Prevalenza del virus BVD in allevamenti di bovine da latte in

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A.D. Nigrelli et al. Large Animal Review 2009; 15: 195-198
Prevalenza del virus BVD in allevamenti
di bovine da latte in Lombardia e proposta
di un protocollo di eradicazione aziendale
195
N
A.D. NIGRELLI, I. BERTOLETTI, M. BOLDINI, M. FABBI, M. LUINI,
F. PATERLINI, S. FACCINI
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna
RIASSUNTO
Gli Autori hanno verificato la sieroprevalenza del virus BVD in alcune province della Lombardia con un campionamento randomizzato stratificato di 240 aziende. In ciascun allevamento sono stati campionati animali giovani (manze) e animali adulti
(vacche) e testati per anticorpi anti-NS 2/3 di BVDV mediante ELISA. La prevalenza di positività nei gruppi e i valori di D.O.
hanno permesso di valutare la presenza di circolazione attiva di BVDV in 89 allevamenti (37,1%), risposte legate a infezione
pregressa in 108 allevamenti (45,0%) e risposte di probabile origine vaccinale in 7 allevamenti (2,9%). Un altro campionamento ha interessato nel corso di 24 mesi 194 aziende localizzate in due province lombarde, con esami trimestrali del latte di
massa per ricerca di anticorpi in ELISA. La elevata percentuale di “sieroconversioni” (63 su 194 corrispondente al 32,5%)
rinforza l’evidenza della elevata circolazione di BVDV negli allevamenti Lombardi. Il protocollo di eradicazione applicato in
14 aziende si è basato sulla ricerca di BVDV con PCR in pool di sieri di 20 capi su tutto l’effettivo aziendale a partire dai vitelli di un giorno, seguito per 9 mesi dal controllo dei nuovi nati. Nei diversi allevamenti sono stati individuati da un minimo di
1 soggetto ad un massimo di 14 soggetti persistentemente infetti (PI) corrispondenti a percentuali variabili fra lo 0,1% e il
5,8%. La eliminazione dei soggetti PI individuati ha portato in tutti gli allevamenti alla eradicazione dell’infezione documentata con la ripetuta negatività anticorpale di soggetti di 6/8 mesi e dei campioni di latte di massa in PCR.
PAROLE CHIAVE
BVD, monitoraggio, eradicazione.
INTRODUZIONE
All’infezione da virus BVD è attribuito dalla letteratura ma
anche dalla nostra esperienza, un ruolo centrale in diverse
problematiche patologiche dell’allevamento bovino: problemi riproduttivi, patologie polmonari e gastroenteriche, in
cui il virus risulta coinvolto sia direttamente che attraverso
l’attività immunodepressiva che predispone a complicazioni
batteriche, virali e parassitarie. I danni economici che ne derivano sono ingenti7. Fin dai primi anni ’90, definita l’importanza dei soggetti persistentemente infetti (PI) nella trasmissione dell’infezione3,10,18, in diversi Paesi Europei sono
stati predisposti piani di eradicazione14,9,24. In Italia è da tempo attivato un piano di risanamento obbligatorio in Alto
Adige e altri piani volontari locali. L’attuazione di un efficace programma di eradicazione non può che partire da un’accurata analisi della situazione epidemiologica, delle tecniche
d’allevamento e delle eventuali strategie vaccinali applicate
nell’area d’interesse9. Altrettanto importante è l’individuazione dei test diagnostici più appropriati al fine di monitorare la realtà locale26,12. Numerosi infatti sono i metodi analitici disponibili sia per definire l’immunità per BVDv che per
ricercare la presenza del virus stesso. I test sierologici più
sfruttati sono principalmente basati su tecniche ELISA5,11,18 e
di siero-neutralizzazione. Negli animali PI gli anticorpi materni permangono fino a circa 3 mesi d’età23, mentre nei soggetti non PI, gli anticorpi derivanti dal colostro permangono
Autore per la corrispondenza:
Arrigo Nigrelli ([email protected]).
più a lungo, anche fino agli 8 mesi di vita. Circa il 15% dei
soggetti PI sviluppa Ab contro la proteina non strutturale 2
(NS/2) ed una percentuale più bassa contro la glicoproteina
E222. I soggetti immunizzati con vaccini spenti tendenzialmente non sviluppano Ab diretti verso antigeni non strutturali NS2/3, mentre tali Ab sono riscontrabili negli animali
trattati con vaccini vivi o infettati naturalmente8.
Nell’ambito della ricerca della presenza del virus hanno acquisito sempre maggiore importanza i metodi basati su tecniche di biologia molecolare come RT-PCR e Real-Time RTPCR, che oltre ad offrire livelli di sensibilità elevata possono
consentire la genotipizzazione virale1,15,16.
Per uno screening iniziale, al fine di studiare la prevalenza in
una determinata area o classificare lo stato di un’azienda, è
opportuno ricorrere a test rapidi ed economici in grado di
fornire informazioni su numerosi soggetti contemporaneamente. Nel caso di allevamenti bovini da latte, la ricerca di
anticorpi o del virus nel latte di massa ne sono un esempio.
La presenza nel latte di massa di anticorpi specifici per
BVDv è infatti indice della condizione immunologica dei
soggetti in lattazione e la sieroconversione è spesso in relazione alla comparsa di soggetti PI in azienda24. Secondo alcuni autori inoltre, titoli anticorpali elevati indicano un’alta
probabilità di un’esposizione recente o la presenza di uno o
più animali PI20,25, mentre titoli molto bassi indicano una
bassa prevalenza di animali sieropositivi e una probabile assenza di soggetti PI. Secondo altri autori, però, il principio
non è applicabile in realtà in cui è alta la percentuale di soggetti sieropositivi. In quest’ultima situazione sono molto indicate metodiche RT-PCR13 e Real-Time RT-PCR che permettono di dimostrare la presenza del virus nel latte di mas-
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sa e quindi la circolazione attiva tra i soggetti in lattazione.
Sempre ai fini di uno screening iniziale, è dimostrata la validità del cosiddetto “spot test” che consiste nel ricercare la
presenza anticorpi specifici in piccoli gruppi di soggetti giovani, non vaccinati, considerati rappresentativi del gruppo
di appartenenza11,14.
Per identificare i soggetti PI all’interno di un’azienda è necessario sottoporre ad analisi tutti gli animali. Un tipo d’approccio consiste nell’individuare, con tecnica ELISA per la
ricerca di anticorpi specifici, i soggetti sieronegativi per poi
verificare sugli stessi la presenza della viremia2. Si è dimostrata di grande efficacia anche la sistematica ricerca della
presenza di BVDv con RT-PCR o Real-Time RT-PCR nel
sangue di tutti i capi di un allevamento raggruppati a pool,
seguita, in caso di positività, dall’analisi dei singoli componenti mediante ELISA (nei soggetti con più di tre mesi o
privati del colostro) o nuovamente con PCR e dalla successiva verifica del permanere della viremia a distanza di almeno tre settimane22.
L’elevata sensibilità delle tecniche di biologia molecolare
consente di lavorare anche con pool molto numerosi. Considerando però la necessità di individuare e monitorare i singoli soggetti viremici e volendo contenere i costi risulta opportuno testare pool di 20 o 30 campioni per volta27.
Il lavoro che segue offre un esempio di monitoraggio degli
allevamenti da latte di sette province della Lombardia, attraverso l’applicazione di diverse tecniche diagnostiche, allo
scopo di conoscere la prevalenza dell’infezione da virus BVD
sia pregressa che attiva al momento dello studio.
Si è ritenuto utile, inoltre, approfondire la probabilità di infettarsi che può avere un allevamento situato in zone ad elevata densità di allevamenti bovini (province di Lodi e Mantova) in un periodo di tempo di due anni. Non ultimo è valutata l’efficacia di un protocollo di identificazione ed eliminazione dei soggetti PI applicando approcci diagnostici appropriati sia per il monitoraggio delle aziende che per l’individuazione di animali persistentemente infetti.
do che tale valore risulti proporzionale al livello anticorpale
dei soggetti. Contemporaneamente al prelievo dei campioni
di sangue è stato prelevato un campione di latte di massa, ripetuto a distanza di 2 mesi, per la ricerca diretta del virus
BVD mediante RT-PCR15 o Realtime RT-PCR16. Sulla base
della DO riscontrata nei sieri in esame (valore medio dei
campioni di ciascuna azienda), della percentuale dei soggetti sieropositivi in ciascun gruppo (manze e vacche) e dei test
PCR per la ricerca del virus nel latte di massa, è stata adottata la chiave interpretativa, riportata in Tabella 1.
Sieroconversioni da virus BVD nell’arco di
24 mesi Sono state scelte in modo randomizzato 194
aziende di bovine da latte situate nelle province di Mantova
e di Lodi, il cui latte di massa era risultato negativo per la
presenza di anticorpi anti NS 2-3, all’inizio dello studio. Gli
stessi allevamenti sono stati ritestati con lo stesso metodo
ELISA sul latte di massa dopo 24 mesi. Il rilievo di sieroconversione è stato interpretato come nuova infezione nella
mandria in lattazione, di provenienza esterna o da parte della rimonta interna.
Modalità operative per l’eradicazione del virus BVD In 14 aziende con circolazione attiva di virus
BVD è stato attuato il seguente protocollo di eradicazione:
1) Prelievo di sangue su tutti i soggetti presenti da un giorno di vita in avanti. 2) Ricerca del virus con RT-PCR o RTPCR Realtime su pool di 20 sieri omogenei per età; in caso
di positività del pool sono stati esaminati i singoli campioni
per identificare il soggetto viremico. 3) Isolamento del soggetto viremico e secondo test dopo 45 giorni; nel caso di
conferma della positività, eliminazione del soggetto. 4) Nei
9 mesi seguenti l’eliminazione del soggetto PI, test di tutti i
soggetti neonati testati al fine di identificare nuovi capi PI.
5) Controllo trimestrale del latte di massa con RT-PCR o
RT-PCR Real-Time per la ricerca del virus BVD e del sangue
di soggetti di 6-8 mesi di età per la ricerca di anticorpi verso le proteine NS2-3, al fine di verificare l’assenza di circolazione del virus.
MATERIALI E METODI
Valutazione della prevalenza dell’infezione da
virus BVD Gli allevamenti sono stati scelti secondo un
RISULTATI
campionamento randomizzato stratificato, proporzionale al
numero di aziende presenti nelle varie province considerate,
ipotizzando una stima della circolazione attiva del virus intorno al 20%, con un indice di confidenza del 95% ed un errore del 5%. In base a questo criterio le aziende considerate
sono risultate numericamente così ripartite: Bergamo (66),
Cremona (34), Lecco (12), Lodi (14), Mantova (54), Pavia
(14), Sondrio (46). Nelle suddette aziende sono state raccolte informazioni sull’utilizzo e sulla tipologia di eventuali piani vaccinali e vaccini utilizzati.
Risultati della ricerca della
circolazione attiva e passiva di BVD
virus negli allevamenti studiati
Ricerca degli allevamenti con circolazione attiva o pregressa Nelle aziende oggetto dello studio so-
no stati prelevati 14-16 campioni di sangue su manze e altrettante vacche adulte che sono stati testati con metodica
Elisa per la ricerca di Ab nei confronti delle proteine NS 2-3
(metodo interno IZSLER). Il valore in Densità Ottica (DO)
ottenuto è stato classificato come basso (valori >0,2<0,6), intermedio (valori >0,6<1,2) o elevato (valori >1,2) assumen-
La chiave interpretativa riportata in Tabella 1 ha portato ad
una suddivisione delle aziende testate per la presenza attiva o
pregressa riportata in Tabella 2.
Sieroconversioni nell’arco di 24 mesi Dei 194
allevamenti sieronegativi all’inizio dello studio, 63 (32,5%)
hanno presentato la comparsa di anticorpi verso proteine
non strutturali 2-3 del virus BVD, dei quali 35 su 69 della
provincia di Lodi (50,1%) e 34 su 125 della provincia di
Mantova (22,4%).
Protocollo per l’eradicazione aziendale dell’infezione da BVD I risultati dell’applicazione del
protocollo per l’identificazione dei soggetti persistentemente
infetti in una mandria e per l’eradicazione aziendale del virus BVD applicati in 14 aziende sono riportati in Tabella 3.
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Tabella 1 - Modalità interpretativa dei risultati dei test effettuati per l’identificazione degli allevamenti infetti.
% positività Vacche
% positività Manze
PCR Latte di Massa
Circolazione virale
Nessuna
Nessuna
Non eseguita
Assente
Variabile
Nessuna
Negativa
Pregressa in assenza di interferenze vaccinali
Variabile (OD bassa)
Variabile (OD bassa)
Negativa
Pregressa in presenza di interferenze vaccinali
Variabile
Variabile (OD elevata)
Negativa
Attiva
Variabile
Variabile
Positiva
Attiva
Tabella 2 - Numero di allevamenti considerati per ciascuna provincia e determinazione dello stato di infezione e di circolazione virale.
Allevamenti considerati
Allevamenti con infezione attiva o pregressa
Allevamenti non infetti
Provincia
N. allevamenti
Pregressa
Attiva
Totale (%)
Assente
Titoli vaccinali
Bergamo
66
27
30
57 (86,4)
5
4
Lodi
14
4
5
9 (64,3)
2
3
Mantova
54
23
18
41 (75,9)
13
–
Pavia
14
8
2
10 (71,4)
4
–
Sondrio
46
27
11
38 (82,6)
8
–
Lecco
12
8
2
10 (83,3)
2
–
Cremona
34
11
21
32 (94,1)
2
–
Totale
240
108 (45,0%)
89 (37,1%)
197 (82,1)
36 (15%)
7 (2,9%)
Tabella 3 - Numero di soggetti persistentemente infetti (PI) individuati nelle 14 aziende sottoposte ad eradicazione al primo controllo, al secondo controllo dopo 9 mesi ed evidenza di circolazione virale attiva dopo il secondo controllo.
Azienda
Capi
presenti
N. PI primo
controllo
1
242
3
2
600
13
3
345
4
4
270
4
5
290
6
352
7
8
N. PI dopo
9 mesi
% PI individuati
Circolazione virale attiva
dopo il
0
0,1
NO
1
2,3
NO
0
1,2
NO
0
1,5
NO
5
0
1,7
NO
3
0
0,8
NO
178
3
0
1,7
NO
113
5
0
4,4
NO
9
190
10
1
5,8
NO
10
647
2
0
0,3
NO
11
171
7
0
4,1
NO
12
1522
6
1
0,5
NO
13
71
1
0
1,4
NO
14
106
2
0
1,9
NO
TOT.
5097
68
3
1,4
-
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
La prevalenza dell’infezione da BVD virus è risultata elevata
sia in forma di circolazione attiva che pregressa nelle province lombarde considerate, il che conferma la sua notevole diffusione già documentata in precedenza da altri autori6,17. Relativamente sorprendente è risultato il tasso di infezione nei
24 mesi considerati dimostrato attraverso l’evidenza di sieroconversione sul latte di massa in oltre il 30% degli allevamenti considerati, la cui percentuale risulta significativamente superiore in provincia di Lodi (p = 0,001). La spiegazione potrebbe risiedere nella maggiore consistenza media
degli allevamenti del lodigiano rispetto a quelli del mantovano, oppure nel maggior numero di spostamenti di animali
fra le aziende in compravendita, due tra i principali fattori di
rischio per la diffusione dell’infezione da BVD17,21. Lo studio
ha dimostrato la validità del metodo utilizzato, per valutare
la circolazione attiva del virus BVD in un’azienda, fornendo
uno strumento puntuale per effettuare le scelte più opportune di intervento vaccinale e/o di ricerca ed eliminazione degli eventuali soggetti persistentemente infetti. In particolare i
metodi di PCR applicati su pool di 20 sieri hanno consentito in tutti gli allevamenti sottoposti al programma di eradicazione, di individuare tutti i soggetti persistentemente in-
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fetti azzerando la circolazione attiva del virus. Anche se in alcune aziende il numero di persistentemente infetti individuati è risultato particolarmente elevato (fino al 5,8% dei capi presenti), la media è assolutamente in linea con altre ricerche svolte in Italia e negli altri paesi4,6. Analogamente a
quanto evidenziato anche nell’ambito dei programmi d’eradicazione degli altri paesi europei19, il nostro lavoro evidenzia la necessità di miglioramento del livello di biosicurezza
negli allevamenti bovini, specialmente in quelli da riproduzione, poiché l’ingresso del virus BVD nella mandria comporta il rischio di infezione di bovine gravide e il conseguente rischio di nascita di soggetti persistentemente infetti che
perpetuano l’infezione in allevamento.
Ricerche eseguite con finanziamento Ministero della Salute –
Ricerca Corrente 2005.
❚ Prevalence of BVDV infection
in dairy cattle in Lombardy
and proposal of a farm eradication
program
SUMMARY
The authors have verified the seroprevalence of BVDV in a
stratified random sample of 240 cattle farms in some
provinces of Lombardy. In each herd, young (heifers) and
adult (cows) animals were sampled and tested for antibodies to BVDV NS 2-3 by ELISA. The prevalence of positivity
in groups and the observed ODs allowed to assess: (i) the
presence of active circulation of BVDV in 89 herds (37.1%),
(ii) responses related to prior infection in 108 herds (45.0%)
and (iii) responses probably related to the use of vaccine in 7
herds (2.9%). Another sampling involved 194 farms located
in two provinces of Lombardy in the course of 24 months,
with quarterly examinations of the tank bulk milk antibodies by ELISA. The high percentage of “seroconversion” (63 of
194 corresponding to 32.5%) strongly suggests the evidence
for an high circulation of BVDV among herds in Lombardy. The eradication protocol applied in 14 farms was
based on the research of BVDV by PCR of pools of 20 sera
to cover the whole herd from one day old calves. Moreover
all new-born calves were tested by PCR during the 9 following months. A minimum of 1 to a maximum of 14 (0.1% to
5.8%) persistently infected (PI) animals were identified in
the controlled farms. The elimination of PI subjects identified in all herds led to eradication of infection. This was
documented by repeated negative antibody response in 6/8
months old subjects and by PCR on the bulk milk samples.
KEY WORDS
BVD, survey, eradication.
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