Metodologie di ricerca per lo studio del sistema nervoso 1) Identificare le regioni cerebrali implicate in ciascuna componente 2) Analizzare come sono connesse le regioni cerebrali coinvolte 3. Metodi comportamentali 2. Mappatura delle aree e delle loro funzioni 1. Singola cellula SCOPERTA DEL “NEURONE” Jan Evangelista Purkinje (1789- 1869) Camillo Golg SNC rete diffusa (1843 - 1926) Entrambi Nobel 1906 Santiago Ramòn y Cajal neuroni (1852-1934) Jan Evangelista Purkinje Sostenitore filosofia della natura Le cellule da lui osservate erano quindi “piccole anime pensanti” 1837 “Lo scienziato deve essere anche un artista creativo….. Il microscopio deve promuovere qualità immaginative e trascendere la realtà visiva” 1873 Reazione “nera” di Golgi Franz Joseph Gall (1800) Frenologia: Studio suddivisioni cervello in base a funzione e indici anatomici (es. forma del cranio) Unità funzionale del SNC • Neurone • rete 1. Singola cellula •Tecniche di colorazione e marcatura dei neuroni Apprendimento e memoria •Tecniche di determinazione della funzione: Elettrofisiologia Stimolo Registrazione Apprendimento e memoria, basi molecolari: LTP LTP Misurare l’attività di un singolo canale pipetta da patch a contatto di una cellula Configurazione del patch 2a. Aree del cervello e connessioni: mappatura delle connessioni •Tecniche di colorazione e marcatura dei neuroni Bulbo olfattivo: corpi cellulari (sotto) e sinapsi (sopra) Corteccia cerebellare: corpi cellulari (B) e sinapsi (G) Corteccia Nucleo genicolato somatosensitiva, laterale, marcatura marcatore attività anterograda sinaptica Proiezioni gangli Sistema nervoso Assoni motori (G) radici dorsali verso autonomo, iniezione e sinapsi midollo spinale, intracellulare enzima neuromuscolari marcatore marcatore (R), GFP proteins enzimatico Neuroni sensitivi olfattivi nel naso marcati con colorante vitale nel bulbo olfattivo indicatori fluorescenti • Fluoroforo coniugato a un anticorpo • Indicatori sensibili alla concentrazione di ioni • Indicatori di voltaggio • Proteine fluorescenti Marcatura retrograda o anterograda Assoni efferenti (anterograda): iniezione di sostanze radioattive (amino acidi) lectine (PHA-L) o fluoresceinate Assoni afferenti (retrograda): fluorogold Perossidasi del Rafano (1971) Un enzima che in presenza del substrato produce un prodotto colorato o fluorescente. Se iniettato vicino alle terminazioni assoniche entra nel Neurone per endocitosi e per trasporto assonale retrogrado Raggiunge il corpo cellulare e i dendridi 2b. Aree del cervello e connessioni: Individuazione delle funzioni •Tecniche di ablazione e stereotassi Ablazione o lesione di una determinata area del cervello ed analisi comportamentale dell’individuo risultante Limiti: interpretazione dei risultati Pseudo rabbia da decorticazione Che scompare isolando anche L’ipotalamo Metodi di lesione -Lesioni da aspirazione: per strutture corticali -Lesioni da radiofrequenze: tramite calore prodotto. Per strutture sottocorticali -Resezione chirurgica -Blocco criogeno: lesione reversibile -Lesioni chimiche selettive: Acido cainico, acido ibotenico: assorbiti in prossimita’ della pipetta 6-idrossidopamina: assorbita da neuroni noradrenergici e dopaminergici (induzione di Parkinson) Nell’uomo? Lesioni Lesioni dovute ad incidenti: analisi post-mortem Gage: distruzione della corteccia frontale sopraorbicolare Senza inibizioni, infantile, irresponsabile, indifferente alle reazioni degli altri e delle conseguenze Ablazioni in seguito a tumori, epilessia o ictus L’ippocampo e la memoria •Tecniche di Registrazione: elettrodi interni L’elettrodo viene inserito nella regione desiderata e registra l’attività di un gruppo di neuroni in risposta ad appropriati stimoli Con elettrodi esterni Elettroencefalogramma (EEG) •Due elettrodi collegati ad un amplificatore elettronico vengono posizionati nell’area di interesse sul cuoio capelluto. •Consente di rilevare l’attività elettrica complessiva di tutti i neuroni compresi tra due elettrodi applicati ·Per convenzione, nell’ EEG eccitazione e’ rappresentata con deflessione NEGATIVA L’elettroencefalogramma 1-30 Hz 20-100microV EEG • • • • Onde delta 0,5-4 Hz (sonno ) Onde theta 4-7 Hz (sonno) Onde alfa 8-13 Hz (sveglio rilassato) Onde beta 13-30 Hz (attività mentale) EEG misura • Potenziali spontanei • Potenziali evocati Morte clinica Morte cerebrale valutata con EEG • Onde cerebrali inferiori ai 2microVolt per 30 min • No potenziali evocati Epilessia Vantaggi: • elevata risoluzione temporale • basso costo Svantaggi: • bassa risoluzione spaziale • non adatta per registrazioni di risposte a brevi stimoli (Variante: potenziali evocati) Studi del sonno Stadio 1 del sonno Veglia alfa beta Theta REM Attività delta Registrazioni: elettrodi esterni potenziali evocati (SEP) · Variazione di EEG in relazione a stimolo sensoriale ·Sincronizzati con la stimolazione sensoriale ·Non evidenti da EEG=> AVERAGING: estrazione SEP (segnale) da EEG (rumore) Stimolazione sensoriale visiva,acustica, meccanica, gustativa e olfattiva ·Picchi positivi e negativi generati da diverse strutture neurali Picchi precoci: Strutture sottocorticali Picchi intermedi: Corteccia sensoriale primaria Picchi tardivi (300-500 ms) sono i potenziali correlati ad attivita cognitive superiori (memoria, attenzione) ·Utili per valutare lo stato funzionale di sistemi sensoriali ·Diagnosi precoce di malattie: -es. in sclerosi multipla si ha demielinizzazione=>diminuzione di velocita’ di conduzione=> aumento latenza in potenziali evocati ERP potenziali legati all’evento (suono) Brain-computer interface • Con 96 elettrodi un paziente tetraplegico può muovere un cursore di un computer o aprire e chiudere una mano robotica Visualizzazione del cervello • Tomografia a emissione di positroni PET • Risonanza magnetica RM Risonanza magnetica nucleare • Si basa sulle proprietà magnetiche degli atomi,dovute al fatto che le cariche elettriche in movimento generano un campo magnetico. • Questo ad esempio accade nei protoni che si stima siano circa 70-80% degli atomi che costituiscono gli organismi Un campo magnetico esterno provoca l’llineamento dei nuclei Risonanza magnetica funzionale • La risposta emodinamica di un tessuto può essere visualizzata sfruttando le proprietà magnetiche del ferro contenuto nell’emoglobina e le loro variazioni dipendenti dallo stato di ossigenazione Risonanza magnetica funzionale • L’emoglobina ossigenata non altera significativamente il campo magnetico locale • L’emoglobina deossigenata è paramagnetica a causa dei 4 elettroni disaccoppiati del ferro e è in grado di perturbare il campo magnetico locale Cambia il rapporto tra Hb ossigenata e deossigenata Immagini di risonanza magnetica funzionale Vantaggi: • non richiede uso radioattivo • buona risoluzione temporale • immagini del cervello con risoluzione spaziale elevata Svantaggi: • Costo •Tomografia ad emissione di positroni Iniezione nel circolo sanguigno di (PET) una sostanza radioattiva che viene assunta nelle diverse aree del cervello a seconda dell’attività. Ad attività maggiore corrisponde radioattività maggiore. Il computer produce una immagine a codice cromatico Consente di misurare: •attività metabolica (Glucosio) •flusso sanguigno •captazione di ossigeno •attività di recettori (neurotrasmettitore) Scansioni PET del cervello in attività Vantaggi: • Risoluzione spaziale ottima • Evidenzia la funzione delle strutture, visualizzandone il livello di attività Svantaggi: • Bassa risoluzione temporale • No immagini del tessuto nervoso (deve essere associata a MRI) • Apparecchiatura costosa, deve prevedere nelle vicinanze un ciclotrone • OPTICAL IMAGING ·Registrazione di attivita’ di popolazione di neuroni ·Uso di traccianti sensibili al voltaggio: rispondono a variazioni di potenziale con variazioni dello spettro di fluorescenza o assorbimento ·Ottima risoluzione spaziale e temporale Risoluzione dell’EEG e di tecniche di visualizzazione Tecnica EEG Risoluzione Risoluzione temporale spaziale 1 msec 10-15 mm PET 45 sec 4 mm MRI 3-5 sec 1-1.5 mm 3. Tecniche comportamentali Hanno come obbiettivo il prodotto del funzionamento del cervello, vale a dire i comportamenti individuali • Test psicologici valutano la funzione emotiva, cognitiva o intellettiva Apprendimento motorio Seguire i margini della figura allo specchio Wisconsin card sorting test test di funzionalità lobi frontali • Sono utilizzate 128 carte contenenti da 1 a 4 figure identiche di un singolo colore • Le figure sono: stelle,croci, triangoli cerchi • Rosso, giallo, blu e verde Wisconsin test Wisconsin test Colore Forma Numero Somministrazione del test: Quelle che ha davanti sono 4 carte guida, metta le carte del mazzo sotto le carte guida dove pensa sia opportuno Io le dirò se è giusto o sbagliato Il criterio (colore, forma, numero) non viene anticipato e cambia Dopo 10 risposte esatte si cambia criterio Particolare rilevanza ha l’Errore perseverativo Negli animali: Test comportamentali Il concetto di mente • Prodotto dell’attività encefalica • Proprietà emergente dell’attività encefalica Idrogeno e ossigeno hanno caratteristiche del tutto diverse Dall’H2O Le molecole (prive di via) che costituiscono un organismo Si organizzano a formare un essere vivente Nei sistemi complessi emergono caratteristiche imprevedibili