Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+

Genetica delle neoplasie ematologiche
Individua le alterazioni genetiche ed epigenetiche presenti nei
vari disordini onco-ematologici
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Fattori estrinseci
Ambiente
Immunodepressione
Fattori estrinseci
Interazioni con ospite
Immunità
Angiogenesi
Danno genotossico
Interazione
Fattori intrinseci
Fattori genetici
Fattori epigenetici
Neopl.
Ematol
Leucemia = processo “multistep”:
accumulo progressivo di eventi (lesioni genetiche, “escape”
immunologico…..
1
1
1
1
2
2
1
3
2
3
3
3
3
2
3
1
2
1
3
3
2
2
3
Forme sporadiche
1
2
3
Eventi necessari per sviluppare il tumore: x (3
nell’esempio)
Predisposizione genetica (tumori ereditari, fattori
favorenti, etc…..
(1)
2
3
Eventi necessari per sviluppare il tumore: x-1 (2
nell’esempio):
Rischio relativo (RR) di sviluppare il tumore molto più
elevato
Tumori ereditari
1
1
1
2
2
1
1
3
2
3
3
2
1
3
2
3
3
3
Bersaglio per il secondo evento immensamente più grande:
2
RR di sviluppare il tumore estremamente più elevato,
rischio quasi3certo
1
2
Alterazioni citogenetiche e molecolari nelle
neoplasie ematologiche (I)
Forniscono informazioni riguardanti la cellula da cui si è
originata la neoplasia
Individuano geni e meccanismi di trasduzione del segnale
responsabili di quel dato disordine onco-ematologico
Marcano la popolazione neoplastica: tutte le cellule che
originano dalla cellula colpita dall’evento trasformante
presentano infatti la stessa lesione genica (“popolazione
clonale”)
Alterazioni citogenetiche e molecolari nelle
neoplasie ematologiche (II)
Consentono di formulare una corretta diagnosi
Identificano particolari entità clinico-biologiche all’interno di
uno stesso disordine oncoematologico
Predicono la prognosi del paziente e possono essere sfruttate
per valutare la risposta alla terapia
Hanno permesso e permetteranno di sviluppare terapie
molecolari sempre pià mirate
Cellula colpita dall’evento leucemogenico
Cellula totipotente non ancora differenziata in grado
di dare origine a colonie mieloidi e linfoidi
Cellula già differenziata o per la mielopoiesi (CFUGEMM) o per la linfocitopoiesi
Prove a favore della genesi a partire da una
cellula staminale
Solo alcune cellule leucemiche, quelle più
indifferenziate e quiescenti sono quelle che una volta
trasferite nel topo determinano una malattia in tutto e
per tutto identica a quella che causano nell’uomo
Cellula staminale leucemica
Condivide l’assetto genico della cellula normale
L’unica differenza ad oggi nota è che presenta
l’inattivazione o la mutazione di un gene
oncosoppressore, PTEN
PTEN: Funzioni
Le cellule staminali normali che non esprimono Pten
se trapiantate nel topo non permettono una ripresa
dell’emopoiesi a lungo termine. Dopo il trapianto
l’emopoiesi si esaurisce
Pten controlla la differenziazione della cellula
staminale sia in senso mieloide che linfoide
Pten e leucemogenesi
Attraverso un meccanismo ancora sconosciuto ma
diverso da quello operante nella cellula staminale
normale le cellule staminali con l’inattivazione di
Pten inducono una malattia se trapiantate nel topo
immunodeficiente NOG
La malattia mieloproliferativa a prevalente
componente mieloide si trasforma poi in leucemia
perché intervengono ulteriori mutazioni
Leucemia Mieloide Cronica
Importanza di alterazioni genetiche
Le traslocazioni cromosomiche MLL-AF9 e quelle
coinvolgenti ERG sono da sole in grado di dare
origine ad un quadro leucemico indipendentemente
dal livello di differenzazione della cellula in cui si
sviluppano.
Fattori genetici
Alterazione di:
• oncogeni
• geni oncosoppressori
• geni regolatori (miRNA etc…)
• geni regolatori della stabilità genetica
MicroRNA (miRNA)
• Sono piccole sequenze di RNA maturo lunghe 2125 nucleotidi
• Riducono o impediscono l’espressione di proteine
• Tagliano direttamente un mRNA bersaglio usando
un meccanismo di “RNA interference” o inibendo
la sintesi proteica.
• L’espressione di miRNAs è tessuto specifica e
correlata allo stadio maturativo di un tessuto.
MicroRNA
Sono trascritti a partire da molecole più lunghe chiamate primiRNA. Questi sono processati nel nucleo della cellula in
“hairpin” RNA, pre-miRNA da una ribonucleasi che taglia
mRNA a doppia catena.
Il pre-miRNA viene trasportato al citoplasma dove è digerito
da una seconda ribonucleasi che taglia mRNA a doppia catena
chiamata “dicer”.
Negli animali il miRNA a singolo filamento si lega ad un
mRNA complementare
I microRNA sino ad oggi identificati sono 1000
Processo di silencing naturale
Processo di silencing indotto
Potenziale modalità terapeutic
miRNA in cancers
Oncogene 2006
Involvement of microRNAs in cancer predisposition?
Ruolo dei miRNA nella leucemia linfatica
cronica (I)
Primo disordine oncoematologico in cui è stata riportata
l’importanza dei miRNA
I pazienti con LLC a cellule B ed espressione del CD5
presentano come più comune singola anomalia una delezione
del cromosoma 13 alla banda q14, del(13)(q14). La delezione
si accompagna ad un decorso clinico indolente
Linfociti B CD5 positivi di soggetti sani esprimono alti livelli
di miR-15a e miR-16-1. Questi miRNA sono mappati
esattamente all’interno della regione di cromosoma 13 deleta
nei pazienti con LLC
Ruolo dei miRNA nella leucemia linfatica
cronica (II)
Nel 70% dei pazienti con LLC a cellule B questi due
microRNA sono poco espressi
Mutazioni “germ-line” nei pri-miR-16-1/15a si osservano in
casi di LLC familiare e si ritiene che predispongano allo
sviluppo di questo disordine linfo-proliferativo
Perché nei pazienti con LLC-B CD5+ il gene
BCL2 è sovraespresso?
miR16-1/15a nei soggetti sani ed in quelli
con LLC
Una sovraespressione dei due miRNA si associa ad una ridotta
espressione di BCL2, gene che codifica per una proteina che
blocca la morte cellulare programmata
Nei linfociti B CD5 positivi di soggetti sani alta espressione
dei due miRNA e bassa espressione di BCL2;
Nei linfociti B CD5 positivi di pazienti con LLC situazione
inversa: bassa espressione dei due miRNA e alta espressione
di BCL2.
Rapporti tra miR16-1/15a e BCL2
La delezione 13q14 causa la perdita dei due miR con
conseguente aumentata espressione di BCL2
Risultato: Cellule leucemiche bloccate nella fase G0/G1 del
ciclo cellulare particolarmente resistenti all’apoptosi
Instabilità genomica
E’ assolutamente necessaria: consente che la
cellula
leucemica o linfomatosa acquisisca sempre nuove mutazioni
che ad esempio la rendono resistente ai protocolli di
chemioterapia
Meccanismi di instabilità genomica
Difettoso funzionamento dei geni preposti al riparo del DNA
Accorciamento della lunghezza dei telomeri con difettoso
funzionamento della telomerasi
Perdita di DDR (DNA Damage chekpoint Response)
Perdita di OIS (Oncogene Induced Senescence)
Progressione della LMC
Fase cronica
Fase accelerata-blastica
≈100%
Dei casi
≈20-30%
limfoide
Considerazioni:
Cromosoma Ph si sviluppa in una cellula pluripotente
La popolazione leucemica Ph-positiva è molto instabile
Conosciamo molto bene i meccanismi che
causano un eccessiva proliferazione ma non
quelli responsabili della progressione e
dell’instabilità genomica
La notevole tendenza alla progressione del clone Ph
positivo ne indica l’importante instabilità genomica
N
2
3
N
N
N
N
N
N
4
N
N
N
N
5N
N Ph+
N
N
N
Ngenici aggiuntivi
Ph+
Ph+
N
Difetti
N
N
N
N N N
N
Ph+
N
N
N
Ph+ Ph+
Ph+
Ph+
N N
N
N
N
N
N
N
Ph+
Ph+
difetti
aggiuntivi
sono
N
N genici
N
N N
N
N
Ph+
Ph+
N
Ph+
Ph+
N - inattivazione
N
di p53 N
N
Ph+
N
N
N
Ph+
Ph+
N N
Ph+
diN p16 Ph+
N- inattivazione
Ph+
N
N N
Ph+
Ph+
N
Ninattivazione di Rb
Ph+
Ph1
Ph+
Ph+
Crisi blastica
N
N
N
N
Ph+
Ph+
N
-Nsovraespressione
di Ph1
EVI Ph1
Ph+
N
Ph+
Ph1
N
Ph1
Ph+
Ph1
Ph1
- …..molti
N
Ph+altri
Ph1
Ph+
Ph1
Ph+
N
Ph+
Ph1
Ph+
Ph1
Ph+
Ph1
Ph1
Ph+
Ph+
Ph+
Ph1
Ph+
Ph1
Ph1
Ph+
Ph+ Ph+
Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph+ Ph1
Ph+ Ph1Ph+Ph1Ph+
Ph1
N
I
1
anni
Fattori Intrinseci Epigenetici
Alterazione del processo di metilazione
Alterazione del processo di acetilazione
La metilazione delle isole CpG nelle regioni che promuovono la trascrizione di un
gene induce silenziamento genico per blocco della trascrizione è un meccanismo
di inattivazione di tumor suppressor genes
p15ink4a
Regolatore negativo del ciclo cellulare ( fase G1-S)
Inibisce le cicline kinasi dipendenti 4 e5
Nelle preleucemie la ipermetilazione di questo gene
si correla con una più breve sopravvivenza e più
rapida progressione clinica
P survival
Sopravvivenza dei pazienti con
preleucemia in base allo stato di
metilazione dip15INK4b
Non metilato
Metilato
T (months)
Quesnel, et al. Blood. 1998;91:2985
Il codice istonico
La coda degli istoni contiene residui di lisina, residui di
arginina e di serina conservati durante l’evoluzione. Tali
residui servono da substrato per la acetilazione, metilazione,
fosforilazione, e ubiquitinazione.
Le modificazioni dello stato combinatorio a livello della coda
degli istoni viene interpretato da complessi proteici che
legandovisi in modo selettivo possono modificare
ulteriormente la cromatina e determinare il destino del DNA
avvolto attorno agli istoni. Tali interazioni determinano
attivazione trascrizionale, silenziamento, replicazione del
DNA a seconda del tipo di cellula, della fase del ciclo
cellulare, del grado di differenziazione e dello stress
ambientale.
Deacetilasi istoniche
Rimuovono i gruppi acetilici dai residui di lisina
localizzati a livello della coda degli istoni e nei
fattori trascrizionali
I substrati delle deacetilasi sono i nucleosomi. Questi
consistono di circa 150 paia di basi di DNA avvolto
attorno ad un ottamero istonico, formato dagli istoni
2A, 2B, 3, e 4. Le code degli istoni protrudono
attraverso il DNA verso la superficie del
nucleosoma, dove possono essere modificati
chimicamente ed interagire con altre proteine
HAT
Sin3
N-cor
HDAC
histon acetylation -> chromatin relaxation -> transcription of
target genes
HAT
complex
HDAC
complex
La cromatina è accessibile
ai fattori trascrizionali,
è possibile l’espressione di geni
necessari per la differenziazione
HAT
complex
HDAC
complex
La cromatina non è accessibile
ai fattori trascrizionali,
non è possibile l’espressione di geni
indispensabile per la differenziazione.
Blocco differenziativo
HDAC
Inattivazione di geni
oncosoppressori
Inattivazione di geni che
regolano la proliferazione,
differenzazione e l’apoptosi
Cruciali per preparare l’istone alla
rimozione di gruppi acetile tramite la
metiltransferasi