Northern blotting RNA isolation Probe labeling AAAAAA dCTP dGTP dTTP dATP pBS-SemaIII Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography reverse Northern blotting Northern reverse Northern specific probes * * labeled target cDNA arrays (continued) • macro-arrays – low-density – filter-supported – radioactive probes (duplicates) – low sensitivity – only cDNA clones spotted – cheap cDNA arrays (continued) • micro-arrays – high-density – glass-supported – fluorescent probes (single slide) – high sensitivity – ability to spot oligonucleotides – very expensive Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia. I microarrays Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene. Microarray technology Probes Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking” http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti. E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni. Arrays Probe DNAs are “spotted” onto a glass slide Each spot corresponds to a particular gene e.g. β-actin Each array will have thousands of spots (typically 3000 to 30000) reference test RNA is extracted from tissues Targets mRNA cDNA or cells RNA is copied to DNA labelled DNA is fluorescently labelled pooled Samples are pooled Hybridisation Labelled target DNA hybridised to array Fluorescence of each spot indicates how much of particular RNA was present in both samples Hybridised Array Data Processing Further analysis Scanner Images Normalised Ratios Normalisation Spot-finding Ratios Cy3 Cy5 test reference Cy3 Cy5 Spot-finding (1) Software identifies grid of spots and maps individual spot locations Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare Conversione in cDNA Marcatura con 2 fluorocromi diversi Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi (1) (2) (3) (6) Immagine a colori raffigurante il microarray Eccitazione della fluorescenza tramite laser Riconoscimento (4) tra i cDNA provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray (5) STUDIO DEI PROMOTORI: siti di legame dei fattori di trascrizione EMSA Trans Factor Methods: EMSA Trans Factor Methods: EMSA Electromobility “Shift” Trans Factor Methods: Consensus Sequence Capture Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine anticorpo Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine • Competizione con stesso sito, sito analogo, sito mutato • Identificazione dei fattori coinvolti tramite “supershift” con anticorpi Lodish Figure 10-7 Il footprint con DNasi I permette di localizzare il sito di interazione tra proteina e DNA Lodish Figure 10-6