UNITÀ CNR PISA
COMPETENZE
L’unita di ricerca di Pisa e’ costituita da personale dellIstituto di Biofisica CNR (IBF-CNR) e
dell’stituto di Neuroscienze CNR (IN-CNR). Il gruppo del IBF-CNR riunisce ricercatori con competenze nell’analisi di segnali fisiologici, modellizzazione biofisica di sistemi biologici complessi e
dinamica nonlineare. Nellambito dell’analisi di segnali fisiologici sono stati impiegati i metodi di
analisi nonlineare di serie temporali per la caratterizzazione dinamica di segnali di origine neurale
e cardiaca. In particolare: a) registrazioni da neuroni centrali della lumaca Lymnaea Stagnalis; b)
segnali ECG da soggetti sani e in trapiantati; c) segnali ECG e di pressione arteriosa da soggetti
con intolleranza ortostatica c) segnali EEG da soggetti affetti da epilessia. Nel contesto della sincronizzazione e della dinamica neurale sono stati studiati i fenomeni di sincronizzazione emergenti
in reti di interneuroni accoppiati mediante sinapsi inibitorie ed elettriche. Sono stati anche studiati
gli effetti di risonanza stocastica che si presentano in semplici modelli neurali. Infine nel gruppo
(IBF-CNR) ci sono le competenze necessarie per lo studio dei fenomeni di propagazione di onde
nonlineari. I ricercatori del gruppo dell’IN-CNR si occupano di modelli animali di epilessia dei lobi
temporali. Per questi studi utilizzano tecniche comportamentali, elettrofisiologiche, anatomiche e
molecolari. Particolarmente rilevante, ai fini del progetto, e’ la loro capacit di effettuare esperimenti
che prevedono la registrazione elettrofisiologica di crisi epilettiche in animali liberi di muoversi, e
la valutazione anatomica del danno neuronale susseguente agli attacchi.
CONTESTO DI RICERCA
Tutte le manifestazioni epilettiche derivano da uno sbilanciamento tra le attivita’ inibitorie ed eccitatorie in una rete di neuroni accoppiati. Questi sbilanciamenti possono essere osservati in modelli animali mediante l’uso di opportuni antagonisti/agonisti (per esempio mediante la riduzione
dell’efficienza GABAergica o il potenziamento dell’eccitabilita’ neurale). Sebbene dal punto di vista
della classificazione clinica esistano diversi tipi di manifestazioni epilettiche, si ritiene che i meccanismi cellulari che stanno alla base di questa patologia siano comuni, e cio: a) una eccitazione
ricorrente tra neuroni piramidali (sia nella corteccia che nell’ippocampo); b) una sincronizzazione
anormale del network talamo-corticale (absence seizures). E’ ben noto in modelli animali e nelluomo che l’attivit epilettica prolungata che insorge nelle aree limbiche del cervello (status epilepticus limbico) produce morte neuronale in settori vulnerabili dell’ippocampo (regioni CA1, CA3
e ilo del giro dentato) e nelle aree paraippocampali. Il danno neuronale generalmente ascritto a
fenomeni di eccitotossicit conseguenti ad eccessivo rilascio di glutammato dalle cellule piramidali
dell’ippocampo. Tuttavia, non noto quali caratteristiche della scarica epilettica siano fondamentali
per avviare il processo di degenerazione. In questa parte del progetto ci proponiamo di analizzare
quantitativamente il tracciato elettroencefalografico (EEG) di animali sperimentali sottoposti a status epilepticus e di correlare le caratteristiche del segnale con il grado di morte neuronale osservato
negli stessi animali mediante un’analisi istopatologica.
OBIETTIVI
La nostra unita di ricerca si propone di analizzare quantitativamente il tracciato elettroencefalografico (EEG) in animali sperimentali sottoposti a status epilepticus e di correlare le caratteristiche
del segnale con il livello di morte neuronale osservato negli stessi animali mediante un’analisi istopa1
tologica. Per il raggiungimento di tali obiettivi si procedera nel modo seguente: analisi lineare e
nonlineare dei segnali per la ricerca di indicatori che consentano di correlare certe caratteristiche dei
dati EEG all’entita’di morte neuronale; studio, mediante modellizzazione biofisica di reti di neuroni
piramidali accoppiati, delle condizioni che determinano l’emergenza di fenomeni di sincronizzazione
e della corrispondente stabilita’ e determinazione di appropriati valori dei parametri di controllo in
modo da riprodurre qualitativamente le caratteristiche dei dati EEG.
METODI
Per il perseguimento di questi obbiettivi verranno impiegate tecniche sperimentali e teoriche. Esperimenti: utilizzeremo per questi scopi un modello animale di status epilepticus limbico ben
caratterizzato nel nostro laboratorio. Ratti di 35 giorni di et verranno impiantati con elettrodi
cronici localizzati nelle regioni CA1 e CA3 dell’ippocampo e nella corteccia parietale. Dopo due
giorni dall’impianto, gli animali verranno sottoposti a registrazione dell’EEG basale per circa 30
minuti. Dopo questo intervallo di tempo, gli animali riceveranno una iniezione intraperitoneale
di acido kainico (12 mg/kg). Il trattamento con acido kainico induce crisi epilettiche a livello
dell’ippocampo che poi si diffondono agli emisferi corticali. Lo status epilepticus si protrae tipicamente per 2-3 ore al termine delle quali gli animali recuperano un comportamento normale. Il
segnale EEG proveniente dagli elettrodi corticali ed ippocampali verr amplificato 5,000 volte, filtrato con un filtro passa-banda (0.1-3,000 Hz) e digitalizzato. Gli animali verranno sacrificati a due
settimane dallo status epilepticus, e sezioni di cervello saranno preparate per lanalisi istologica. Il
numero di neuroni presenti nei settori CA1, CA3 e nell’ilo del giro dentato verr valutato per mezzo
di tecniche stereologiche e cio’ consentira di avere una stima quantitativa dell’entita’ di morte neuronale in queste strutture neurali. Analisi dei segnali EEG: i dati raccolti durante gli esperimenti
verranno caratterizzati mediante metodi di analisi lineare e nonlineare di serie temporali. La prima
fase consistera’ nell’impiego di una serie di tecniche lineari basati sull’analisi spettrale (spettri di
Fourier, correlazioni, ecc.). I risultati ottenuti con questo approccio dovranno poi essere esaminati
per selezionare eventuali indicatori capaci di correlare specifiche caratteristiche del segnale EEG all’
entita’ della morte neuronale. Un punto importante sara quello di stimare i livelli di correlazione
tra segnali EEG registrati in differenti punti di un certo settore ippocampale. Cio’ consentira’,
per esempio, di valutare se i livelli di correlazione tra coppie di segnali EEG hanno una qualche
dipendenza statistica dalla differenza tra le stime di morte neuronale ottenute in punti differenti.
A tale scopo, oltre alle tecniche lineari di cross-correlation, verranno impiegate anche quelle nonlineari basate sulla teoria dell informazione. In particolare utilizzeremo la mutua informazione che
permette di quantificare i livelli di correlazione nonlineare tra due o piu’ segnali. Nella seconda fase
dello studio si prevede di applicare ai dati EEG i metodi di analisi nonlineare di serie temporali
(basati sulle proprieta’ tipiche dei sistemi caotici basso-dimensionali). Per quantificare il livello di
complessit’ dei segnali EEG utilizzeremo i metodi di predicibilita’ nonlineare di serie temporali. A
questo scopo dovranno preliminarmente essere determinati, mediante l’impiego di opportuni algoritmi, i cosiddetti parametri di ricostruzione (dimensione di embedding e lag time) dello spazio delle
fasi. A cio’ seguira’ la stima dei livelli di predicibilita’ sia sui dati originali che su quelli surrogati e il
loro confronto statistico. Infine calcoleremo i livelli di correlazione tra queste misure di complessita’
degli EEG e i tassi di morte neuronale. Valuteremo poi se sara’ il caso di integrare questi risultati
con quelli ottenibili con altri metodi di analisi nonlineare di serie temporali (algoritmi per stime di
dimensionalita’ ed esponenti di Lyapunov). Modelli biofisici: questa fase delle ricerche consistera’
nel mettere a punto un modello realistico di rete di neuroni piramidali ippocampali accoppiati con
sinapsi eccitatorie, e di studiarne le proprieta’ dinamiche. La prima tappa sara’ quella della scelta
di un opportuno modello biofisico del singolo neurone piramidale e della modellizzazione degli ac2
coppiamenti sinaptici. Successivamente si dovranno selezionare dei valori realistici dei parametri
del modello in modo tale che le attivita’ elettriche dei singoli neuroni siano sincronizzate (si studiera
anche la stabilita’ di questi regimi coerenti). Inizialmente l’accoppiamento tra neuroni sara’ allto-all, in seguito si prendera’ in considerazione anche il caso in cui ogni neurone e’ accoppiato
con un numero inferiore di unita’. Infine, prendendo in considerazione soltanto il segnale medio
dell’attivita’ della rete e variando opportunamente i parametri di controllo, si cerchera di riprodurre qualitativamente le caratteristiche dei segnali EEG (nei regimi basale e status epilepticus).
L’obiettivo finale sara’ quello di identificare quali caratteristiche delle correnti ioniche del modello
o dell’accoppiamento possano essere correlate ai livelli di morte neuronale.
RICADUTE DEL PROGETTO
I risultati ottenuti nel corso di questo studio dovrebbero permettere un avanzamento delle conoscenze
dei meccanismi attraverso i quali una attivit elettrica di tipo patologico in grado di modificare il
destino delle cellule nervose. Dal punto di vista della potenziale applicabilit clinica, la correlazione
tra segnale EEG e morte neuronale potrebbe avere un valore predittivo nel senso di individuare
caratteristiche del tracciato EEG durante le crisi indicative di un successivo danno cerebrale. Infine la messa a punto di un modello biofisico realistico di una rete di neuroni piramidali potrebbe
rivelarsi utile per simulare i possibili effetti della somministrazione di certe sostanze chimiche sui
tassi di morte neuronale
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