10 Isolamento genico (25)

TECNICHE DI BIOLOGIA
MOLECOLARE:
Isolamento di Geni ed Analisi
dell’espressione genica
c
o
r
s
formazione GenHORT
c
o
r
s
formazione GenHORT
c
o
r
s
formazione GenHORT
c
o
r
s
formazione GenHORT
GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI
c
o
r
s
formazione GenHORT
Materiale di partenza: quesito biologico
Confrontare il pattern di espressione di :
differenti
tissuti
differenti
Stadi di sviluppo
stress vs controllo
Sensibile vs tollerante
Confrontare il corredo genico di differenti specie, varietà,
tessuti, stadi di sviluppo e molti altri confronti!!
c
o
r
s
formazione GenHORT
TECNICHE DI ISOLAMENTO E ANALISI DI
GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI
Differential Screening
Subtractive Screening
•SSH
Differential Display
•DDRT-PCR
•AFLP-cDNA
RT-PCR
• RT-PCR
• qRT-PCR
Microarray
c
o
r
s
formazione GenHORT
• cDNA
• OligoArray
and MANY OTHERs (SAGE, MPSS, mRNA-SEQ, etc.)
ISOLAMENTO/IDENTIFICAZIONE DI GENI CANDIDATI e/o
ANALISI DELL’ ESPRESSIONE GENICA/TRASCRITTOMICA
STRESS
• Northern analysis
• RT-PCR/qRT-PCR
•Subtractive hybridazation
•In situ hybridazation
RNA
fingerprinting
c
o
r
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formazione GenHORT
• DDRT-PCR
• cDNA-AFLP
RNA
RNA
cDNA
cDNA
METODI DI
ANALISI
Diretti
•Strategie EST
•SAGE (Serial analysis gene expression)
•MPSS (massively parallel signature sequencing)
•mRNA-SEQ
Indiretti
•Oligo-Chips
•cDNA microarray
PROCEDURA GENERALE
RNA extraction
c
o
r
s
formazione GenHORT
DDRT-PCR
mRNA o
total RNA
DNA free
cDNA-AFLP
AAAAAn
cDNA synthesis
Oligo dT+N
AAAAn
TTTTn
mRNA o
total RNA
DNA free
AAAAAn
cDNA synthesis
AAAAn
TTTTn
DNA polymerase I
Digestion
1 cycle PCR
NNNNNNN
Oligo dT+N
+
arbitrarily primer
2 enzimi di
restrizione
Ligation
adapters
PCR
amplification
NNNNNNN
AAAAn
TTTTn
AAAAn
TTTTn
AAAAn
TTTTn
Preamplification
N
2 primer+N
N
Selective amplification
NNN
NNN
c
o
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formazione GenHORT
Gel acrilamide
2 primer+NNN
c
o
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formazione GenHORT
Gel acrilamide
•Dry
•Esposizione su lastra
autoradiografica/
scanning fluorescenza
•Sviluppo/analisi
Control
c
o
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Test
DDRT-PCR
cDNA-AFLP
3 basi selettive
2 basi selettive
bp
587
540
504
458
234
c
o
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formazione GenHORT
•Eluizione banda
•PCR II round
-stessi primer pcr I round
-no radioattivo / fluorescenza
-stesse condizioni pcr
•Corsa su gel agarosio / purificazione
Analisi Northern
Sequenziamento
Analisi banca dati
Disegno primer
c
o
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formazione GenHORT
Conferma espressione
differenziale
RT-PCR
Array
•Bioinformatica: omologia di sequenza
•Clonaggio
•Trasformazione piante
•Analisi dell’espressione nelle piante trasformate
•Analisi della tolleranza allo stress
•Ruolo funzionale del gene => utilizzazione di
collezioni di mutanti (inserzioni nel clone/gene)
=> analisi fenotipo
c
o
r
s
formazione GenHORT
Microarray
Permettono
l’analisi
dell’espressione genica
di migliaia di geni
simultaneamente
c
o
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formazione GenHORT
c
o
r
s
formazione GenHORT
Images : examples
Pseudo-colour overlay
Cy3
Cy5
c
o
r
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formazione GenHORT
Spot colour
Signal strength
Gene expression
yellow
Control = perturbed
unchanged
red
Control < perturbed
induced
green
Control > perturbed
repressed
c
o
r
s
formazione GenHORT
Interpretazione dei risultati
i microarray sono il punto di partenza per successivi studi funzionali
•
•
•
Validazione dei risultati (di tutti o di una parte ottenuti con altre
tecniche di laboratorio)
Ricerca bibliografica sulle possibili implicazioni funzionali e
interazioni geniche dei trascritti sregolati
Studio delle proteine associate ai trascritti identificati
differenzialmente espressi
c
o
r
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formazione GenHORT
In silico analysis
Information available
in the literature and
in public or private
expression database
Confermation
of results
Laborarory- based
analysis
RT-PCR
Northern blot
Real-time PCR
Hybridization in situ
Using same RNA of microarray esp.
c
o
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formazione GenHORT
• Analisi d’espressione per singolo gene
• Bisogna conoscere la sequenza di DNA
Northern blotting
RT-PCR
qRT-PCR
Constitutive/housekeeping gene:
• rRNA
• Ef1alfa
• Actin
c
o
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formazione GenHORT
RT-PCR
# of PCR cycles
0
cDNA Log diluition
- 30 cycles-
c
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formazione GenHORT
5
10 15
20 25 30
35
40
qRT-PCR
• Rapidità
• Sensibilità
• Specificità
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formazione GenHORT
• Quantitativa
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formazione GenHORT