I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento
annuncio pubblicitario
I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento Andrea Ferrigno Funzione dei recettori di membrana Secrezione dell’ormone nel sangue L’ormone è trasportato attraverso il circolo sanguigno L’ormone raggiunge le cellule target Funzione dei recettori di membrana activated/ inhibited Caratteristiche dei recettori • Interazione debole (reversibilità) • Alta affinità • Specificità del legame • Specificità dell’effetto Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Individuazione (studi di binding) Studio del meccanismo d’azione Determinazione della struttura tridimensionale Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Sequenziamento Studio del legame recettore-ligando Obiettivi: • Studio dell’attività intrinseca • Determinazione EC50 (potenza) • Determinazione Kd (efficacia) Tecniche per lo studio del legame recettore-ligando CAMPIONI: TECNICHE: • Sezioni di tessuto • Cellule isolate • Colture cellulari • Membrane isolate • Recettori isolati • Dialisi all’equilibrio • Scintillazione • Spettroscopia in fluorescenza • Citometria a flusso • Microarray di proteine Tecniche in fluorescenza • Spettroscopia in fluorescenza • Citometria a flusso • Microarray di proteine Ligando Marcatore fluorescente La fluorescenza vira da verde a rosso Recettore Recettore marcato Complesso ligando/recettore Distribuzione e localizzazione dei recettori Studi sulla schizofrenia: autoradiografia di encefalo umano marcato con [3H]MDL: distribuzione e localizzazione dei recettori 5HT2A. Isolamento e purificazione di recettori • Isolamento dell’organo • Omogenazione • Trattamento con detergenti L’organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell’acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina, antagonista del recettore dell’acetilcolina Tecniche di purificazione: la cromatografia di affinità miscela di proteine contentente il recettore ligando covalentemente legato a sfere di polistirene recettore purificato Sequenziamento dei recettori proteici La degradazione di Edman in quattro passi: 1) PITC si lega all’estremità N-terminale 2) Liberazione del derivato PITC/aminoacido (PTH) 3) Identificazione del PTH mediante HPLC 4) Si ripete dal punto 1) fino all’idrolisi della proteina intera Sequenziatore automatizzato Determinazione della struttura tridimensionale Dalla densità elettronica al modello atomico Sequenza aminoacidica + dati di diffrazione Modello atomico del recettore Recettori ricombinanti: il perché Le tecniche classiche di isolamento dei recettori sono vincolate all’esistenza di casi eccezionali. L’organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell’acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina, antagonista del recettore dell’acetilcolina Recettori ricombinanti: il come 1) Estrazione di tutti gli mRNA da cellule che esprimono anche il recettore di interesse 2) Gli mRNA sono enzimaticamente convertiti in cDNA e inseriti in plasmidi di espressione 3) I plasmidi di espressione sono trasfettati in cellule batteriche 4) Le cellule che contengono il DNA esprimono il recettore e lo espongono sulla membrana 5) Le cellule che esprimono il recettore sono distinte dalle altre grazie a un ligando selettivo, marcato con sostanze radioattive o fluorescenti Recettori ricombinanti: riepilogo Plasmide contenente il cDNA del recettore di interesse Plasmide contenente il cDNA di una proteina irrilevante Le cellule contenenti il cDNA di interesse esprimono il recettore Le cellule che non contengono il cDNA di interesse non esprimono il recettore e non sono ricunosciute dal ligando marcato Il ligando marcato riconosce il recettore Le cellule di interesse sono rivelate mediante radioattività o flurescenza Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Individuazione (studi di binding) Studio del meccanismo d’azione Determinazione della struttura tridimensionale Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Sequenziamento
