I RECETTORI:
Caratterizzazione e isolamento
Andrea Ferrigno
Funzione dei recettori di membrana
Secrezione
dell’ormone
nel sangue
L’ormone è trasportato
attraverso il circolo
sanguigno
L’ormone raggiunge
le cellule target
Funzione dei recettori di membrana
activated/
inhibited
Caratteristiche dei recettori
• Interazione debole (reversibilità)
• Alta affinità
• Specificità del legame
• Specificità dell’effetto
Approcci allo studio dei recettori
Clonazione
Studio del legame
con il ligando
(curve dose-effetto)
Individuazione
(studi di binding)
Studio del
meccanismo
d’azione
Determinazione della
struttura
tridimensionale
Purificazione
Sviluppo di nuovi
farmaci
Sequenziamento
Studio del legame recettore-ligando
Obiettivi:
• Studio dell’attività intrinseca
• Determinazione EC50 (potenza)
• Determinazione Kd (efficacia)
Tecniche per lo studio del legame
recettore-ligando
CAMPIONI:
TECNICHE:
• Sezioni di tessuto
• Cellule isolate
• Colture cellulari
• Membrane isolate
• Recettori isolati
• Dialisi all’equilibrio
• Scintillazione
• Spettroscopia in fluorescenza
• Citometria a flusso
• Microarray di proteine
Tecniche in fluorescenza
• Spettroscopia in fluorescenza
• Citometria a flusso
• Microarray di proteine
Ligando
Marcatore
fluorescente
La fluorescenza
vira da verde a
rosso
Recettore
Recettore
marcato
Complesso
ligando/recettore
Distribuzione e localizzazione
dei recettori
Studi sulla schizofrenia:
autoradiografia di encefalo
umano marcato con [3H]MDL:
distribuzione e localizzazione
dei recettori 5HT2A.
Isolamento e purificazione di recettori
• Isolamento dell’organo
• Omogenazione
• Trattamento con detergenti
L’organo elettrico della torpedine è
ricco di recettori dell’acetilcolina
Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina, antagonista del
recettore dell’acetilcolina
Tecniche di purificazione:
la cromatografia di affinità
miscela di proteine
contentente il recettore
ligando covalentemente
legato a sfere di
polistirene
recettore
purificato
Sequenziamento dei
recettori proteici
La degradazione di Edman
in quattro passi:
1) PITC si lega
all’estremità N-terminale
2) Liberazione del derivato
PITC/aminoacido (PTH)
3) Identificazione del
PTH mediante HPLC
4) Si ripete dal punto 1) fino
all’idrolisi della proteina intera
Sequenziatore automatizzato
Determinazione della
struttura tridimensionale
Dalla densità elettronica al
modello atomico
Sequenza aminoacidica +
dati di diffrazione
Modello atomico
del recettore
Recettori ricombinanti:
il perché
Le tecniche classiche di isolamento
dei recettori sono vincolate
all’esistenza di casi eccezionali.
L’organo elettrico della torpedine è
ricco di recettori dell’acetilcolina
Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina, antagonista del
recettore dell’acetilcolina
Recettori ricombinanti:
il come
1) Estrazione di tutti gli mRNA da cellule che
esprimono anche il recettore di interesse
2) Gli mRNA sono enzimaticamente convertiti in cDNA
e inseriti in plasmidi di espressione
3) I plasmidi di espressione sono trasfettati in
cellule batteriche
4) Le cellule che contengono il DNA esprimono il
recettore e lo espongono sulla membrana
5) Le cellule che esprimono il recettore sono distinte
dalle altre grazie a un ligando selettivo, marcato con
sostanze radioattive o fluorescenti
Recettori ricombinanti:
riepilogo
Plasmide contenente
il cDNA del recettore
di interesse
Plasmide contenente
il cDNA di una
proteina irrilevante
Le cellule contenenti
il cDNA di interesse
esprimono il recettore
Le cellule che non
contengono il cDNA
di interesse non
esprimono il recettore
e non sono
ricunosciute dal
ligando marcato
Il ligando marcato
riconosce il recettore
Le cellule di interesse
sono rivelate
mediante radioattività
o flurescenza
Approcci allo studio dei recettori
Clonazione
Studio del legame
con il ligando
(curve dose-effetto)
Individuazione
(studi di binding)
Studio del
meccanismo
d’azione
Determinazione della
struttura
tridimensionale
Purificazione
Sviluppo di nuovi
farmaci
Sequenziamento
