SPETTROSCOPIA NMR
DI PROTEINE
Struttura tridimensionale della proteina G
con il metodo degli accoppiamenti dipolari
Candidato:
Francesco Stellato
Relatore:
Prof. S. Morante (Dip.Fisica, Tor Vergata)
Correlatore:
Prof. M. Blackledge (IBS, Grenoble)
1
SOMMARIO
•
•
•
•
•
•
Basi teoriche fisiche
Apparato sperimentale
Basi “teoriche” biologiche
Preparazione del campione
Simulazione
Conclusioni
2
Basi teoriche fisiche
Già nel 1946 Bloch1 e Purcell2, indipendentemente l’uno
dall’altro, intuirono le potenzialità della Risonanza Magnetica
Nucleare (NMR). L’NMR si basa sull’interazione tra il
momento magnetico nucleare ed un campo magnetico esterno e
può, quindi, essere utilizzato solo se J≠0.
A
Pari
Pari
Z
Pari
Dispari
J
0
Intero
Dispari
Pari/Dispari
Semi-intero
A = numero di massa, Z = numero atomico
1Bloch,
Hansen, Packard. (1946), Phys.Rev. 69, p. 127 3
Torrey, Pound. (1946), Phys. Rev. 69, pp. 37-38
2Purcell,
J2 =│J2│= J·J = ħ2[J(J+1)]
µ = γJ momento magnetico associato, γ = rapporto giromagnetico
La degenerazione è rimossa in presenza di un campo magnetico
esterno, B
Jz= ħm, m = (-J, -J+1,…, J-1, J)
Em = -µ·B = -γJ·B
prendendo B // z ⇒ B → B0
Em = - γJzB0 = -mħγB0
2J+1 livelli equispaziati (livelli Zeeman)
4
All’equilibrio: stati popolati secondo la statistica di Boltzmann
Nm
=
N
exp(− Em/kBT)
J
∑ exp(−E /k T)
m
B
1 + mhγB0/kBT
≈
2J + 1
m=− J
T∼300 K ⇒ mħγB0/kT << 1
Per un campione macroscopico ⇒ M=M0 ẑ
Nγ 2 h 2 B0J(J + 1)
M0 = γh ∑ mNm ≈
3kBT
m=− J
J
ħ= 1.05 x 10-34 J·s; γ= 108 (T·s)-1; B= 10T; kB= 1.38 x 10-23 J·K-1
5
EQUAZIONI DI BLOCH
dJ(t)/dt=M(t) x B(t);
Poichè,
M=γJ
⇒
dM(t)/dt=M(t) x γB(t)
Sistema di riferimento rotante intorno ad un asse fisso con velocità
angolare costante, ω
(dM(t)/dt)rot=(dM(t)/dt)lab+M(t) x ω= M(t)x(γB(t)+ω)
Ponendo,
Beff=B(t)+ω/γ
Si ottiene,
(dM(t)/dt)rot=M(t) x γBeff(t)
M(t) precede intorno a B(t) con frequenza ω = γB;
se B=(0,0,B0) ⇒ ω = ω0= γB0:
M(t): campo magnetico variabile nel tempo ⇒ f =-dΦ/dt.
f = segnale NMR
6
All’equilibrio:
M//B ⇒ Non c’è segnale
impulso rf ⇒
M(t) precede intorno a B0
⇒ c’è segnale
7
A causa di fenomeni dissipativi (rilassamento) ⇒ decadimento
di: magnetizzazione trasversa (Mx e My) e longitudinale (Mz)
Bloch ha proposto semplici espressioni per descrivere il
fenomeno del rilassamento:
dMx(t)/dt=-Mx(t)/T2 → Mx(t)=Mx(0)exp(-t/T2)
dMy(t)/dt=-My(t)/T2 → My(t)=My(0)exp(-t/T2),
dMz(t)/dt=[M0-Mz(t)]/T1 → Mz(t)=M0-[M0-Mz(0)]exp(-t/T1)
T1 e T2 : costanti di tempo longitudinale e trasversale
8
Apparato sperimentale
1.
Magnete: solenoide superconduttore; B > 10 T
2.
Sonda
(coassiale
al
magnete): invia l’impulso rf e
riceve il segnale
3.
Programmatore di impulsi e
trasmettitore:
generano
l’impulso perturbante
4.
Rivelatore:
preamplificazione
conversione digitale
5.
e
Computer: acquisizione dati
e FT ⇒ spettro NMR
9
Schema generale di un esperimento NMR
1. Il campione è posto in un campo magnetico B
2. L’invio di un impulso elettromagnetico perturba l’equilibrio
3. La precessione della magnetizzazione genera un segnale
elettrico noto come FID (Free Induction Decay)
4. Il FID è registrato, e quindi trasformato di Fourier, nel
dominio della frequenza: FID(t) → ν (ω)
10
Basi “teoriche” biologiche
Le proteine sono polimeri lineari
di aminoacidi (aa) e svolgono la
maggior parte delle funzioni
necessarie alla vita (trasporto,
catalisi, difesa immunitaria, etc…).
I 20 diversi aa naturali differiscono
per le caratteristiche fisicochimiche della catena laterale R.
Gli aa sono legati tramite il legame
peptidico, che ha luogo tra il
gruppo carbossilico di un aa ed il
gruppo amminico del successivo,
con la formazione di una molecola
d’acqua.
11
E’ utile definire 2 angoli torsionali:
•φ: rotazione intorno a Cα-N
•ψ: rotazione intorno a Cα -C’
In una proteina sono individuabili 4 livelli strutturali:
1. Struttura primaria = sequenza lineare di aminoacidi
2. Struttura secondaria = struttura locale della catena (α-elica, βsheet, …)
3. Struttura terziaria = struttura 3D globale
4. Struttura quaternaria = disposizione spaziale di subunità diverse
12
Preparazione del campione
1. Selezione del gene che codifica la proteina
2. Inserimento del gene in un plasmide e trasferimento in
batterio (E. coli)
3. Scelta del mezzo di crescita*: crescita a 37 °C
4. Lisi e purificazione della proteina
Caratteristiche necessarie:
1. Campione puro (almeno) al 95 %
2. Proteina stabile per tutta la durata
dell’esperimento
3. La proteina non deve formare
aggregati alla concentrazione
necessaria per l’esperimento
(generalmente, circa 1 mM) 13
•
15NH
4Cl
(cloruro di ammonio) come unica fonte di N, per avere
proteine marcate con 15N
•
13C
6H12O6
(glucosio) come unica fonte di C, per avere proteine
marcate con 13C
•
2H
+
2O
(acqua pesante) per avere proteine marcate all’80% con 2H
C62H12O6 (glucosio) per avere il 100% di 2H
14
Simulazione
Dati sperimentali
RDC3
MODULE4
MECCANO5
Dati cristallografici1
File PDB2
InsightII*
RMS
*©Accelrys
Inc.
Σ[( (x1-x2)2 + (y1-y2)2 + (z1-z2)2]½ / N
15
La proteina G
proteina della parete batterica con vari siti di legame per l’anticorpo
Sito GB3
α-elica
β-sheet1
β-sheet2
β-sheet3
β-sheet4
↑
16
HEADER IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN
05-AUG-94 XXXX
TITLE THE THIRD IGG-BINDING DOMAIN FROM STREPTOCOCCAL PROTEIN G:
TITLE 2 AN ANALYSIS BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHY OF THE STRUCTURE
TITLE 3 ALONE AND IN A COMPLEX WITH FAB
COMPND PROTEIN G
KEYWDS IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN
EXPDTA X-RAY DIFFRACTION
AUTHOR J.P.DERRICK, D.B.WIGLEY
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
↑
1 N
2 CA
3 C
4 O
5 CB
6 CG
7 SD
8 CE
9 N
10 CA
11 C
12 O
MET A
MET A
MET A
MET A
MET A
MET A
MET A
MET A
THR A
THR A
THR A
THR A
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
1.482
1.504
1.417
1.828
2.786
4.008
5.553
5.224
0.914
0.874
2.218
2.738
2.881
3.440
4.966
5.536
3.039
3.686
3.396
4.534
5.587
7.070
7.455
6.701
4.315
5.674
5.566
4.548
6.438
5.823
6.808
8.175
6.600
6.635
7.275
8.119
1.00 10.85
1.00 9.28
1.00 7.23
1.00 10.61
1.00 13.17
1.00 23.31
1.00 28.10
1.00 29.75
1.00 9.74
1.00 12.11
1.00 10.05
1.00 11.94
N
C
C
O
C
C
S
C
N
C
C
O
17
•RDC: Accoppiamento dipolare per un sistema di 2 nuclei, A e B
2
H = D AB
J
A
zJBz(3cos θ − 1)
max
< >: media temporale o sull’ensemble
(⇒ solvente anisotropo)
θ: angolo AB, B;
DAB=-µ0(h/2π)γAγB/(4π2r3)
DAB può essere data in funzione di θ e di una matrice diagonale, A,
(tensore di allineamento). Gli elementi Aii corrispondono alla probabilità
di trovare l’i-esimo asse parallelo a B0.
18
↑
Sono stati misurati (Ulmer 3)
•
6 campioni (A-F) di proteina G da E.coli HMS174 in mezzo
minimo di crescita: 13C6H12O6 e 15NH4Cl e con diversi
solventi
•
4 valori di RDC per residuo: Cα-C’, Cα-Hα, N-H, C’-N
RDC calcolati
RDC sperimentali
MODULE4
↑
A
3
T.S. Ulmer, B.E.Ramirez, F.Delaglio, A.Bax. (2003),
JACS 125: pp. 9179-9191
4 MODULE
By P.Dosset, J.C.Hus, M.Blackledge. IBS, Grenoble
19
RDC
in 2 mezzi
φeψ
(se disponibili)
Aii
nei 2mezzi
MECCANO
Procedura
“step-by-step”:
2
χ
PDB
dal
1°
peptide
determinando
l’orientazione relativa di quelli seguenti per cui
2
2
2
exp
calc
−
ϕ
−
ϕ
−
exp
calc
exp
calc
(
)
(ψ
ψ
)
(D
D
)
+(109− ϑ)2 k +
+
χ2 = ∑
σ
σ
σij
ij
↑ è minima.
20
MECCANO
By M.Blackledge. IBS, Grenoble
5
La simulazione è stata eseguita utilizzando i seguenti campioni:
peg: polietilen glicolo;
npg: gel di poliacrilamide carico negativamente
ppg: gel di poliacrilamide carico positivamente
In particolare: da 1 a 5 è stata usata la coppia npg-ppg (Anpg · Appg = -0.132), per 6
e 7 la coppia npg-peg (Anpg · Apeg = 0.224)
Residui
RMS1(Å)
RMS2(Å) RMS3(Å) RMS4(Å) RMS5(Å) RMS6(Å) RMS7(Å)
8-60
12.863
11.003
9.540
2.775
5.530
8-41
10.838
2.614
2.681
2.311
2.699
22-41
5.122
29-41
2.963
5.635
2.563
0.680
0.334
0.651
RMS1 : α-elica; RMS2 : intera struttura; RMS3 : vincolo su φ e ψ (σ=10°); RMS4 :
vincolo su φ e ψ (σ=0.001°); RMS5 : come RMS3 tranne tra 41-44 dove come
RMS4; RMS6 : come RMS1 ; RMS7 : come RMS4
21
Conclusioni
L’NMR è una tecnica molto potente per lo studio della struttura
delle molecole in soluzione. La ricerca di strategie sempre più
efficienti per estrarre informazione dagli spettri è di importanza
fondamentale. L’uso degli RDC come unico mezzo per
determinare la struttura 3D va proprio in questa direzione, e il
lavoro di simulazione qui presentato ne ha dimostrato le
potenzialità nel caso specifico di una proteina strutturalmente
rappresentativa.
22
Interpretazione dei risultati delle simulazioni
RMS1: il risultato è buono solo nella parte di elica, che è la parte
usata per trovare il tensore di allineamento.
RMS2: il risultato è buono anche tra 8 e 41, mentre nella parte
finale persistono problemi.
RMS3: il risultato è migliore di quello ottenuto senza questi
vincoli, ma nella parte finale persistono problemi.
RMS4: il risultato è buono ovunque.
RMS5: Per i residui 6-41 si ottiene come aspettato un RMS simile
a quello di RMS3 mentre l’RMS dell’intera proteina è
sensibilmente migliore.
RMS6 e RMS7: Quanto più piccolo è Aa · Ab tanto migliore è la
determinazione della struttura 3D.
23
Proprietà di nuclei leggeri con J≠0
Nucleo
J
γ (T·s)-1
%
1H
½
1
½
1
½
5/2
½
2.67·108
4.11·107
6.73·107
1.93·107
2.71·107
-3.63·107
2.51·108
99.98
0.02
1.11
99.64
0.36
0.04
100.00
2H
13C
14N
15N
17O
19F
24
Modello a strati
Livelli a particella singola
V = - V0 + ½ k r2 – Vls l⋅s – Vl l(l+1)
25
