UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PERUGIA
FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA
Centro di Studio del Cavallo Sportivo
“Applicazione della biologia molecolare nella
valutazione del benessere del cavallo”
Andrea Verini Supplizi
Definizione di benessere animale
Stato dell’animale in relazione ai tentativi di far fronte
al proprio ambiente”
Broom (1986)
I fallimenti e le difficoltà nel rapportarsi al proprio ambiente sono
indicatori di scarso benessere
Tra questi menzioniamo :
- la ridotta aspettativa di vita
- il peggioramento della crescita e delle funzioni riproduttive
- la presenza di traumi e ferite
- la maggiore suscettibilità alle malattie
- i comportamenti anomali.
Nel cavallo sportivo un esercizio eccessivo
in fase di allenamento e durante la
competizione può portare all’insorgenza di
numerosi problemi
E’ indispensabile quindi, conoscere le modificazioni
funzionali indotte nell’organismo dall’esercizio
Alcune sono note ma non del tutto chiariti restano i meccanismi
molecolari
La conoscenza di tali meccanismi potrebbe essere
utilizzata
per ottenere migliori
prestazioni
salvaguardando l’integrità dell’ animale.
Approcci per l’analisi
molecolare del benessere
animale
Gemomica funzionale
(Espressione genica)
Proteomica
(Profili proteici)
Metabolomica
(Profili Metabolici)
Analisi dell’espressione genica:
tecniche basate sull’ibridazione
tecniche basate sulla PCR
tecniche basate sul sequenziamento
I VANTAGGI DELLA TECNICA
cDNA-AFLP
• permette l’utilizzo di una piccola quantità di RNA e la comparazione
simultanea di diversi campioni
• non è limitata dall’informazione sulla sequenza del gene
• ridotto numero di falsi positivi rispetto ad altre tecniche di RNA
fingerprinting
• permette di avere una corrispondenza tra la quantità di mRNA presente
nel pool originario
e l’intensità delle bande presenti nel gel di
poliacrilammide
OBIETTIVI
IERI e OGGI
Ottimizzare la tecnica del cDNA-AFLP RNA-fingerprinting
Analizzare i profili trascrizionali di cavalli da endurance in differenti
condizioni di stress
Individuare e sequenziare interi cDNA di geni coinvolti nella risposta
allo stress
FUTURO?
- Individuazione di geni candidati
- Selezione assistita da marcatori
molecolari
- Prevenzione della sindrome da
overtraining su base molecolare
Sperimentazione
Cavalli da endurance sottoposti a diversi carichi di lavoro
Allenamento su treadmill
Gara di Endurance
TREADMILL
Competition Exercise Test modificato da Rueca e coll. (CETm)
Fase
Andatura
Velocità (m/s)
Tempo (min)
Distanza (m)
Inclinazione (°)
1
Passo
1,7
6
612
3
2
Trotto
3,7
7
1554
3
3
Galoppo
10,7
2
1284
3
4
Trotto
3,7
14
3108
3
5
Passo
1,7
6
612
3
6
Canter
9,2
5
2760
3
7
Passo
1,7
20
2040
0
Passo
Galoppo
Prelievi
Basale
Canter
60’
24h
48h
= cavallo a riposo, prima dell’esercizio
= dopo il canter
= 60’ dopo la fine del test
= 24h dopo la fine del test
= 48h dopo la fine del test
GARA DI ENDURANCE (160 KM )
Prelievi
Basale = cavallo a riposo prima della gara;
Arrivo = subito dopo la gara;
24h
= 24h dopo la fine della competizione;
48h
= 48 dopo la fine della competizione;
cDNA-AFLP
cDNA-AFLP
Estrazione RNA ed isolamento dell’mRNA
Retrotrascrizione dell’ mRNA a cDNA
Digestione con 2 enzimi di restrizione e ligazione adattatori
Amplificazioni selettive dei frammenti
PAGE di prodotti ottenuti
A
B
1 2 3 4 5 12 34 5
Gel elettroforesi cDNA-AFLP
da linfociti di cavalli sottoposti ad esercizio su treadmill:
(1) basale; (2) canter; (3) 60’; (4) 24h; (5) 48h.
Trascritto risultato omologo alla prostaglandina GH-sintetasi
2 di cavallo
RISULTATI TREADMILL
2 TRASCRITTI MODULATI CON 16 COMBINAZIONI DI PRIMERS
B
C
60
24
48
Gene umano (SIAH2) omologo a
seven in absentia (sina) di Drosophila
(n. accesso: gi15341819|gb|BC013082.1|BC013082)
B
C
60
24
48
Prostaglandina G/H-sintetasi 2
(n. accesso: gi|2586066|gb|AF027334.1|AF027334)
Data Base of National Center for Biotechnology Information, allineamento
ottenuto tramite BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
RISULTATI DELLA GARA DI ENDURANCE
92 TRASCRITTI MODULATI CON 55 COMBINAZIONI DI PRIMERS
N. 55 FRAMMENTI CLONATI E SEQUENZIATI
N. 12 cloni non hanno trovato similarità con sequenze presenti in banca dati
N. 19 cloni sovrapponibili a sequenze umane di cui non si conosce la funzione
N. 2 cloni hanno trovato similarità con fattori trascrizionali umani
N. 2 cloni hanno trovato similarità con sequenze di cavallo non significative
N. 8 cloni hanno trovato similarità con sequenze significative di altri mammiferi
N. 12 cloni sovrapponibili a SINE o LINE (Short o Long Interspersed Nucleotidic
Element)
RT-PCR e RACE-PCR
•Verifica dell’andamento dell’espressione individuata
con i cDNA-AFLP tramite reverse transcriptasepolimerase chain reaction (RT-PCR)
•Isolamento dell’intero cDNA tramite rapid
amplifications of cDNA ends (RACE-PCR)
RT-PCR
• L’RT-PCR è una amplificazione dell’mRNA che si
vuole retrotrascivere a cDNA utilizzando primers
specifici del gene in esame. L
•L’ RT-PCR ha confermato il profilo di espressione
del cDNA-AFLP del gene RBBP
RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
Tale metodica può essere utilizzata per ottenere DNA
complementari (cDNA) completi del gene di interesse
La conoscenza della sequenza interna permette la
produzione di primer gene specifici (GSP) per la sintesi
ed amplificazione dell’intero cDNA
Porzione cDNA isolato
CONCLUSIONI
• La tecnica cDNA-AFLP può essere usata con successo nello studio della
espressione genica in cavalli sottoposti a condizioni stressanti
• La RACE ci ha permesso di clonare l’intero cDNA per i geni di
IL-8
RBBP
HSP90
EIF4G3
• Ricerche sono in corso per individuare altri geni coinvolti
nella risposta allo stress e per confermare in risultati
ottenuti
