PARP-1 nel differenziamento di cellule dendritiche umane come potenziale target
farmacologico per patologie croniche associate a disregolazione del sistema
immunitario
Le cellule dendritiche (DC) sono le più efficienti cellule immunocompetenti presentanti
l'antigene che partecipano alle reazioni immunitarie sia innate che adattative. Nei siti di
infiammazione, in cui vengono richiamate da stimoli chemotattici, a loro volta rilasciano
chemochine e citochine con cui possono interagire con le cellule residenti attivate dalle condizioni
infiammatorie. E’ crescente l’interesse per le DC come elementi patogenetici per molte malattie su
base immunologica ed infiammatoria, come la sclerosi multipla (SM) o l’aterosclerosi. E’ stato
dimostrato infatti, che le DC sono implicate nel fenomeno dell'epitope spreading, evento
indispensabile per la progressione della SM e denominatore comune di varie patologie croniche
immunomediate [1]. E’ noto che il danno tissutale generatosi durante una risposta immunitaria,
porta al priming di self-reactive T e/o B linfociti, indipendentemente dalla specificità dell’insulto
iniziale [2]. E’ stato dimostrato che le DC sono inoltre presenti nella lesione aterosclerotica e
aumentano all’aumentare della progressione della malattia [3]. Nel loro ciclo vitale le DC evolvono
da una forma immatura, deputata al riconoscimento e alla cattura degli antigeni, ad una forma
matura che presenta gli epitopi ai linfociti T e B per innescare una risposta immunitaria efficace o
indurre tolleranza immunologica. Tale transizione fenotipica e funzionale avviene mediante una
ridistribuzione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), down-regulation
dell’internalizzazione dell'antigene, un aumento dell’espressione superficiale di molecole
costimolatorie, modifiche morfologiche (es. formazione di dendriti), riorganizzazione del
citoscheletro, secrezione di chemochine, citochine e proteasi, ed espressione di molecole di
adesione e recettori per chemochine. I tipi e la regolazione di risposte indotte cellulo T-mediate
(tolleranza vs immunità, Th1 vs Th2 ) possono variare a seconda della specifica linea DC (mieloidi
o linfoidi) e fase di maturazione in aggiunta ai segnali di attivazione ricevuti da il microambiente
circostante[4]. DC mature esprimono alti livelli di proteine che controllano il fattore trascrizionale
NF-kappa B come Rel A/p65, Rel B, Rel C, p50 and p52. Tali proteine regolano l’espressione di
geni codificanti varie proteine immunitarie o infiammatorie. L’inibizione della traslocazione
nucleare di NF-kappa B blocca la maturazione delle DC prevenendo l’induzione della
differenziazione linfocitaria. In siti di infiammazione, quali le placche aterosclerotiche instabili, la
presenza e l’attività delle cellule dendritiche mature è correlata alla cronicizzazione del processo
infiammatorio [5]. Risulta quindi importante trovare strategie che possano ripristinare la disregolazione immunologica che contribuisce all’amplificazione e cronicizzazione del processo. Dati
ottenuti in vitro dimostrano che farmaci come le statine presentano effetti pleiotropici in grado di
modulare la maturazione e la funzione di cellule dendritiche umane e sono in grado di diminuire il
numero di DC presenti nella lesione aterosclerotica [3].
La poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP)-1 è un enzima nucleare che catalizza la formazione di
catene di poly(ADP-ribosio) (PAR) a partire dal NAD. Tale polimero interagendo con le proteine
ne modifica il funzionamento ed originariamente PARP-1 veniva descritta solo come sensore di
danno al DNA. Evidenze sperimentali dimostrano che PARP-1 si comporta anche da regolatore
della trascrizione genica, sebbene i meccanismi molecolari che sottendono tale effetto non sono
ancora ben chiari. In particolare è stato dimostrato essere un fattore chiave nella regolazione
dell’espressione genica indotta durante il differenziamento in vitro delle DC umane e che è in grado
di regolarne la funzionalità promuovendo la trascrizione di geni chiave per la loro
immunocompetenza [6]. PARP-1 in modelli murini Apoe-/- di aterosclerosi è stata dimostrata essere
associata alla risposta infiammatoria e all’espressione di importanti molecole di adesione come
VCAM-1 e le selettine. Inoltre l’inibizione di PARP-1 riduce l’espressione di mediatori proinfiammatori (INFγ, TNFα, iNOS, COX2 e IL1) nel midollo spinale di ratti con encefalomielite
autoimmune e sopprime l’attività di AP1 e del fattore di trascrizione NF-kappa B, entrambi
implicati nella produzione di IL2, INFγ, TNFα da parte di linfociti [7]. Sebbene gli effetti di una sua
inibizione in modelli murini abbiano dimostrato una riduzione del numero e funzionalità delle
cellule dendritiche nella lesione, gli effetti di una sua inibizione su cellule dendritiche umane e sulle
loro possibili interazioni con le cellule della parete vascolare, non sono stati ancora chiariti. La
comprensione dei meccanismi molecolari che sottendono al ruolo di PARP-1 come regolatore della
trascrizione genica in cellule immunocompetenti come le DC, risulta di estremo interesse al fine di
poter utilizzare suoi inibitori enzimatici come tool terapeutici per patologie croniche associate a
disregolazione del sistema immunitario.
SCOPO: Dato il ruolo centrale delle cellule dendritiche nell’induzione di una risposta immune, lo
scopo della ricerca proposta è quello di studiare in vitro la possibile modulazione dei meccanismi
coinvolti nella differenziazione fenotipica e funzionale delle DC, mediata da statine e inibitori di
PARP-1.
Verranno studiati:
1. Gli effetti di statine e PARP-1 inibitori sulla differenziazione fenotipico/funzionale di DC
ottenute da precursori circolanti di donatori sani.
2. Verranno valutati gli effetti di statine e PARP-1 inibitori sulle interazioni tra VSMC e DC di
donatori sani in condizioni sperimentali che mimano l’infiammazione.
3. In seguito al trattamento delle DC coi suddetti farmaci, verrà valutato il ruolo di NF-kB nella loro
maturazione e nelle interazioni con le VSMC.
Verranno impiegati i seguenti metodi:
1) Generazione ex-vivo di cellule dendritiche ottenute da precursori monocitari in vitro.
I precursori monocitari CD14+ delle DC saranno isolati da sangue periferico [8]. Brevemente, i
linfomonociti (PBMNC) umani saranno separati da buffycoat di donatori sani mediante
centrifugazione standard su gradiente di densità Ficoll-Hypaque. Cellule CD14+ verranno purificate
con tecniche immunomagnetiche (magnetic cell sorting-MACS) e messe in coltura in RPMI
arricchito con rhGM-CSF (800 U/ml) e rhIL-4 (1000 U/ml). Il terreno arricchito in citochine sarà
rinnovato al giorno 3 e le DC immature raccolte al giorno 6. Per ottenere DC mature verrà aggiunto
per altre 24h uno stimolo di maturazione rappresentato da un cocktail di citochine (10 ng/ml IL-1;
1000 U/ml IL-6, 10 ng/ml TNF-). Dopo 24 ore, le cellule non adese verranno raccolte ed
analizzate [9].
2) Caratterizzazione fenotipica delle DC.
Al termine della settimana di coltura, il differenziamento dei precursori mieloidi in DC sarà valutato
mediante caratterizzazione immono-fenotipica con citofluorimetro EPICS XL (Beckman Coulter) e
mediante microscopia confocale. Verrà valutata l'espressione di specifici marcatori dendritici quali
HLA-DR, CD1a, CD1c, CD40, CD83, CD80, CD86 [9].
3) Caratterizzazione funzionale delle DC.
La funzionalità delle DC verrà valutata tramite MLR: in piastre da 96-well diverse concentrazioni di
DC verranno aggiunte a 2x105 linfociti-T CD4+CD45RA+ naive e coincubati per 5 giorni. Alla
coltura verrà aggiunta timidina triziata (1Ci/well) per altre 18 ore ed infine misurata
l'incorporazione di timidina triziata, indice della proliferazione cellulare [10].
4) Misurazione citochine infiammatorie.
Verranno valutate e quantificate le più importanti chemochine e citochine infiammatorie rilasciate
da cellule dendritiche mature in grado di attrarre linfociti (CCL19 e CCL21) o commissionarli verso
un fenotipo TH1 o TH17 effettore (IL12 e IL23) mediante Kit ELISA su campioni derivanti da
medium di coltura [11].
5) Cellule Muscolari Lisce Vascolari (VSMC).
Verranno utilizzate cellule muscolari lisce coronariche umane (CASMC) acquistate dalla Lonza.
6) Studi di adesione.
L'adesione di DC alle CASMC verrà valutata mediante lettore di fluorescenza. Brevemente, DC
pretrattate con statine o PARP-1 inibitori e in seguito marcate con un opportuno marcatore
coniugato ad un fluorocromo saranno incubate con un monostrato di cellule muscolari. Dopo
opportuni lavaggi, verrà quantificata l'adesione delle DC con un lettore multipozzetto a fluorescenza
[11]. Tale interazione verrà studiata anche in presenza di anticorpi (o molecole) neutralizzanti i
recettori TLR od in seguito al loro silenziamento genico ed al silenziamento genico di Parp-1.
7) Silenziamento genico.
Tale tecnica consente di sopprimere l'espressione di specifici geni e consiste nel processamento di
un RNA a doppio filamento in piccoli oligonucleotidi che possono riconoscere mRNA target e
condurlo ad un'inattivazione traduzionale o alla degradazione vera e propria [12]. Pertanto RNA a
doppio filamento in grado di riconoscere RNA target verrà sintetizzato in accordo alle linee guida
suggerite dalla ditta (Ambion Europe Ltd. Huntingdon UK) ed introdotto nelle cellule.
Successivamente la conferma dell'avvenuto silenziamento genico avverrà con esperimenti di
Western blot e RT-PCR.
8) Microscopia a fluorescenza.
Per la microscopia a fluorescenza le cellule verranno fissate con fissativo costituito da
paraformaldeide, lisina e periodato (PLP) in tampone fosfato e
successivamente marcate con un anticorpo primario seguito da quello secondario coniugato a
fluoroforo [11].
9) Western blot e RT-PCR.
Gli effetti dei farmaci sulla maturazione delle DC saranno studiati anche mediante la misurazione
dell'espressione di mRNA di citochine infiammatorie ed elementi della via NF-kB. Gli effetti dei
farmaci sull’interazione fra DC - VSMC saranno studiati anche mediante la misurazione
dell'espressione di probabili molecole interessate, come molecole di adesione e integrine (ICAM-1,
VCAM-1, CD18, CD11c) [13].
BIBLIOGRAFIA
1- Ludewig B et al. Journal of Leukocyte Biology 2004;76(2):300-306.
2-Vanderlugt CL et al. Nat Rev Immunol. 2002;2(2):85-95.
3- Yilmaz A et al. Atherosclerosis. 2004; 172(1):85–93.
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5- Erbel C et al. Basic Res Cardiol. 2007; 102 (2): 123-32.
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10- Bellik L et al. Microgravity-Science and Technology.2008;21:145-150.
11- Paccosi et al. Pharmacological research. 2012;66(6):526-535.
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