettuate tre cariche enzimatiche successive (0.5, 0.25,
0.25 g di enzima in questo ordina)
Per ogni carica enzimatica il bioreattore ha lavorato 72 ore in
continuo. In figura la resa idrolitica viene espressa in funzione del
ioading enzimatico, cioe’ del peso secco dell’enzima rispetto alla
superficie di membrana, per le due diverse concentrazioni dì substrato.
70
60[
0,4 0E 0,6
La figura mostra che all’aumento della quantita’ di enzima
immobilizzato corrisponde un aumento della resa di trasformazione
—
CC
-
——
4t
oo
TSQC
20
Q1Ps
%
n
tc o 0 5%
‘°
00
e nel determinare
ante
inip
t
to 1
t
rno
La concentrazione di substrat
la resa idrolrtica del bioreattore Nella tlzìna J mostrata la resa a
differenti concentrazioni di substrato neila rova di immobilizzazione
della f3-galattosidasi per reticolazione
r
so
40»
Zo
orLata sulla conversione
h)nveISIcfl
in
A parita” di altri pararnelii ut ari temperatura portata e arica
enzrmarica, minore e’ la eoneenriazone di lattosio e mangiore e’ la resa
to da
conseguenza sia della qua itita minore di substra
idrolitica. Cio
convcrtrre sia del fatto che la quantita” di giucocio e di galattosrti prodotti
e’ minore e quindi anche il grado di rnioizon dovuto al galattosio
424 Effetj4jIa
na ulla
1
deterim
Pa portata ha ne effe’ c
operative
rana Effetto della portata
20
20
20
50
50
S(lattosio)
Q
(mllmm) (g/i)
(Mgluc/Msub)
0.5
1.0
2.0
1.0
2.0
Vp
(mgfmin)
0.45
810
i3.00
15.75
23.50
90%
81%
65’*
63%
47 k
ivello d’ procso si posono scegliere le condizioni operative’del
inibizione da piodotto. cGntenuta ad alte portate, le quali pero’
influiscono negativamente sulla iesa idrolitic.a.
-la velocita’ di reazione viene ad essere influenzata dai
meccanismi di trasporto diffusivo determinanti a basse
elocita’ di alimentazione, e dai meccanismi di trasporto
wnvettivo ad alte velocita’ di alimentazione;
-differente tempo di contatto tra substrato ed enzima, che spiega
raumento di resa a bassa e1ocita’ di alimentazione;
Mentre la velocita’ di produzione aumenta con la portata la
percentuale di conversione diminuisce come conseguenza di divers;
effetti:
A
temperatura un aumento dell’attivita’ catalitica.
La letteratura riporta che oltre il 37’C tale incremento viene
controbilanciato da una disattivazione termica pin’ o meno sensibile a
seconda del tipo di enzima e della sua condizione fisica operativa (enzima
libero o imrnobilizzatoì(RS Peterson ce ai., 1989)
L’enzima in oggetto, in batch, presenta una brusca inversione
dell’attivita’ enzimatica oltre i 50”C.
Sui reattore, e quindi in condizione di enzima immobilizzato, si e’
voluto verificare questo effetto. I .e prove sono state eseguite sia sul
bioreattore ottenuto per adsorbimento dell’enzima su allumina che su
quello ottenuto per reticolazione con glutaraideide.
T C
d T C
t 4
T
DrtttodwigaHuiifla
La figura mostra la resa idrolitica del reattore (immobilizzazione per
adsorbimento su yalluniina) a temperature fra 55O°C.
L
7
50
zol
C’or ver one a dive. se ts upelature. (immobilzzazi me con A1
)
3
0
2
-—-
-—
O
O
t-c h’
40
catalitica. mentre dopo 80 ore di lavoro ad alte temperature (45-50°C) e’
visibile la disattivazione termica,
Infatti mentre il tempo di vita medio ad una temperatura di 30°C e’
di 1590 ore, tale valore scende a 200 ore per una temperatura di esercizio
di 45°C e viene ulteriormente dimezzato a 100 ore ad un temperatura di
50°C.
Nella figura viene mostrata la resa idrolitica alle temperature
comprese tra 15°C e 50°C nella prova di immobilizzazione per
reticolazione.
o
[
70r
20F
O
Nella figura successiva si riassumono i risultati resa vs temperatura
e si confrontano con quelli ottenuti precedentem,nte con un modulo
HIPIO-20 con una densita’ di carica di 1.66 rng/cm.
La figura indica che l’immobilizzazione con illumina diminuisce
lievemente
la
di ‘attivaziont.
term ca
d °il enzima
rispetto
0
40
3
B
Iri!
3
IvcIi
40
0)
ker,,eralura
40
tpot HW1Q’
20
20
O
—-——.————----
E??t
20
DflZIrTS
—
20
,_—‘
Z
13
ZM drbtto
t
Fffetto della temperatura sull’attivita dell’enzima immobilizzato
intrappolamento, adsorbimento, reticolazione,
ie odel siero di latte
per
Nelle prove reattoristiche descritte finora, si e’ sempre utilizzata
una soluzione artificiale di lattosio; nell’ottimizzazione del funzionamento
del bìoreattore lattasico a fibre cave e’ molto importante verificare il suo
comportamento in presenza del substrato reale da utilizzare nei procecsso
industriale, il siero di latte,
il confronto dai dati di conversione ottenuti con e senza il calcio
hanno mostrato che l’enzima in queste condizioni non risente della
inibizione documentata in letteratura dovuta allo lone bivalente. Infatti la
resa idrolitica media (63), in queste condizioni operative. rimaie
10
30
Cb
O
b*—IattosWnI
0<
C_
60
60
-
00
,i
2 ;tts 0s!tic 4 4%)
lmi’rnln
00
TflC
,L
00
00
60
60
epo Ch)
J
eale spenmentazione del sistema a livello di impianto pilota.
I
0
Resa idrolitica nei tempo con ii substrato ‘cute’ il siero dilatte
ultrafiltrato.
43 Conclusioni
Il bioreattore lattasico a membrana e’ un interessante sistema per
idrolizzare in continuo il lattosio contenuto nel siero di latte.
Lo studio e 1
-o sviluppo del bioreattore ha lo scopo di ieahzzare un
nroeesso di valonzzazione e recupero dei costituenti naturali del siero,
n’eramente basato sull’impiego delle tecnologie di membrana (processi
separ ativi bioreattore, biosensori)
Il bioreattore ottenuto per immobilizzazione della galattosidasi su
etro poroso. sefarosio,
’u’ avanzato
1
fibre cac. eotituisce un sistema reattivo notevolmente 5
rimetto ad alto supporti enzirnatici izeoliu,
lizzazione dì enzimi o cellule
realizzata per semplice filtrazione;
possibile purificazione dell’enzima durante la fase
di
intrappolamento, per permeazione dalle eventuali impu
rezze
attraverso i pori della membrana:
debole disattivazione enzimatlca da paite del polirnero di
supporto;
soddisfacenti flussi di permeato a basse pressioni di eserc
izio ( 5
mI/min a 0,01 bar);
distribuzione relativamente omogenea sulla superficie delle
fibre;
possibilita’ di recuperare l’enzima immobilizzato per
semplice
inversione di flusso all’interno del modulo;
possibilita’ pratica di sceglmere, anche in fase operativa
, la piu’
conveniente configurazione idraulica del modulo
(ricircolo,
backfiushing, ultrafiltrazione).
Lo studio in oggetto ha consentito di corre
lare le prestazioni
idrolitiche del reattore alla specifica tecnica
di immobilizzazione
impiegata.
I risultati migliori in termini di vita media e di resa
idrolitica del
reattore, sono stati ottenuti reticolando con glutaralde
ide la -gaiattosidasi
e la BSA.
Questo aggregato viene trattenuto dalla membrana
polisolfonica in virtu’ delle piu’ elevate dimensioni mole
colari.
In queste condizioni, con un singolo passaggi
o del substrato
attraverso le fibre in backflushing si ottengono a
30°C rese idrolitiche del
97% con lattosio 0.5% e del 70% con lattosio 5%.
Lattivita’ enzimatica del bioreattore esprimibile in termini
di rese
idrolitiche e/o di produttivita’ rimane particolar
mente stabile nel tempo
per 2300 ore continuative di idrolisi,
Inoltre queste buone prestazioni del bioreattore sono
state ottenute
in condizioni di esercizio del sistema parti
colarmente blande per
temperatura (30°C) e pressione (0 20 6 bar).
Cio’ dimostra che il
sistema operativo del reattore puo’ essere ulter
iormente stressato per
ottenere prestazioni arcora SUCi oti sofr?ttutto in term
ini di ioduttvita’
‘
-l’enzima e’ in grado di operare ad elevate rese (709k anche con un
substrato da siero di latte (lattosio 4.4%) p ecedentemente
ultrafiltrato;
-la quantit& di monosaccaridi ottenibile per idrolisi cnr 0.5 g di
enzima non e’ valutabile a pieno per i lunghi tempi di vita medi del
reattore, ma e’ comunque superiore ai 100 Kg;
-il sistema e’ particolarmente flessibile per soddisfare le diverse
esigenze di lavoro esso puo’ fornire elevate rese idrolitiche o
alternativamente elevate velocita’ di produzione di monosaccaridi.
Questo studio ha consentito una reale ottimizzazione del reattore
enzimatico a fibre cave precedentemente studiato pnsso l’ENEA in
termini di messa a punto delle procedure di immobilizzazione e di
..ontrollo in linea tramite biosensori,
Questi due aspetti significativi hanno consentito rispettivamente di
stabilizzare la produttivita’ ad elevate rese idrolitiche e autornatizzare il
processo complessivo di idrolisi del lattosio come si richiede ad un
impianto pilota.
4,4 BIBLIOGRAFIA
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raggiunte nel modello.
La resa di una reazione chimica in un reattore continuo e’ controllata dalle
stesse variabili che controllano la velocita’ di reazione, dal tempo di permanenza e
dalla distribuzione della velocit& degli elementi di fluido La velocita’ di reazione
e’ controllata a sua volta dalla concentrazione dei reagenti, dalla temperatura e, nel
caso delle reazioni eterogenee, dai fenomeni diffusivi. Quindi la conoscenza della
distribuzione dei tempi di permanenza degli elementi di fluido nel reattore e’
fondamentale sia per la sua caratterizzazione fluidodinamica che per un eventuale
scale-up ad impianto pilota ed industriale.
ernanenza de li elementi di fluido
Per determinare tale distribuzione ci possiamo servire di alcune tecniche
sperimentali che possono essere classificate come tecniche stimolo risposta. Lo
stimolo e’ costituito dall’iniezione di una sostanza tracciante nel fluido che entra
nel reattore (supponiamo di aver gia superato la fase di messa a regime e di
trovarci in stato stazionario), mentre la risposta e’ costituita da una registrazione
nel tempo della quantita’ di tracciante che esce dal reattore. Come tracciante si
puo’ usare qualsiasi sostanza che non perturbi lo stato fluidodinamico del sistema
in esame e che possa essere facilmente rivelata.
I metodi di stjmolo si differenziano per il modo in cui viene inviato il
tracciante. Nel nostro caso e’ stato utilizzato il metodo del segnale a gradino. Al
tempo t=0 viene effettuata una immissione a gradino di un tracciante a
concentrazione nota (C) nel flusso di alimentazione; la registrazione in
funzione del tempo della concentrazione di tracciante in uscita, misurata come
(C/C) prende il nome di CURVA F.
1l tracciante utilizzato nel nostro caso e’ il glucosio 50 mM, e, tramite un
sistema di monitoraggio in continuo (biosensore a glucosio), si e’ seguita nel
per t>t
per O<t<t
informazioni sul comportamento fluidodinamico del reattore, Per i due sistemi
ideali di flusso le curve F hanno la forma:
F(t)=O
a) flusso a pistone
(2)
F(t)l
h) mescolainento perfetto
-
/
:7
O
/,
YF2 3O
(3)
F(fl= i et)
Nelle figure sono mostrate due curve F del VF2P3O a due differenti portate
di alimentazione,
D
o C
o
0.5
0.4
0.3k
02
0
6
0
6
20
26
30
La curva a Q=12.7mllmin ha la forma di mescolamento perfetto, mentre
quella a Q=2.13 mllmin presenta una “coda”.
Sperimentalmente e’ stato notato che questa “coda” scompare a portate
Q>5.6 mllmin. La presenza della coda e’ dovuta alla diffusione assiale del
tracciante che diventa piu’ importante e rivelabile a basse portate. Da queste
considerazioni si deduce che il comportamento fluidodinarnico del VF2P3O e’, con
buona approssimazione, quello di un reattore a mescolamento totale (Cheryan,
1986). In seguito si vedra’ che questo risultato e’ stato raggiunto anche per via
teorica. Sono state eseguite diverse curve F a differenti portate Q riportate in
tabella con i corrispondenti valori del tempo di permanenza. Tali valori sono stati
misurati integrando le aree.
Q (mi/min)
18.23
10.92
9.86
6.41
6.02
5.85
5.24
3.87
t(min)
Tabella: Tempo di residenza in funzione della portata
1.1
2.9
5.6
7.3
10.7
12.7
13.7
17.0
___._L__J
La simmetria del sistema e’ iiindiica. Nella tigur
a. le frecce indicano la
direzione del cammino de! fluido (configurazion
e hacktlushing). La zona I
(esterno della fibra) viene alinientata con la soluzion
e di partenza: nella zona 2
(interno della fibra) avviene la ieazione chimica; nella
zona 3 (lume della fibra) si
raccoglie il permeato con i prod
otti della icazione.
a e’ i raggio inteino della fibra,
b, il raggio esteino.
(ha) e’ lo spessore della fibia.
r e’ la coordinata radiale con l’oi igine posta sull’asse
della fibra cava:
L e’ la lunghezza della fibra.
Per effettuare il bilancio di materia. ci riteriaino all’e
lemento jnfinitesirno di
volume della fibra cava, dV, di spessore dr e di
lunghezza L.
Stabiita la geometria del sistema scegliamo il com
ponente rispetto a) quale
nferiie il bilancio di materia: considcnanm il subs
trato (S ). Allo stato stazionario
il bilancio di materia rifei ito all’elemento di oItim
e dV i Ispetto al substrato e’:
EZZZhL.
Le dimension> dei tenni iii del la i i sono i> ol i/tcm
p0)
Lplieitiamo ara i termini della il >. li ‘.uhsrato
entra nell’elemento di
volume con due ima Lanimi J tr
ap >n d> inatei in,
4
-
AP(’T
(I)
()
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a UtfljOA
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——
— —
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t
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9
tR861 i!soUH
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I!
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a auaizraa ‘p n;pop. vj aqz owrnsr’atd onpzuni a
auomzeai ip ,n:aoja cjzp auoassaidsa mqIns !UOtlwaPtSuOa QUfl’IC OWV!3W
ino i 8 con eriite tcmpo
i
j=t moli/mio nigE)
in
-—
fibra
uniforme
Se ora definiamo la densita’ di distribuzione dell’enzima in fibra come:
‘‘rtmx
deilenzima
quantila di enzima in fihra
= volume delle fibre cave
[6di__
F (mg)
VF (dio
=fl
cioe’
]=
;(mg)/V(drn
1
[E
)
\(dm )/EhtCl( ang)j 3
S convertte!man dm
fihr
3
si suppone una disti ihuzote
indipendente da r s puo scrivere:
(‘max)
=(moii
0
‘iie
\‘F! \ ma ìha’c \‘batehi EE/Lbatc’ì=
-1
Q uind tra (V,.j:4)h espresso ìfl moli ì,nuì 4ing Enz? e Vrnax (velocita
di reazione in fhra) esresso in moli rnin
1 (dma fihra) esiste un fattore di
conversione che e’ sempIcemente la densita di distribuzione dell’enzima in fibra.
Dobbiamo considerare, inoltre, che l’enzima, durante il procedimento di
immobilizzazione, pecialrnente se di tipo chimico, subisce una perdita di attivita’
dovuta alla denaturazione irreversibile di una parte delle molecole enzimatiche Di
questo fenomeno sa tiene conto mimeicamente introducendo nella (7) un
coefficiente adimensionale O<1)< I detto rendimento di immobilizzazione. Dalla
(7) n risulta univocain nte definito coinr (Marconi, 1989):
po
u
1
/2Thi1 dc/di
:e• cia
(9)ii
loi ma
2°
d
adimdnsionale
)j
esso
viene dato
compalono grandezze appartenenti tutte
LOflÌ1iiC
ucfla
9
ih
Vmix /D
e un
e i appresenta il i ;mppoi tu tra il meccanism
o di
lasieme e anello di trasporto di materia
per
un numero adiniensiontlu.
in LUI
la
2
l
c
/d
d
r dc/rdr (ri
Sviluppando gli incieiien’i InhiniteinH e
ricordando che v(’ )=Q/27tLNr
locita radiale di fluss) si ha !equaziow difle
renziale:
‘9)
di bdR
/
R=r/b
1
dc
d
C
=c
Per guneralizzare I’ejuìionc traslorniian
ando le seguenti sostituziom:
i i
0
C=c
/c
Ki43
KMkO_d. 9
intrinseco cioe
d
C
/dR24(i+Q/27tLDN)dC/RdR=[hV*
(I O) 2
ti rappolto
tk stesSo sistema)
111
moto
(Q/2ThLDN) e
Peclet (Pe)
di
“ome di Numero di
TLporto di Inatii in
fN0fli anImale.
ii’
(12)
dC’AIR=O iti R=aìb=r
1
1 a UI) e’ un°quazione differen7iaic del si’condo ordine a coefficienti
vanabili. L integrale della (li). con le condi7ioni (12), e’ una funzione di R,
(=f(R) che iappresenta il profilo di concentiazione dcl substrato all’interno della
fibra
della
La seconda condizione della (lui deriva dalla considerazione che per R=r
1 si
annulla il flusso di mateia per diflu’ione radiale, cio’ comporta che il profilo di
concentrazione in tale p’inlo ha una tangente oiinontale.
0 per R=n ( la frazione di substrato non convertita che esce dalla fibra,
dC
quindi I -CJC’
=X tappresenta la conversione.
0
La conversione e’ la giandezza che si determina diiettamente mediante la
misura del glucosio nel permeato. Detto questo il passo successivo e’ quello del
confronto dei dati di conversione calcolati con la (11) e la (12) con quelli misurati
sperimentalmente A tale proposito sono stati detenninati sperimentalmente i
valori di con’ eisione in funzione della portata nelle seguenti condizioni operative:
•‘e’ ewan’err.
-quantita’ di f3-galattosidasi immohili,zata in fibra 1500mg
-T=30°C
.50 in tampone citrato 25 inM
4
-pH=
concentraiione iniziale di substrato=0 139 M
Dalla (ll)si sede che.
Xr f(O43. sP
. Pe)
2
.O.[
3
’1rsono suo t :ak.1:ati LiiiIirIan’Iu i valori numt’rci
UI
FIBRA
.
.
.-
T $‘C
s,•ui
‘a
-a
l’a
iulia
—‘G
—.
-
quesw punto gli unici parametri della curva C=f(R) restano il numero di
I’. clet (dcc’ in ultima analisi la portata di alimentazione), ed il rendimento di
immobilizzazione T).
La (I I) e’ stata integrata numericamente con l’ausilio di un calcolatore MS
1)05 286 ed un programma in basic clic utilizza il metodo delle differenze finite.
ale elaborazione ci fornisce il valore della concentrazione di substrato in 7 punti
sII’ f bra.
Il problema principale e’ quello della determinazione di T). Questo si risolve
assegnando valori diversi ad fl e confrontando il valore di conversione calcolato
ad una portata di alimentazione con quello ottenuto sperimentalmente alla stessa
portata Alla portata Q=lml/min, Xsper=(
)% con 1)=O.8 si ottiene
5
±O.
38
SYO con 1=O.6 Xjc=
4
Xcalc•=
% Questo significa che il rendimento di
5
O
4
immobilizzazione, che tiene conto dei molteplici effetti sulrattivita’ enzimatica
dovuta alla reticolazione con glutaraldeide. alle interazioni con il supporto ecc.
puo’ essere calcolato in modo indiretto. Si e’ assunto come rendimento di
immobilizzazione T)=60%.
In figura sono riportati i profili di concentrazione del substrato calcolati in
fibra alle varie portate di lavoro
e
‘a.
ai
.-
•
--
(mi/miri)
Xmi
1
X
rella figura segi no e n-dl tabella sono controntati i valori conversione
ottenuti sperimentalmente a diverse portate con quelli calcolati ponendo fl=0.6.
Q
——
\
\
——
L.
-
5
o X ccoblo
Tao
$
5
0.9
76.0%
(76.0±l.6)dt
1.8
64.3%
(61.4±0,5%
3.4
52.8%
(53 62.2)%
4.8
47.0%
(47,0±0.41%
6.0
43.0%
(41 4±1.21%
0(38+0.5j%4ft5%
a.lg
X .=l.O2’X
i =0.994
mts
calc
r= 0.989
se
7C
a
5
O l&lfl)
Conversione in frazione della portata:
t’onfrcnto tra i dai’ spc ncntali e quelli calcolati
‘effetto di certe variabili sul fenomeno senza conoscere le equazioni fondamentali
che lo regolano. Questo metodo e particolarmente adatto quando sono in gioco
resistenze chimiche e diffusive, Si e agito in particolaie sulla temperatura poiche’
in generale ad un aumento di temperatura segue un aumento delle velocita’ dei
processi chimici e fisici. In particolare la velocita di una reazidne chimica e’ piu’
sensibile ad una variazione di I a bassa temperatura che non ad alta ejO’ deriva
dal fatto che il logaritmo della costante cinetica di una reazione chimica e’
funzione lineare di i/I.
Si introduce percio’ un coefficiente di temperatura definito come il rapporto
ra due velocita di reazione misurate a I e 1+10°C (in cui prefenbilmente
=15°C).
R(T=l5C)
Un coefficiente di temperatura maggiore di 2 caratterizza un regime
chimico; un coefficiente minore di i 5 caratterizza un regime dinamico (nel nostro
aso diffusivo). Nei casi intermedi puo esistere un regime misto chimico
dinamico.
In figura e’ riportata la produttivita’ in funzione della I nelle condizioni
operative indicate.
10
o. cz
5
Il coefficiente di T e’:
20
26
30
02
tWr$tU
C
.0
15
50
1.2< 1.5
questo risultato ci permette di affermare che per Q=1 mi/miri il regime e’
diffusivo, cioe’ lo stadio che controlla la velocita’ del processo e quello della
diffusione molecolare. Inoltre, l’analisi del numero di Peclet mostra che il
trasporto di materia per diffusione molecolare e’ significativo in tutto il range di
portata di alimentazione swdiato,
0.02
0.04
0.08
0.11
0.14
0.16
Numero di Peclet
Tabella 8 :Numeri di Peclet a diverse portate di alimentazione
Portata (mllmin)
0.9
1.8
3.4
4.8
6.0
7.0
calcolare il rendimento delhi immobilizzazione chimica
ettenuta con alutaraldeide e 13SA descritta nella precedente sezione.
E’ (la notare che le particolari condizioni operative in cui si svolge
immobilizzazione chimica influenzano relativamente poco l’attivita’ dell’enzima
circa il 6O- di quello ottenuto con l’enzima libero, in batch.). Questo risultato e’
di particolare importanza poiche’conseiìte di realizzare ii processo con l’enzima
immobilizzato chimicamente, ottenendo interessanti risultati per quanto riguarda il
tempo di durata di un simile sistema.
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Peterson R S
hydr IvsIs nf
TeaLtu’. Rjm
dovrebbe consentire Ìi totale recupero della permeabilit& per un elevato
numero di cicli operativi.
Lo scopo di questo lavoro e di verificare la fattibilita’ del processo di
idrolisi enzimatica el lattosio con questo nuovo tipo di supporto e di porre le
basi per lo sviluppo in scala pilota di tale sistema.
Si & proceduto alla immobilizzazione fisica della 3-galattosidasi
utilizzando una procedura che consente la totale ritenzione dell’enzima.
Questo sistema & stato confrontato con un bioreattore sviluppato da
Pizzichini et al (1989) su fibre polisolfoniche con immobilizzazione fisica
del catalizzatore. Come si vedr& nelle successive sezioni del lavoro i
miglioramenti ottenuti utilizzando questo tipo di supporto incoraggiano la
ricerca nei campo della fabbricazione di nuove barriere con geometrie piu
adatte e della immobilizzazione enzirnatica covalente su tali supporti
obilizzazione eiiziniatica
6.L1 Procedura di caricamento dell’enzima
La barriera ceramica, costituita da uno strato microporoso su cui è
depositato lo strato esterno di ct-allumina, presenta un cut-off molecolare
(MWCO) che non permette l’immobilizzazione della 3-galattosidasi per
intrappolamento fisico (peso molecolare medio 90.000 Dalton),
Infatti un confronto dell’ assorbanza (290 nm) (Mc Bean et aL, 1978)
effettuato tra il flusso di permeato e la soluzione enzimatica di alimentazione.
ha mostrato la totale permeazione dell’ enzima,
Per realizzare 1’ immobilizza7ione fisica dell’enzima, è stata messa a
punto una tecnica di caricamento che permette la totale ritenzione del
catalizzatore sul supporto.
La carica enzimatica viene effettuata inviando I’enziirw dissolto in una
z diminuita ad
Esaurita questa fase, la portata del!’ alimentazione vien
rbimento della y
un valore di circa 5 mllmin per permettere un efficace adso
dura circa due ore.
allumina e dell’ enzima; l’intera procedura di caricamento
direttamente
I successivi caricamenti de1’ enzima possono essere
7-aliumina, previa
eseguiti sugli stessi moduli senza ulteriore aggiunta di
almeno sette ore.
combustione dei residui organici in muffoia a 750 C per
enzma
Tale tecnica ha permesso l’immobilizzazione dei 100% dell’
6J2 Controllo dell’ immobilizzazione
ad ogni
11 controllo dell’ mrnobilìzzazione viene effettuato
su frazioni di
caricamento, attraverso la verifica dell’ attività idrolitica
confronto con una
permeato, dopo due ore di ricircolo totale, mediante un
prima dcii’
uguale quantità di soluzione dell’ enzima prelevato
immobilizzazione.
lattasica nel
Tutte le prove hanno dimostrato 1’ assenza di attività
permeato dopo due ore di ricircolo totale.
enzimatica,
Dopo essersi assicurati della stabilita’ dell’immobilizzazione
ultrafiltrato.
si e’ alimentato il reattore con il siero di latte precedentemente
una elevata
Gia’ dall’analisi delle prime frazioni di permeato si e’ notata
dasi nella
attivita’ lattasica che indica evidentemente la presenza di -galattosi
corrente di permeato,
la [3Questo comportamento si puo’ spiegare assumendo che
fjsico,
galattosidasi si immobilizza sul supporto ceramico per adsorbimento
spostano
infatti le sieroproteine ancora presenti nel siero di latte ultrafiltrato
ad esse.
per azione di massa le molecole di enzima dal supporto sostituendosi
a
Da questa analisi risulta che la tecnica di immobilizzazione sopr
, Una
descritta non e’ adatta all’applicazione sul siero che si vuole effettuare
e’
via da seguire nello studio futuro delle tecniche di immobilizzazione
entire
quella che prevede l’attivazione del supporto ceramico per cons
Ottenuti
lIue,T’uluiunQ
a
zzazione
sui modulo poliselfonico Viii P30 ( Parte 11. immobili
i
huc’catalizzatorc) al supporto cetamico, in modo da unire
iiCil (ICIiU iiuunobilizzazione enzimatica
di
os aLente dcl
vantaiel
cnvaler,w
abihtìì
fu!$ Influenza_delr immobilizzazione suIlame
ico
Ia presenza dell enzima e della y allumina sul suppoato ceram
non
permeabiliPì, che comunque subisce una diminuzione
intluas’ono suìa
so tanziale,
j
(uyn/crn
i)
le+6
una bai nera
In fitui a veiono inosti ate O. pernieahil itìi a 0° ( di
ai lumina e dopo la i igene! azione.
ceramica nuova, dopo l’aggiunta d
a
‘ie 3
3e
t) i:
2e 4
(
-
0e0
2e0
Si puo notare la
l’aggiunta di allumina.
4ei
rigenerazione
non altera la povosita dei
1e÷
dopo
P (‘n;’m2)
supporto
6.2 TEMPO DI RES1D
1
ENz E \IODELLO [LI JIDODINÀMICO
4rk ro
Piuq fow
I
‘)4(
30C
11 confronto (a parità di portata) tra
le cui ve F dei casi ideali e dei
nostro sistema ci pci mette
di considerare (con buona aLprossilnazione)
i
(R.C L) come un reattore continuo ideale a
mescolarnento
figwa).
reattore ceramico
o
io
totale (vedi
LL
0,6
A
2 13 ml / rn o
O 4
0
I-
ti! CiO O
OJOUPOJ
(i
MiO!*I[).\L1UD Il)
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(1()iL1 lI D
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001
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—
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U dc; ± Y)
0tJ0tLiU{i(}iSLiOt1!i[)
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0[s1/LW3 [sI/Usi [si )[ 5]/I= 0/ix
1?!IO]Ulti
-
30
!
Op
(1-
9wuiì r71L’4r)isaI 4
4
o
x
=
200 rng
21416182022242628
Enzima
iO
Ore di lavoro
3(1
e1le ma mali eondzioni opei aiis e del i eattoie. il tiend della
produzione del glumaio nel tempo assiune il inofilo caratteristico dei
9S7 Scott.
hio’istemi inìnìublizZau su dl\ CISC manici <(usakov ci al.
1985>. Tue curva presenta un massimn nel le prime ore di t unziunamento, e
agiunae uno tat tazionai ru nelle ne suecesive. in figura 25 sono
iii )st1 ati i prodI della s eloc Ha di produzione del glucosio nel tempo per varie
tempeta uie opeiatIe a concentiazione di substrato costante (50 g/I)
ti
2
Per iidui re I teiinei la/unix all intei no del leatto2 si e impiegato un
battei ios atir o (sui Lato di potassio (4 [ cli ettO del la ci escita batterica si
mani testa iii Itl e oine ti no spui aine iì o d I su poi O con e oflseg tiente
aumento della seNisteil/a di ineinLuni
°
•
]
10’c
2(rC
30°C
40°C
E
16’
12’
lo
1’
30”C
Erìzrna
200 mg
1/O
min/ri
0.0 0,i 0,2 0,3 (34 0, 0,6 07 0, (3,9 1 0
Effetto della teneratura sulla resa
la cui soluzione e:
ALA() c’xp[ Kdtj
La resa idiolitica arimenta al cres
cere della temperatm a di reazione, che
e’ responsabile. d’altra parte. dell
a denattia azione dell’ enzima.
E’ espressione matematica che rap
presenta la velocitìi di disattivazione
per sistemi ad enzima immobi
lizzato è di solito un’ equazione differen
ziale
del primo ordine <Shan i ian
Yang cu al. i 89: Peterson et al.. 1 989>:
dA/dt= KjA
dove. A
1 è la costante K d Ilo step ti rcv
eHlbile dcli’ idrolisi tinin ),
mentie Kd e la i stante di dc i
a me n tlì iii e
26
24
22•
20
18
l6
14
-
i2
10
i
“
-*4»
.30
—
20
—
10
necessario
.
i
—
t
0
70
cig/min
80
‘.
90
C
Ore e ìavoro
100
quello di individuare la
di questa cantici iìiazionc
ad idrolizare il I 0(Yf del lattosio dell
i
a impiega 5,5
Dal grafico di figura, si è potuto verificare che 1’ enzim
della sua attività, mentre il tempo di
io1ni (a 53 C) per peidere la metà
dimezzainento a 30 (‘ è già di 7 1 gioi ni.
I effetto della
In base a quesle informazioni si è potuto trascurare
nti cinetiche.
lrsauivazione termica del!’ enzima nel calcolo delle costa
obiettivo
4jtmtitào
Un
uantità di enzima
Il i ne o lazio ne
() (. lattosio 56 cd
Mantenendo le condii ioni oper al ve coian(r (H
n Funione delia
di 1,6 rnUnin) si iraL(’ti(a trini cm va della resa
ma poitala
(i
20
io
(3
100
—
200
—
300
-—
—
---—
——
-—
-—
-
4-——
—
400
500
(00
i
900
—
800
—
700
000
V±Ez±zEz*Hz
J__
0
mg Enzima
1)a’ dati ci netic
i
e
dal
I
en
iia
li
e
W dimensionamento del
prevede una coi cr sio
reattoi e si
ne
del
0(Y
I
%
con
una quantità di enzima
me
pari a 500
Sperimentalm
en
te
pe
r
tale
qu
an
tità di enzimi si è ris
conversione pari al
contrata una
97
,4
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che
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tra che in queste condizi
ancoi a giunti al valor
oni non si è
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orto. E’ stato riscontrato
possibile immo
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enzima su! supporto di all
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64 ift)I)ELl() UlN
Eii(()
L
‘
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affrontata la cinetica in
hatch
a riportare i li forma grafca
64, i Cinetica in ha
tch della i3G. lattosida
si
sella parte i di qu
ro lt’ oi
della -calattosidasi, in
queNio e ntcs(o
i.
i risultati sp
erimenl ‘1 ottnu
0 13
002
(E)
0,02
-
0,01
0,00
0,00
0,lg/l
0,01
0,01
Y
0,02
40
0.02
1.
0,03 0,04
i /S
0.03
0,04
I/
•
L
1/V
1/VI-IO
valori dei le varie costanti,
1(1 ( in nresenìii di inibitore
0,0 1
Lineweaver-B urkpjLdiverseteniperaturc in aSscn7a
di inibitore
18
16
14
12
IO
8
O
4
L
o
2
0,03
i
ottcnono
iine’veaver— Rnuk nlot
Dai erahci delle t’uue s
unti nelle tabelle successive:
£11
(g/i)
0.00
5,00
10.0
0.00
14,15
14,54
Tahella
Costanti cinetiche in presenza di inibitore
Vmax
(m.M’
(mMlrni’i)
6.835
0,811
0.900
0,997
0,9%
0.997
Le valutaz ‘mi tern’od’namiche vengono effettuate utilizzando r ipotesi
attribuita ad Eyring: i reagenti fonnane un complesso attivato per poi
decadere nei prodotti. tale compleso atti atto è assunto in equilibrio con i
reagenti che lo formano, e quindi le costanti di equilibiio assumono la forma:
K2=kt (kTlh)K#
dove: kt è il coefficiente di trasmissione. T la temperatya assoluta. k
ed h sono rispettivamente le costanti cli Boltzmann e Plank e K è la costante
di formazione del complesso etiivato.
Normalmente nelle reazioni enzimatiche in isteiiii omogenei si
considera kt=l <Walter. I 965>. Se ora trattiamo K come una qualunque
costarne termodinamica, possiamo scrivere che.
K2=kt (kT/h)expL-AG/RT]
dove SE) è r energia libera molare standard di formazione del
complesso attivato. Dalle espressioni termodinamiche:
AG*-rSll*.-TAS*
4
L6t(—N’
‘
—
‘‘
—
j_
—
-
—
‘
ff
——1
—
—1
—
-
r
—
—
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-
OO I
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7
zzzz z
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(
-
flp
)j Ot O L
j
•1)
‘a
3.3
Itimnis
virv
3.4
3.6
3.5
t000/T iL)
mentw il cot.Uicientc. a ic’laie della steonda è
(All + RT)/R= 291o.i K (R
=0.998) con R=1S9 cal/(mol4K)
2
Ad a tempeiatura di 30 ( quindi
SS = 13 21 cdl/(n,cltK)
All 5,26 kcl/mol
li valore dell’ enewa libwra ir
jare di formazione del complesso
7
attivato risulta essere. AG All -1 iS = 0.6’ kcal/mol
Il valore del AG* molare di fonnazione del complesso attivato ricavato
dalla reazione condotta in batch statico. sen irà da confronto con quello
trovato per il reattore cciamico. allo scopo di stimare il tipo di influen7a
esercitata dalla temperatura sulla reazione e i’ eventuale disattivazione subita
dalr enzima in seguito all’ iminobilizza,ione
Il modello cinetico adottato per I’ idiolisi in continuo del lattosio è
simile a quello proposto per la trattazione in batcli. Si è fatta I’ ipotesi che I’
enzima ed il substrato si combinino ineisibilmente per formaie un
intennedio t. che gli umri piodotti dlh reaiionc. di idrolisi fosseio il
glucosio cd l ;a’attosio ?oiché i e uia un cro e proprio allontanameieto
dei prodotti. a niaggioi I4gione e lecito suppone cht solo una (razione
trascurabile dei piodotti ven» i riassocian pci i iformaie il substiato.
Per individuare la costante cinetica dello step irreversibile occorre fare
alcune considerazioni sull’ enzima immobilizzato nel reattore,
K2 viene ricavata dalla relazione VrnaxK2*(E) e quindi si hail
problema di esprimere la quantità di enzima (E) in mM,
Si può ragionevolmente supporre che le molecole di enzima dopo un
certo tempo di assestamento siano tutte (o quasi) adsorbite sul modulo
ceramico e, tenendo presente le dimensioni dei pori, si può anche
immaginare che queste abbiano una distribuzione pi o meno uniforme nell’
intero spessore del supporto.
Queste ipotesi permettono di individuare il volume di reazione ed
identificano con il volume del supporto poroso. quindi E) sarà espressa
come la quantità totale di proteine iinmobilizzate diviso il volume del
supporto, diviso un peso molecolare convenzionale (PM del glucosio).
I punti per realizzare il plot di Lineweaver-Burk sono stati ottenuti
misurando la concentrazione del glucosio prodotto a varie concentrazioni si
sub sti ato,
Anche le costanti ottenute lavorando in continuo devono ritenersi
apparenti, infatti, oltre alla semplificazione del modello cinetico, è stata
trascurata l’inibizione prodotta dal galattosio formatosi dal substrato iniziale,
La determinazione della costante di inibizione è stata realizzata
conducendo due serie si scansioni di concentrazione di substrato a 3OC
immettendo in ciascuna una quantità iniziale di galattosio pari a 5 e 10 g/I.
Nelle seguenti tabelle sono riassunti i risultati ottenuti:
(gli)
0,00
5.00
10,00
Ymax
(mM!rnin)
0,835
0. 115
0,222
Tabella
ii
(mM)
0.00
36,98
12,69
0,999
0,998
0,995
(R
=
2
O 997)
2
(
=
0,R
996)
Attiavero il
va
lor
e
de
lla
co
sta
nt
e dello step irreversib
seguenti), sono stati
ile (K2, figure
ca
lco
lat
i
i
va
lor
i
de
ll’ entalpia dell’ entro
energia libera di form
pia e dell’
azio
ne
de
l
co
m
pl
es
so
at
tivato a 30 ‘C’ (vedi tab
Nelle figure succ
ella).
es
siv
e
so
no
rip
or
ta
ti i grafici ottenuti me
termodinamici compa
ntre i dati
iono nella tabella:
7,33
kcal/mol
= 16 42 cal/(mol*K)
= 2.35
kcal/nìol
_
+
.4
H
polisolfonici
e ceramici
L’ meremento dil’ energia liberi: di foimazione del complesso attivato,
per la reazione con 1’ enzina supportato uil’ allurnina, risulta essere dell’
ordine di 1,6 Kcal/mol (a 30°C).
6.5 Confronto tra i supporti
Il confronto delle prestazioni del reattore ceramico con quello
polisolionico e’ operato sui risultati di un precedente lavoro (Pizzichini et ala
1989) che utilizza il modulo IIIP1O 20 della AMICON con l’enzima
ntrappola1o fisicamente, li confronto con Il modulo VFIIP3O non e’ stato
poiche in questo caso l’enzima e’ stato immobilizzato chimicamente
trattato
6.5,lPernìeabilità di membrana
=
6,85l0 2,00*107 F
=
0.996
Le fibre cave polisolfoniche mostrano una resistenza di membrana
fortemente di pendente dal la temperatura di esercizio. Nel reattore
polisoll’onico la resistenza di membrana è legata alla teinpematura assoluta
secondo 1’ equazione:
Rm
2 =0,997
R
Al contrario i moduli ceramici hairno mostrato una bassa sensibilità
della permeabilità alle variazioni di tempei’atura. come risulta dall’
equazione:
8 l.33*l0
Rrn=7,29*10
T
6
in tabella sono riassunti i valori delle resistenze di membrana dei due
supporti
elevati flussi di peinieazione.
6S2 Parametri diprcesso
I a fluidodinamk a dei due leattori funi onanti ambedue in
configurazione backflushing, e tisultata.in entrambi i casi. assimilabile ad ue
reattore continuo ideale a mesroiamento totale.
Il range di preioni di eerczio delle tibie case è molto limitato esse
possono resistere solo fino a l atmosfeie senza subite danni stutturali Al
Ontiario i supporti celamici possiedono mmc limite superiore la piessionc
rnassma tollerabile dalla sti uttura tCi ziaria dell’ enzima.
La temperatuia massima coiìentita dai uppntI polisolfonici 55 C
non sembra essere un pai ametro determinante è icui anente superiore alla
:
temperatura ottimale di lavoro dell’ enzima
5’ (‘i, he è quella
corrispondente alla massima resa con la minima denaturazione.
I moduli polisolfonici a fibre cave, grazie al loio alio sviluppo
superficiale. possono immobilizzaie irna giande quafltlta di enzima. I moduli
ceramici, a ielativamente basso sviluppo superficiale. 5000 stati al momento
sperimemati solo con modeste quantità di enzima (I 5 g).
In entrambi i reattoi i le tecniche di immobilizzazione adottate hanno
consentito sempre di immobilizzate il l00 dell enzima inviato. Tuttavia la
procedura di immobilizzazione è deteiminante, per le prestazioni del reattore,
n quanto il deposito enzlinatico deve esc.ere il più omogeneo possibile.
I dati termodinamici riguardanti il reatture a fibre cave mnostrao una
eneigia libera molare di foriiazione del complesso attivato (G =339
Kcal/mol a 30C) praticamente invaiiante, in tutto il range della temperatura
operativa permessa dall’enzima, a causa di un inodcsto contributo eiìtropico.
Al contrario, a reazione catalitica, SvOitJ con l enzima immobilizzato
supporto cerarnic, motIa una enerta !the a ‘n!ae i G=2.3s kcalhm)i
sui
tai.
Le prestazioni del bioreattore cera
mico ad attività lattasica vanno
ana
lizz
ate
in
un
con
test
o
gen
eral
e
di valorizzazore di un prodotto di rifiuto
come i siero, che costituisce una
categoria rappresentaliva di sottoprodo
tti
dell’ industria agroalimentare
Le informazioni ottenute
in utiesto lavoro (caratterizz
azio
ne
fluidodinarnica dei reattore cera
mico e valutazione della dipendenza
della
reazione di idrolisi con enzima
immobilizzato dalla temperatura e dall
a
natura del supporto), hanno per
messo ti aaggillngirnento di alcuni obietti
vi
utili
al
pas
sag
gio
di
sca
la
dei
sistema In forma schematica, la
sperimentazione condotta ha infatti
permesso.
La caratterizzazione fluidodinam
ica del ieattore;
La caratterizzazione cinetica della
ieazione condotta in continuo.
Rispetto al reattore polisolfonico
a fibre cave il ieattoie ceramico
presenta i seguenti vantaggi e sva
ntaggi:
-
-
Rigenerabilità completa dei mo
duli;
Rimozione totale dei depositi org
anici, mediante combustione;
Indeformabilità dei moduli alle alte
pressioni:
Possibilità di impiego in condizioni
di lavoro piu spinte;
-Riduzione della permeabilità men
o drastica in seguito alla
immobilizzazione;
Più definita geometria dea sistema
(sopratutto ad alti flussi’);
Migliore distribuzione dell enzima
sul supporto,
Maggiore influenza della temper
atura sulla resa;
Più elevato costo d’impianto. nia
più rapido ammoitamento;
parw mezod
d’immobilizzazione enziinatica idonei al tipo di supporto inorganico
(silanizzazione)
6.7.B IBLIOGRAFIA
Cappelli, Dente
Teoria e sviluppo dei processi climici Clup, Milano
Cesari,
La regolazione automartea degli impianti indusriaL,
Ed Franco Ar geli, Napoli
AN. Gusakov, A.P. Sinìsryin et AL.
Biotechnol, Bioeng. 29.Pp. 8989OO. I 987
O. Levenspiel,
Ingegeria delle reazioni chimiche Ed, Ainorosiana, 1978
R.D. Macbean, N.S. Willman.
1978
mt, Dairy (ìongress, p. 947,
W, Marconi F. Baroli, D. Zaccaidelli,
lmmobilized Enzyrnes, Ed. M. Salinona et Al.. Raven Press,
Pp. 211-216,1974
M.Nakajima. N.Jimbo, FlNabetani, k Watanabe
se of ceranuc membrane for enz’me reactors
T
L
it International Conference on inorganic membranes. Juiy 3-6. 1989
Montpellier. France
di analisi e controllo in linea delle rese idrolitiche e’ risul
tato di enorme
importanza.
In questo capitolo si descrive in dettaglio il tunzionainen
to di un
sistema di biosensori in grado di controllare il proc
esso, sviluppato
interamente in ambito ENEA.
Il sistema in oggetto utilizza sensori a membran mod
a
ificati con
enzimi, Si e’ percio’ sviluppato un sistema chiamato dagl
i esperti nel
settore con il nome di biosensore. supersensore, o supe
rprobe. Il sistema si
basa su sensori di tipo elettrochimico, quelli che a
ttitt’oggi sono
considerati i pin’ adatti secondo i criteri di economic
ita, riproducibilita’
precisione ed accuratezza.
7.1 11 sistema biosensore
Un biosensore elettrochimico puo’ essere defin
ito come
l’accoppiamento di un sistema biologicamente attivo imm
obilizzato, con
un trasduttore di segnale che converte il segnale
biochimico in uno
elettrico analiticamente quantificabile (Frew. 1989).
Questi biosensori sono generalmente elettrodi a membran acco
a
ppiati
con mediatori biochimici quali enzimi immobilizzati
e recentemente anche
anticorpi, batteri e tessuti viventi altamente spec
ializzati; la selettivita’
degli elettrodi e la specificita’ dei mediatori conv
ertono spesso una
determinazione chimica altrimenti problematica nella semp
lice operazione
di una misura elettrica. I bjosensorj hanno avuto recen
temente notevole
importanza sia nei campo biornedico che in quel
lo. biotecnologìco
(Palleschi, 1989), Nella tabella sono elencati una serie
di substrati di
interesse biologico, chimico e farmaceutico che negl
i anni hanno costituito
oggetto di ricerca per la realizz izionc d ‘biosenso
ri specifici” (Mascini,
Colesterolo
Lattato
Alcool
Penicillina
Ossalato
Glutamina
Cisteina
Colesterolo Ox
Lattato Ox
Alcool-DH
Penicillasi
Ossalato o
Mitocondri
del tess,renale
Cellule
batteriche
gas
gas
Clark
Clark
catodo
O
NDH
11
CO
2
NH
gas
vetro
S
2
H
7,2 Biosensori a glucosio e 1attoi!
+
02
GOD
---->
0
2
Acido Gluconico ÷ H
I biosensori a glucosio e lattosio, sviluppati per il controllo in linea
del bioreattore lattasico, si basano su elettrodi amperornetrici specifici per
l’acqua ossigenata accoppiati con l’adatto enzima o coppia di enzimi per i
substrato in esame. La specie rivelata dal sensore elettrochimico e’ l’acqua
ossigenata prodotta dalla reazione enzimatica qui di seguito riportata:
j3-DGlucosio
L’enzima glucosio ossidasi (GOD) e una ossidasi flavinica
(Lehninger, 1979) che possiede come gruppo prostetico il Flavin adenin
dinucleotide (FAD) che determina il colore giallo di tutti preparati
enzimatici a base di ossidasi,
Mentre il glucosio viene ossidato ad acido gluconico il FAD viene
inizialmente ridotto a FADH, e successivamente riossidaro daHossigeno
dscaoito in soluzione con formazione di acqua oi.si.genata:
Ltorio
GOD
gaI attosidasi
ltD Glucosio 4
Glucosio ± Galattosio
Acido Gluconico + H,0
2
7 &Sistern i elettrochimico di misura
—
O rinq
-
—
—
__jsilantn in quarzi
jI’ttrilita
Rzferurcutn Aq/PqCI
—---40
ari,riitri
—
-
nunlucrc in ccnain
Lì schema d un sensore amperomen-ico e’ npoi tato in figura.
teqzl(:li
L anodo d platino e posto e PeO mv Vs un rilerimento di Ag/Ag( I.
La coppia elr tirodica immersa in una soluzione elettrolitica di KC1
0 1 M
Tira o 1 a
‘a nr otti( fl il 3 cia 30 aia) da diali’i
In Lt
alA
i ta’ d
noc d
n O
o o pr flfl
cIr!;e 1 io
r%pO5l3
m
r .ponranil’
Via
L
7A Interferenze chimiche
Uimpiego di un elettrodo ad acqua ossigenata pua’ comportare degli
inconvenienti dovuti alla presenza di specie interferenti Questo problema
si presenta ogni qual volta ci troviamo di fronte ad una matrice reale
complessa.
Si usa allora una membrana di acetato di cellulosa impermeabile alle
sostanze interferenti elettroattive con un probabile meccanismo di
esclusione molecolare.
Questo meccanismo non e’ il solo operante: sembra anzi che la
seiettivita’ di tali membrane sia dovuta afi una interazione fra le cariche
negative presenti sulla membrana e le cariche che la sostanza interferente
possiede in certe condizioni di pII e forza ionica. Nella pratica pero’ si e’
visto che la sodio azide, utilizzata come batteriostatico nel feed che
alimentava i! bioreattore, creava dei problemi di interfeienza. Le misure
dei campioni effettuate al biosensore risultavano di un 5% piu’ basse
quando era presente la sodio azide. il problema e’ stato risolto utilizzando
uno standard contenente la stessa concenti azione di sodio azide
(0. l%w/v),
Un altro problema di misura puo’ derivare dal siero di latte, anche
ukrafiltrato, per la presenza di proteine a basso peso molecolare.
Queste possono causare dei problemi di intasamento della membrana
enzimatica rallentando la diffusione delle specie chimiche e diminuendone
la durata nel tempo che rimane comunque. di circa 30 giorni. lutto cio
comporta frequenti calibraziorn dei sensori (in pratica ogni 2 ore di
funzionamento).
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7,5_Procedimento di immobilizzazione enzimatica
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acetato di cellulosa, selettiva all’acqua ossigenata. e’ posta sulla
superficie elettrodica, mentre quella di policarbonato e’ a contatto con il
campione. Quest’ultima protegge l’enzima dall’attacco batterico che
comprometterebbe la durata del sensore in modo rilevante. Il sensore
cosi’ottenuto e’ inserito in una cella a flusso con un volume di circa 40 ul.
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Il procedimento appena descritto e’ comune ai due biosensori; per
quello a lattosio si deve procedere all’immobilizzazione dei due enzimi
(glucosio-ossidasi e 3-gaIattosidasi).
Alcune prove sperimentali hanno stabilito che in questo caso
conviene immobilizzare separatamente gli enzimi su due membrane
(immobilizzazione asimmetrica) anziche’ procedere all’immobilizzazione
contemporanea dei due enzimi
su
una singola membrana
(immobilizzazione randorn),
In pratica il procedimento viene condotto separatamente per la GOD.
sulla membrana di acetato di cellulosa, e per la f3-galattosidasi su quella di
policarbonato.
Le membrane s no infine sLrnblate sull’elettrodo cdme e
ematizzato iri figura
sl
mmoIUL.
Il limite superiore di questi metodi e’ fonte di problemi quando si
effettuano misure in linea, sulle matrici reali, ad elevate concentrazioni
degli analiti da determinare. Per rientrare nel range di linearita della
misura, si e’ impiegata una tecnica di FIow lnjection Analysis (FIA), che
permette la diluizione riproducibile del campione da analizzare.
Il sensore e’ alimentato in continuo con tampone fosfato (PII 7.0,
0.1M) ad una portata costante di 4m1/min.
Il prelievo del campione e’ effettuato con una
microsonda
(id=0.2mm, od=0.5mm) ed una pompa peristaltica. con portata variabile
(0.34,0 mi/min), che invia il campione in una valvola con un loop di
lOpi. La restante parte del campione e’ reimmessa nel flusso del processo.
Ogni 90 secondi un impulso elettrico determina l’immissione del
campione nel tampone veicolante (fosfato 0.lM pII 7.0). Quindi il
campione. attraverso un tubo a spirale con caratteristiche geometriche
definite (lunghezza Im, id=0.2rnm, od=0.5mm). diffonde nei mezzo
veicolante consentendo, in modo riproducibile. la necessaria diluizione
prim
raggiurgere il sens ie(fwura ag ni senuentc)
i (nA)
[O
o] ‘M)
100
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200
Nelle seguenti figure sono riportate la curva di cilibrazione per il
glucosio con il 4sterna FIA e l’output del registratore per differenti
soluzioni standard.
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50
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Nella seguente figura e riportato l’output su registmore con la scala
dei tempi espansa. del segnale dovuto ad una soluzione standafd di
glucosio.
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lJandamento codato dei picco puo eseie ‘;piegatn considerando i
profili di concentrazione del glucosic alFinerfac’ia soluzione/membrana e
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Con la tecnica FIA e’ possibile effettuare misure nel range 0.1-150
il
mM e contemporanamente ridurre ad un valore trascurabile (400 jillora)
volume di campione per le analisi in linea.
Questa tecnica inoltre consente di minimizzare qualunque effetto
della matrice siero sulla misura (intasamento della membrana,
denaturazione enzimatica, variazioni del pii e della temperatura, variazioni
di composizione.ecc.).
Poiche’ dopo ogni misura la corrente torna al valore di zero del
i
tampone veicolante e la risposta e’ lineare nel range di concentrazion
realizzate nel processo, si puo’ ricorrere ad un sistema di calibrazione ad
L*accuratezza
un punto, con ovvie semplifi-cazioni del sistema analitico.
della misura e’ stata stimata in ±1%. La risposta del sensore e’ stata
controllata su frazioni raccolte, con il Beckman Glucose Analyzer lI.
-
Pcr il momeoraggio del glucosio e’ stato messo a punto un sistema di
tigenerazione del tampone veicolante, che ne consente Vuso in condizioni
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I biosensori a lattosio e glucòsio descritti, sono stati sviluppati per un
sistema automatico di controllo in linea del lattosio all’entrata e del
glucosio all’uscita del bioreattore lattasico a membrana.
La tecnica di Flow Injection Analysis (FIA) e la rigenerazione del
tampone, descritti sopra, hanno permesso l’automazione del biosensore.
Infatti oltre a permettere l’analisi di campioni in un range di 0.1 1 5OmM, si
e’ anche ridotto ad un valore trascurabile, circa 400ul/ora il volume di
campione sottratto per il controllo in linea
Si possono effettuare misure ogni 90 secondi (30 secondi per ottenere
il 100% della risposta, 40-50 secondi per il ritorno al valore zero).
Una valvola deviatrice ed un tirner consentono la completa
automazione del sistema con cicli di misura di cinque ore, intervallati da
trenta minuti di calibrazione.
Nella figura di pagina seguente e riportato un tracciato
esemplificativo relativo al monitoraggio in continuo del bioreattore
lattasico,
Lo sviluppo di un apposito programma in linguaggio basic
Applesoft consente l’acquisizione, la memorizzazione e l’elaborazione dei
dati di concentrazione in monosacaccaride, produttivita’ e resa percentuale.
Il programma (listato e flow sheet nelle figure successive), sviluppato
su un minicomputer Apple\\c interfacciato con potenziometro Orion con
uscita seriale RS-232c, consente, l’automazione completa del processo
nella fase pilota permettendo la modifica dei parametri di processo
(temperatura, portata, loading enzimatico) per realizzare un prodotto
definito e costante nel tempo.
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79 CONCLUSIONI
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prepara per un successivo
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Lo studio di un biosensore a glucosio per il controllo on line
dell’idrolisi enzimatica del lattosio ha consentito lo sviluppo di un sistema
completo, efficiente ed automatico che bene si presta al monitoraggio del
processo descritto nei capitoli precedenti. sia nella fase di acquisizione dati
e di studio si nella fase di scale up del processo ad impianto pilota.
Sono state verificate le caratteristiche del biosensore a glucosio
riguardo alla specificita’, alla prontezza, alla precisione ed accuratezza
delle misure con un sistema di riferimento (Glucose Analyzer lI.
Beckman) ottenendo ottimi risultati. Il tempo di vita dell’enzima glucosio
ossidasj immobilizzato sull’elettrodo e’ dell’ordine di 56 mesi mentre, con
il sistema di rigenerazione delle soluzioni tampone. il sistema e’ in grado
di procedere automaticamente per circa un mese consentendo la misura di
circa 30.000 campioni.
La partricolare tecnica HA che consente la diluizione del campione.
riduce sensibilmente i prob’erni di fouiing d membiana da parte di
OinpOneflti macromoiecoiaii preent iel ainpione
La rapida procuura w tiratura au n UUuIo rIenW di \
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