TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE: Isolamento di Geni ed Analisi dell’espressione genica c o r s formazione GenHORT c o r s formazione GenHORT c o r s formazione GenHORT c o r s formazione GenHORT GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI c o r s formazione GenHORT Materiale di partenza: quesito biologico Confrontare il pattern di espressione di : differenti tissuti differenti Stadi di sviluppo stress vs controllo Sensibile vs tollerante Confrontare il corredo genico di differenti specie, varietà, tessuti, stadi di sviluppo e molti altri confronti!! c o r s formazione GenHORT TECNICHE DI ISOLAMENTO E ANALISI DI GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI Differential Screening Subtractive Screening •SSH Differential Display •DDRT-PCR •AFLP-cDNA RT-PCR • RT-PCR • qRT-PCR Microarray c o r s formazione GenHORT • cDNA • OligoArray and MANY OTHERs (SAGE, MPSS, mRNA-SEQ, etc.) ISOLAMENTO/IDENTIFICAZIONE DI GENI CANDIDATI e/o ANALISI DELL’ ESPRESSIONE GENICA/TRASCRITTOMICA STRESS • Northern analysis • RT-PCR/qRT-PCR •Subtractive hybridazation •In situ hybridazation RNA fingerprinting c o r s formazione GenHORT • DDRT-PCR • cDNA-AFLP RNA RNA cDNA cDNA METODI DI ANALISI Diretti •Strategie EST •SAGE (Serial analysis gene expression) •MPSS (massively parallel signature sequencing) •mRNA-SEQ Indiretti •Oligo-Chips •cDNA microarray PROCEDURA GENERALE RNA extraction c o r s formazione GenHORT DDRT-PCR mRNA o total RNA DNA free cDNA-AFLP AAAAAn cDNA synthesis Oligo dT+N AAAAn TTTTn mRNA o total RNA DNA free AAAAAn cDNA synthesis AAAAn TTTTn DNA polymerase I Digestion 1 cycle PCR NNNNNNN Oligo dT+N + arbitrarily primer 2 enzimi di restrizione Ligation adapters PCR amplification NNNNNNN AAAAn TTTTn AAAAn TTTTn AAAAn TTTTn Preamplification N 2 primer+N N Selective amplification NNN NNN c o r s formazione GenHORT Gel acrilamide 2 primer+NNN c o r s formazione GenHORT Gel acrilamide •Dry •Esposizione su lastra autoradiografica/ scanning fluorescenza •Sviluppo/analisi Control c o r s formazione GenHORT Test DDRT-PCR cDNA-AFLP 3 basi selettive 2 basi selettive bp 587 540 504 458 234 c o r s formazione GenHORT •Eluizione banda •PCR II round -stessi primer pcr I round -no radioattivo / fluorescenza -stesse condizioni pcr •Corsa su gel agarosio / purificazione Analisi Northern Sequenziamento Analisi banca dati Disegno primer c o r s formazione GenHORT Conferma espressione differenziale RT-PCR Array •Bioinformatica: omologia di sequenza •Clonaggio •Trasformazione piante •Analisi dell’espressione nelle piante trasformate •Analisi della tolleranza allo stress •Ruolo funzionale del gene => utilizzazione di collezioni di mutanti (inserzioni nel clone/gene) => analisi fenotipo c o r s formazione GenHORT Microarray Permettono l’analisi dell’espressione genica di migliaia di geni simultaneamente c o r s formazione GenHORT c o r s formazione GenHORT Images : examples Pseudo-colour overlay Cy3 Cy5 c o r s formazione GenHORT Spot colour Signal strength Gene expression yellow Control = perturbed unchanged red Control < perturbed induced green Control > perturbed repressed c o r s formazione GenHORT Interpretazione dei risultati i microarray sono il punto di partenza per successivi studi funzionali • • • Validazione dei risultati (di tutti o di una parte ottenuti con altre tecniche di laboratorio) Ricerca bibliografica sulle possibili implicazioni funzionali e interazioni geniche dei trascritti sregolati Studio delle proteine associate ai trascritti identificati differenzialmente espressi c o r s formazione GenHORT In silico analysis Information available in the literature and in public or private expression database Confermation of results Laborarory- based analysis RT-PCR Northern blot Real-time PCR Hybridization in situ Using same RNA of microarray esp. c o r s formazione GenHORT • Analisi d’espressione per singolo gene • Bisogna conoscere la sequenza di DNA Northern blotting RT-PCR qRT-PCR Constitutive/housekeeping gene: • rRNA • Ef1alfa • Actin c o r s formazione GenHORT RT-PCR # of PCR cycles 0 cDNA Log diluition - 30 cycles- c o r s formazione GenHORT 5 10 15 20 25 30 35 40 qRT-PCR • Rapidità • Sensibilità • Specificità c o r s formazione GenHORT • Quantitativa c o r s formazione GenHORT