Genetica molecolare
dell’autismo
La ricerca dei fattori genetici di rischio
W W W.FISIO KINESITERAPIA.BIZ
Autismo infantile
z
z
caratterizzato da sintomi in 3 diverse aree:
1. compromissione della comunicazione verbale e non
verbale
2. problemi nell’interazione sociale
3. attività, modalità di comportamento ed interessi
ristretti, ripetitivi e stereotipati
» I sintomi insorgono nella prima infanzia (entro i 3 anni) e
perdurano per tutta la vita
Parte di uno spettro più ampio di disturbi fra cui la
Sindrome di Asperger e altri Disturbi Generalizzati dello
Sviluppo (PDD)
Prevalenza nella popolazione
•
•
~ 5/10000 ->stima generalmente riportata
Studi recenti hanno indicato una prevalenza più alta:
• 1-3/1000 definizione stringente di autismo
• 6/1000 disturbi dello spettro autistico
La prevalenza dell’autismo sta aumentando?
¾ Cambiamento graduale nei criteri diagnostici e negli strumenti
diagnostici
¾ Maggiore conoscenza del disturbo
¾
¾
Rapporto maschi/femmine ~ 3-4:1
Ritardo mentale presente in ~ 75%
Fattori genetici
La prima descrizione risale a L.Kanner (1943)
z L’importanza di fattori genetici alla base dell’autismo
non venne riconosciuta fino alla metà anni ‘70
z
»Assenza di trasmissione verticale
»Basso tasso di autismo nei fratelli di individui affetti (≈ 3%)
Importanza di fattori genetici:
STUDI DI RICORRENZA FAMILIARE: RISCHIO RELATIVO λR
Esprime il grado di aggregazione familiare di un carattere
λs = rischio nei fratelli/sorelle di un affetto
rischio nella popolazione generale
CONCORDANZA IN GEMELLI MONOZIGOTICI/DIZIGOTICI
Permettono di stabilire se l’aggregazione familiare e’ dovuta all’ambiente familiare in comune
oppure a fattori genetici
MZ = 100% geni in comune
DZ = 50% geni in comune
Una maggiore concordanza in gemelli MZ e’ indice di fattori genetici. Tuttavia:
• Tendenza a trattare i gemelli MZ in modo piu’ simile dei DZ
• Differenze genetiche fra gemelli MZ (geni sistema immunitario, mutazioni somatiche,
pattern inattivazione X)
STUDIO DI INDIVIDUI ADOTTATI
Altro metodo per individuare il contributo di fattori ambientali ed effetti genetici
Studi di gemelli
100
Cognitive disorder
90
Concordance rate
80
Social disorder
70
Social and cognitive
disorder
Autism
60
50
40
30
20
•grossa
disparità fra i tassi di
concordanza dei gem. MZ e DZ:
importanza di fattori genetici
•Concordanza
molto bassa nei DZ:
azione epistatica di più geni
•Concordanza
per un più ampio
spettro di disturbi socio-cognitivi
in forma meno grave che
nell’autismo: “broader phenotype”
•Eterogeneità clinica
10
0
MZ (n=25)
Bailey et al, 1995
DZ (n=20)
(same sex)
Studi di ricorrenza familiare
25
Any one of three key
aereas
% in siblings of proband
20
Any two of the three key
areas
15
Communication and social
deficit
Asperger's/PDD
10
Autism
5
0
AUTISM
Bolton et al, 1994
DOWN'S
•Frequenza nei fratelli di probandi ≈ 3%
(~ 6% per PDD)
•Maggiore rischio di ricorrenza rispetto
alla prevalenza nella popolazione
• λs = 10-50
•“broader phenotype”
•Relazione
diretta
fra
gravità
dell’autismo e broader phenotype nei
familiari
Studi epidemiologici: conclusioni
• Forte componente genetica
• La predisposizione genetica si estende oltre la
diagnosi classica di autismo, includendo il broader
phenotype
• Escluso modello Mendeliano monogenico
• L’autismo è un disturbo genetico multifattoriale,
cioè non riconducibile a mutazioni di un singolo
gene, ma dovuto all’azione di varianti in più geni e
all’interzione e con l’ambiente
Mutazioni e polimorfismi
D NA
actcgggctaaactttcggggcccaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
proteina
Mutazioni
varianti rare di 1 tratto di DNA che hanno un effetto sul fenotipo
actcgggctaaactttcggggccTaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
ST OP
Polimorfismi
varianti di 1 tratto di DNA presenti nella popolazione con frequenze non
trascurabili (>1%). In genere non patogeniche
actcgAgctaaactttcggggcccaaactacgactagctaCctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
Caratteri genetici complessi
Frequenza
SUSCEPTIBILITY ALLELES
Valore soglia
Numero di Fattori di Rischio
•Il carattere è influenzato da un certo numero di fattori di rischio
•Individualmente ciascun fatt. di rischio ha un effetto moderato. La piena manifestazione
del carattere è la risultante dell’azione combinata dei vari fattori di rischio
Caratteri genetici complessi
Eterogeneità
A
B
Fenotipo
C
Associazione con condizioni genetiche conosciute
Non sappiamo ancora quanti siano i geni implicati nell’autismo e come questi
interagiscano fra di loro e con altri fattori non genetici.
Solo in una minoranza dei casi (<10%) l’autismo è riconducibile ad una causa nota:
Patologie genetiche
z
z
Sclerosi tuberosa
Sindrome X-Fragile
Anomalie cromosomiche
z
15q11-q13
z
z
z
1-3 %
Duplicazioni interstiziali o [inv-dup 15]
Ereditate per via materna
Fattori ambientali
z
Fattori di rischio prenatali
» Esposizione in utero a talidomide o acido valproico
» Infezione da virus rosolia
z
Fattori di rischio ambientali
» Infezioni (cytomegalovirus, herpes)
» Mercurio
» Fattori nutrizionali
» Vaccino trivalente (MMR)
Come identificare i geni?
• Screening dell’intero genoma umano analizzando un elevato numero
di famiglie con almeno 2 individui affetti (multiplex) con metodi di
LINKAGE non parametrici
• ASSOCIAZIONE ALLELICA (linkage disequilibrium mapping)
• Geni CANDIDATI
• Anomalie citogenetiche
Analisi di LINKAGE “tradizionale”
(Metodi “parametrici” )
•
•
•
Dipende dalla specificazione di un modello di ereditarietà
Si contano gli eventi di ricombinazione fra due loci
Test: frazione di ricombinazione (θ) < 0.5
D +
1 1
+ +
2 2
D +
1 2
D +
1 3
NR
+
1
+ +
3 4
+
3
R
+ +
2 4
D +
2 4
NR
R
Metodi di linkage ‘Non-parametrici’
A,B C,D
E,F G,H
A,E D,H
Famiglie con almeno
2 fratelli affetti
Regione qualsiasi
Regione vicina ad un
gene di “suscettibilità”
A,C B,D A,C
E,G F,G F,H
A,D A,H E,D
2 alleli in comune
1 allele in comune
0 alleli in comune
25%
50%
25%
40%
55%
5%
Si basano sulla condivisione di alleli di un marcatore da parte di
individui affetti all’interno di una stessa famiglia
IMGSAC:
International Molecular Genetic Study of Autism Consortium
z
z
z
z
Gran Bretagna, Olanda, Danimarca, Germania,
Francia, Italia, U.S.A.
Raccolta di >200 famiglie con almeno 2 fratelli (o
altro tipo di parenti) affetti
Strategia scelta: screening genomico con metodi
non-parametrici
Incertezza su quanto allargare i confini diagnostici
del fenotipo -> criteri di inclusione stringenti
3.5
D16S3102
4
D7S477
D2S2188
IMGSAC Genome scan / 152 sib-pairs
HTTINT2
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
Chromosome number
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
Chromosome 2
5
4.5
markers
4
all sib-pairs (n=152)
strict criteria only
(n=127)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
0.5
1
1.5
2
Morgans
2.5
3
3.5
Problemi negli studi di linkage di malattie complesse
• Difficile stabilire la soglia di significatività
¾ MLS > 3.6?
• Replicazione indipendente dei risultati positivi
¾ Per replicare un risultato positivo è necessario un
campione di famiglie di dimensioni molto maggiori
rispetto al campione originario
• Picchi di linkage molto larghi ed imprecisi rispetto alla
posizione del locus malattia
Summary of genome screen results
IMGSAC
Chr
1p
2q
3p
3q
5q
6q
7p
7q
7q
7q
8q
13q
15q
16p
17p
17q
18q
19q
22q
Xq
PARIS
STANFORD
CLSA
M.SINAI
DUKE
(Risch etal
(Barrett et
(Buxbaum et
(Shao et
(Philippe
2001
1999)
al 1999)
al2001)
al 2002)
1999)
cM MLS
cM MLS
cM MLS cM HLOD cM NPL/GH cM MLS
149 2.15
192
2.39 *
198 1.30
206 3.74 192 0.64
36 1.51
AGRE
(Liu et al
2001)
cM
MLS
FINLAND
(Auranen etal
2002)
cM
HLOD
149
2.63
190
4.31
170
3.04(B)
117
2.16(B)
52
1.89
45 2.55(B)
109
2.23
42
120 3.20
23 2.93
125
32
21
0.83
1.01
138
0.93
55
0.68
1.1
0.74
104
150
2.2
0.8
55
32
3.00
0.54
128
1.7
123 1.02*
165 2.13*
1.66(B)
20 1.91
11
1.21
45 2.34
94
41
0.62
1.37
100
1.00
59
1.2
52 2.46
60
2.5
82 2.67
cM: position in Kosambi centiMorgans based on the Genethon linkage map; * results from follow-up studies
Convergenza dei risultati di linkage sul crom. 7
The shaded bars represent the
linkage findings of different
research groups.
Dagli studi di linkage all’identificazione dei geni di suscettibiltà…
E’ probabile la presenza di fattori genetici di rischio per l’autismo sui cromosomi 2, 7,
16, 17, 15, …
Esame più in dettaglio delle regioni cromosomiche identificate:
sono molto ampie e contengono centinaia di geni: ciascuno di essi potrebbe essere il
responsabile
¾Aumentare
il numero di famiglie studiate
Analisi combinata dei dati di diversi gruppi di ricerca
¾Studio
regioni
di individui affetti con anomalie cromosomiche che coinvolgono queste
¾Studio
di geni candidati
¾Studi di associazione allelica / Linkage disequilibrium
mapping
Studi di associazione allelica
Casi-controlli
Transmission Disequilibrium Test
TDT
Alleli dei genitori:
Trasmessi -> A C
Non trasmessi -> B D
AB
CD
AC
Studio se un particolare allele è più
frequente nei casi rispetto ai
controlli, scelti dalla stessa
popolazione
Studio se un particolare allele è
trasmesso dai genitori al figlio
affetto più frequentemente del 50%
Cause di associazione allelica
1.
Effetto diretto della variante
genetica sul fenotipo
2. Linkage disequilibrium
(dovuto alla vicinanza di due
loci sul cromosoma)
marcatore
3. Associazioni “spurie” dovute a
diversi eventi: per es.
presenza di stratificazione
nella popolazione
Linkage
Allele di suscettibilità
Associazione
Linkage Disequilibrium
LD = associazione non casuale degli alleli appartenenti a
due loci vicini fra loro sul cromosoma
A
a
A
a
B
b
b
B
D = f(AB) - f(A) x f(B)
D’ = |D |
Dmax
Linkage Disequilibrium
K1
J1
I1
H1 Mutazione
G1
N -> D
N
F1
E1
D1
C1
B1
A1
K1
J1
I1
H1
10
G1 generaz.
D
F1
E1
D1
C1
B1
A1
K2
J2
I2
H1
90
G1 generaz.
D
F1
E1
D1
C2
B2
A2
K1
J1
I1
H1
G1
D
F1
E1
D1
C1
B1
A1
In una popolazione il LD decresce in funzione del num di generazioni (t) e della
frazione di ricombinazione (r)
Pattern di LD lungo il genoma è variabile e complesso e influenzato da un
insieme di fattori demografici, molecolari ed evolutivi. Ancora oggetto di studio
Geni candidati
Geni candidati
Che tipo di geni possono essere coinvolti nell’autismo?
Geni che sono attivi nel cervello
Geni coinvolti nello sviluppo del cervello, nella migrazione neuronale, nel
metabolismo dei neurotrasmettitori…
Attualmente diversi gruppi di ricerca stanno esaminando alcuni di questi
geni per identificare varianti della sequenza di DNA che costituiscano
dei fattori di rischio per l’autismo
METODO:
•Screening di varianti di sequenza in individui affetti (DHPLC)
•Test delle varianti identificate:
•Casi-controlli
•TDT
DHPLC
DNA sample is heated and cooled, but by cooling slowly under optimal hybridization conditions, both
homoduplex and heteroduplex PCR products will form. The sample is then run through a high
permformance liquid chromatography (HPLC) system, and OD260 peaks are resolved as they are eluted
from the column under gradient conditions.
Geni candidati analizzati da IMGSAC
A. NEURONAL DEVELOPMENT
C. BRAIN INVOLVEMENT
Chromosome 2
CAMP-GEFII
Chromosome 2
CHN1
HOXD1
Chromosome 7
NCAM
RELN
VGF
LAMB1
LRNN1
PTPRZ1
WNT2 & WNT16
cAMP-regulated guanine nucleotide
exchange factor
Homeo box D1
Neuronal cell adhesion molecule
Reelin
Nerve growth factor inducible
Laminin beta-1 chain precursor
Leucine-rich repeat protein, neuronal 1
Protein tyrosine phosphatase receptortype Z, polypeptide 1
Wingless-type MMTV integration site
family members 2 and 16
GAD1
Chromosome 7
CHRM2
COPG2
SRPK2
SYPL
GRM8
KCND2
B. TRANSCRIPTION FACTORS
Chromosome 16
A2BP1
ABAT
Chromosome 2
ATF2
Activating transcription factor 2
CREBBP
GRIN2A
DLX1 & DLX2
NEUROD1
Distal-less homeobox genes 1 & 2
Neurogenic differentiation 1
KIAA1243
TBR1
Chromosome 7
CUTL1
DLX5 & DLX6
FOXP2
Chromosome 16
TBX6
UBN1
T-box, brain, 1
Chromosome 2
FRZB
CED-6
Chromosome 7
CPA1 & CPA5
MEST
Chromosome 16
BFAR
EMP2
SSTR5
Cut-like 1
Distal-less homeobox genes 5 & 6
Forkhead box P2
T-box 6
Ubinuclein 1
Chimerin 1
Glutamate decarboxylase 1 (brain, 67kDa)
Cholinergic receptor, muscarinic 2
Coatamer protein complex, subunit gamma 2
Serine/Arginine rich protein kinase 2
Synaptophysin-like protein
Glutamate receptor, metabotropic 8
Potassium voltage-gated channel, Shalrelated subfamily, member 2
Ataxin 2-binding protein
4-Aminobutyrate aminotransferase
CREB binding protein
Glutamate receptor, ionotropic, N-methyl Daspartate 2A
KIAA1243 protein
D. HOUSEKEEPING
Frizzled-related protein
CED-6 protein
Carboxypeptidase isoform 1 & 5
Mesoderm specific transcript homolog
Bifunctional apoptosis regulator
Epithelial membrane protein 2
Somatostatin receptor 5
Reelin
Ruolo fondamentale nella regolazione della migrazione di diversi tipi
di neuroni durante lo sviluppo del cervello. Espressa anche nel cervello
adulto, dove puo’ avere un ruolo nella plasticità sinaptica
Topi reeler (reln-/reln-):
sintomi neurologici (atassia, tremore) e
alterazioni citoarchitettoniche in diverse aree del
cervello (corteccia, ippocampo e cervelletto)
simili a quelle descritti in studi post-mortem di
indiv. autistici
Topi eterozigoti reeler (reln-/+): deficit in alcuni
test comportamentali; ridotta densità spine
dendridiche, deficit di GAD67, riduzione postnatale del num di cell Purkinje solo nei maschi
Nell’uomo: mutazioni recessive causano
lissencefalia
Reelin
5’UTR
3’UTR
AAAAAA
(GGC)n
F-spondin-like
Ex25
I
II
Ex35
III
IV
Ex44
V
m R NA
Ex51
VI
VII
VIII
charged C-terminus
protein
Reelin domain
9IMGSAC families (Bonora et al, Mol Psych 2003)
Ex 25 N1159K
Ex 35 V1762I
Ex 35 V1762I
Ex 44 R2290H
Ex 51 T2718A
9Trinucleotide (GGC): trasmissione preferenziale degli alleli ‘lunghi’
(Persico et al, 2001)
The search for susceptibility genes…
Conclusioni e prospettive
¾Progressi nell’identificazione di regioni cromosomiche dove sono
probabilmente localizzati fattori genetici di rischio per i disturbi dello
spettro autistico
¾La complessità genetica ha reso difficile l’identificazione di geni. Fino ad
oggi, un significativo coinvolgimento nell’autismo non è stato ancora
dimostrato per nessun gene
•Meta-analisi
•Studio del ‘broader phenotype’ nei parenti di individui affetti
L’identificazione di fattori genetici di rischio:
• Permetterà di comprendere i meccanismi patofisiologici alla base dei disturbi dello
•
•
spettro autistico e dei fattori che ne influenzano l’espressività.
Permetterà l’identificazione di target per interventi farmacologici
Costiturà la base per lo sviluppo di nuovi approcci di diagnosi ed intervento, e
forse anche di prevenzione e cura.
Acknowledgements
Wellcome Trust Centre for
Human Genetics - Oxford
Janine Lamb
Gabrielle Cooke
Elena Bonora
Angela Marlow
Anthony Monaco
Dipartimento di Biologia Evol. Sper.
Bologna
Francesca Blasi
Elena Bacchelli
Elena Maestrini
Department of Psychiatry, University of Oxford
Anthony Bailey
THE INTERNATIONAL MOLECULAR GENETIC STUDY OF AUTISM
CONSORTIUM
http://www.well.ox.ac.uk/~maestrin/iat.html
