1_Nigrelli_imp_OK autore 16-10-2009 9:12 Pagina 195 A.D. Nigrelli et al. Large Animal Review 2009; 15: 195-198 Prevalenza del virus BVD in allevamenti di bovine da latte in Lombardia e proposta di un protocollo di eradicazione aziendale 195 N A.D. NIGRELLI, I. BERTOLETTI, M. BOLDINI, M. FABBI, M. LUINI, F. PATERLINI, S. FACCINI Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna RIASSUNTO Gli Autori hanno verificato la sieroprevalenza del virus BVD in alcune province della Lombardia con un campionamento randomizzato stratificato di 240 aziende. In ciascun allevamento sono stati campionati animali giovani (manze) e animali adulti (vacche) e testati per anticorpi anti-NS 2/3 di BVDV mediante ELISA. La prevalenza di positività nei gruppi e i valori di D.O. hanno permesso di valutare la presenza di circolazione attiva di BVDV in 89 allevamenti (37,1%), risposte legate a infezione pregressa in 108 allevamenti (45,0%) e risposte di probabile origine vaccinale in 7 allevamenti (2,9%). Un altro campionamento ha interessato nel corso di 24 mesi 194 aziende localizzate in due province lombarde, con esami trimestrali del latte di massa per ricerca di anticorpi in ELISA. La elevata percentuale di “sieroconversioni” (63 su 194 corrispondente al 32,5%) rinforza l’evidenza della elevata circolazione di BVDV negli allevamenti Lombardi. Il protocollo di eradicazione applicato in 14 aziende si è basato sulla ricerca di BVDV con PCR in pool di sieri di 20 capi su tutto l’effettivo aziendale a partire dai vitelli di un giorno, seguito per 9 mesi dal controllo dei nuovi nati. Nei diversi allevamenti sono stati individuati da un minimo di 1 soggetto ad un massimo di 14 soggetti persistentemente infetti (PI) corrispondenti a percentuali variabili fra lo 0,1% e il 5,8%. La eliminazione dei soggetti PI individuati ha portato in tutti gli allevamenti alla eradicazione dell’infezione documentata con la ripetuta negatività anticorpale di soggetti di 6/8 mesi e dei campioni di latte di massa in PCR. PAROLE CHIAVE BVD, monitoraggio, eradicazione. INTRODUZIONE All’infezione da virus BVD è attribuito dalla letteratura ma anche dalla nostra esperienza, un ruolo centrale in diverse problematiche patologiche dell’allevamento bovino: problemi riproduttivi, patologie polmonari e gastroenteriche, in cui il virus risulta coinvolto sia direttamente che attraverso l’attività immunodepressiva che predispone a complicazioni batteriche, virali e parassitarie. I danni economici che ne derivano sono ingenti7. Fin dai primi anni ’90, definita l’importanza dei soggetti persistentemente infetti (PI) nella trasmissione dell’infezione3,10,18, in diversi Paesi Europei sono stati predisposti piani di eradicazione14,9,24. In Italia è da tempo attivato un piano di risanamento obbligatorio in Alto Adige e altri piani volontari locali. L’attuazione di un efficace programma di eradicazione non può che partire da un’accurata analisi della situazione epidemiologica, delle tecniche d’allevamento e delle eventuali strategie vaccinali applicate nell’area d’interesse9. Altrettanto importante è l’individuazione dei test diagnostici più appropriati al fine di monitorare la realtà locale26,12. Numerosi infatti sono i metodi analitici disponibili sia per definire l’immunità per BVDv che per ricercare la presenza del virus stesso. I test sierologici più sfruttati sono principalmente basati su tecniche ELISA5,11,18 e di siero-neutralizzazione. Negli animali PI gli anticorpi materni permangono fino a circa 3 mesi d’età23, mentre nei soggetti non PI, gli anticorpi derivanti dal colostro permangono Autore per la corrispondenza: Arrigo Nigrelli ([email protected]). più a lungo, anche fino agli 8 mesi di vita. Circa il 15% dei soggetti PI sviluppa Ab contro la proteina non strutturale 2 (NS/2) ed una percentuale più bassa contro la glicoproteina E222. I soggetti immunizzati con vaccini spenti tendenzialmente non sviluppano Ab diretti verso antigeni non strutturali NS2/3, mentre tali Ab sono riscontrabili negli animali trattati con vaccini vivi o infettati naturalmente8. Nell’ambito della ricerca della presenza del virus hanno acquisito sempre maggiore importanza i metodi basati su tecniche di biologia molecolare come RT-PCR e Real-Time RTPCR, che oltre ad offrire livelli di sensibilità elevata possono consentire la genotipizzazione virale1,15,16. Per uno screening iniziale, al fine di studiare la prevalenza in una determinata area o classificare lo stato di un’azienda, è opportuno ricorrere a test rapidi ed economici in grado di fornire informazioni su numerosi soggetti contemporaneamente. Nel caso di allevamenti bovini da latte, la ricerca di anticorpi o del virus nel latte di massa ne sono un esempio. La presenza nel latte di massa di anticorpi specifici per BVDv è infatti indice della condizione immunologica dei soggetti in lattazione e la sieroconversione è spesso in relazione alla comparsa di soggetti PI in azienda24. Secondo alcuni autori inoltre, titoli anticorpali elevati indicano un’alta probabilità di un’esposizione recente o la presenza di uno o più animali PI20,25, mentre titoli molto bassi indicano una bassa prevalenza di animali sieropositivi e una probabile assenza di soggetti PI. Secondo altri autori, però, il principio non è applicabile in realtà in cui è alta la percentuale di soggetti sieropositivi. In quest’ultima situazione sono molto indicate metodiche RT-PCR13 e Real-Time RT-PCR che permettono di dimostrare la presenza del virus nel latte di mas- 1_Nigrelli_imp_OK autore 196 16-10-2009 9:12 Pagina 196 Prevalenza del virus BVD in allevamenti di bovine da latte in Lombardia e proposta di un protocollo di eradicazione aziendale sa e quindi la circolazione attiva tra i soggetti in lattazione. Sempre ai fini di uno screening iniziale, è dimostrata la validità del cosiddetto “spot test” che consiste nel ricercare la presenza anticorpi specifici in piccoli gruppi di soggetti giovani, non vaccinati, considerati rappresentativi del gruppo di appartenenza11,14. Per identificare i soggetti PI all’interno di un’azienda è necessario sottoporre ad analisi tutti gli animali. Un tipo d’approccio consiste nell’individuare, con tecnica ELISA per la ricerca di anticorpi specifici, i soggetti sieronegativi per poi verificare sugli stessi la presenza della viremia2. Si è dimostrata di grande efficacia anche la sistematica ricerca della presenza di BVDv con RT-PCR o Real-Time RT-PCR nel sangue di tutti i capi di un allevamento raggruppati a pool, seguita, in caso di positività, dall’analisi dei singoli componenti mediante ELISA (nei soggetti con più di tre mesi o privati del colostro) o nuovamente con PCR e dalla successiva verifica del permanere della viremia a distanza di almeno tre settimane22. L’elevata sensibilità delle tecniche di biologia molecolare consente di lavorare anche con pool molto numerosi. Considerando però la necessità di individuare e monitorare i singoli soggetti viremici e volendo contenere i costi risulta opportuno testare pool di 20 o 30 campioni per volta27. Il lavoro che segue offre un esempio di monitoraggio degli allevamenti da latte di sette province della Lombardia, attraverso l’applicazione di diverse tecniche diagnostiche, allo scopo di conoscere la prevalenza dell’infezione da virus BVD sia pregressa che attiva al momento dello studio. Si è ritenuto utile, inoltre, approfondire la probabilità di infettarsi che può avere un allevamento situato in zone ad elevata densità di allevamenti bovini (province di Lodi e Mantova) in un periodo di tempo di due anni. Non ultimo è valutata l’efficacia di un protocollo di identificazione ed eliminazione dei soggetti PI applicando approcci diagnostici appropriati sia per il monitoraggio delle aziende che per l’individuazione di animali persistentemente infetti. do che tale valore risulti proporzionale al livello anticorpale dei soggetti. Contemporaneamente al prelievo dei campioni di sangue è stato prelevato un campione di latte di massa, ripetuto a distanza di 2 mesi, per la ricerca diretta del virus BVD mediante RT-PCR15 o Realtime RT-PCR16. Sulla base della DO riscontrata nei sieri in esame (valore medio dei campioni di ciascuna azienda), della percentuale dei soggetti sieropositivi in ciascun gruppo (manze e vacche) e dei test PCR per la ricerca del virus nel latte di massa, è stata adottata la chiave interpretativa, riportata in Tabella 1. Sieroconversioni da virus BVD nell’arco di 24 mesi Sono state scelte in modo randomizzato 194 aziende di bovine da latte situate nelle province di Mantova e di Lodi, il cui latte di massa era risultato negativo per la presenza di anticorpi anti NS 2-3, all’inizio dello studio. Gli stessi allevamenti sono stati ritestati con lo stesso metodo ELISA sul latte di massa dopo 24 mesi. Il rilievo di sieroconversione è stato interpretato come nuova infezione nella mandria in lattazione, di provenienza esterna o da parte della rimonta interna. Modalità operative per l’eradicazione del virus BVD In 14 aziende con circolazione attiva di virus BVD è stato attuato il seguente protocollo di eradicazione: 1) Prelievo di sangue su tutti i soggetti presenti da un giorno di vita in avanti. 2) Ricerca del virus con RT-PCR o RTPCR Realtime su pool di 20 sieri omogenei per età; in caso di positività del pool sono stati esaminati i singoli campioni per identificare il soggetto viremico. 3) Isolamento del soggetto viremico e secondo test dopo 45 giorni; nel caso di conferma della positività, eliminazione del soggetto. 4) Nei 9 mesi seguenti l’eliminazione del soggetto PI, test di tutti i soggetti neonati testati al fine di identificare nuovi capi PI. 5) Controllo trimestrale del latte di massa con RT-PCR o RT-PCR Real-Time per la ricerca del virus BVD e del sangue di soggetti di 6-8 mesi di età per la ricerca di anticorpi verso le proteine NS2-3, al fine di verificare l’assenza di circolazione del virus. MATERIALI E METODI Valutazione della prevalenza dell’infezione da virus BVD Gli allevamenti sono stati scelti secondo un RISULTATI campionamento randomizzato stratificato, proporzionale al numero di aziende presenti nelle varie province considerate, ipotizzando una stima della circolazione attiva del virus intorno al 20%, con un indice di confidenza del 95% ed un errore del 5%. In base a questo criterio le aziende considerate sono risultate numericamente così ripartite: Bergamo (66), Cremona (34), Lecco (12), Lodi (14), Mantova (54), Pavia (14), Sondrio (46). Nelle suddette aziende sono state raccolte informazioni sull’utilizzo e sulla tipologia di eventuali piani vaccinali e vaccini utilizzati. Risultati della ricerca della circolazione attiva e passiva di BVD virus negli allevamenti studiati Ricerca degli allevamenti con circolazione attiva o pregressa Nelle aziende oggetto dello studio so- no stati prelevati 14-16 campioni di sangue su manze e altrettante vacche adulte che sono stati testati con metodica Elisa per la ricerca di Ab nei confronti delle proteine NS 2-3 (metodo interno IZSLER). Il valore in Densità Ottica (DO) ottenuto è stato classificato come basso (valori >0,2<0,6), intermedio (valori >0,6<1,2) o elevato (valori >1,2) assumen- La chiave interpretativa riportata in Tabella 1 ha portato ad una suddivisione delle aziende testate per la presenza attiva o pregressa riportata in Tabella 2. Sieroconversioni nell’arco di 24 mesi Dei 194 allevamenti sieronegativi all’inizio dello studio, 63 (32,5%) hanno presentato la comparsa di anticorpi verso proteine non strutturali 2-3 del virus BVD, dei quali 35 su 69 della provincia di Lodi (50,1%) e 34 su 125 della provincia di Mantova (22,4%). Protocollo per l’eradicazione aziendale dell’infezione da BVD I risultati dell’applicazione del protocollo per l’identificazione dei soggetti persistentemente infetti in una mandria e per l’eradicazione aziendale del virus BVD applicati in 14 aziende sono riportati in Tabella 3. 1_Nigrelli_imp_OK autore 16-10-2009 9:12 Pagina 197 A.D. Nigrelli et al. Large Animal Review 2009; 15: 195-198 197 Tabella 1 - Modalità interpretativa dei risultati dei test effettuati per l’identificazione degli allevamenti infetti. % positività Vacche % positività Manze PCR Latte di Massa Circolazione virale Nessuna Nessuna Non eseguita Assente Variabile Nessuna Negativa Pregressa in assenza di interferenze vaccinali Variabile (OD bassa) Variabile (OD bassa) Negativa Pregressa in presenza di interferenze vaccinali Variabile Variabile (OD elevata) Negativa Attiva Variabile Variabile Positiva Attiva Tabella 2 - Numero di allevamenti considerati per ciascuna provincia e determinazione dello stato di infezione e di circolazione virale. Allevamenti considerati Allevamenti con infezione attiva o pregressa Allevamenti non infetti Provincia N. allevamenti Pregressa Attiva Totale (%) Assente Titoli vaccinali Bergamo 66 27 30 57 (86,4) 5 4 Lodi 14 4 5 9 (64,3) 2 3 Mantova 54 23 18 41 (75,9) 13 – Pavia 14 8 2 10 (71,4) 4 – Sondrio 46 27 11 38 (82,6) 8 – Lecco 12 8 2 10 (83,3) 2 – Cremona 34 11 21 32 (94,1) 2 – Totale 240 108 (45,0%) 89 (37,1%) 197 (82,1) 36 (15%) 7 (2,9%) Tabella 3 - Numero di soggetti persistentemente infetti (PI) individuati nelle 14 aziende sottoposte ad eradicazione al primo controllo, al secondo controllo dopo 9 mesi ed evidenza di circolazione virale attiva dopo il secondo controllo. Azienda Capi presenti N. PI primo controllo 1 242 3 2 600 13 3 345 4 4 270 4 5 290 6 352 7 8 N. PI dopo 9 mesi % PI individuati Circolazione virale attiva dopo il 0 0,1 NO 1 2,3 NO 0 1,2 NO 0 1,5 NO 5 0 1,7 NO 3 0 0,8 NO 178 3 0 1,7 NO 113 5 0 4,4 NO 9 190 10 1 5,8 NO 10 647 2 0 0,3 NO 11 171 7 0 4,1 NO 12 1522 6 1 0,5 NO 13 71 1 0 1,4 NO 14 106 2 0 1,9 NO TOT. 5097 68 3 1,4 - CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI La prevalenza dell’infezione da BVD virus è risultata elevata sia in forma di circolazione attiva che pregressa nelle province lombarde considerate, il che conferma la sua notevole diffusione già documentata in precedenza da altri autori6,17. Relativamente sorprendente è risultato il tasso di infezione nei 24 mesi considerati dimostrato attraverso l’evidenza di sieroconversione sul latte di massa in oltre il 30% degli allevamenti considerati, la cui percentuale risulta significativamente superiore in provincia di Lodi (p = 0,001). La spiegazione potrebbe risiedere nella maggiore consistenza media degli allevamenti del lodigiano rispetto a quelli del mantovano, oppure nel maggior numero di spostamenti di animali fra le aziende in compravendita, due tra i principali fattori di rischio per la diffusione dell’infezione da BVD17,21. Lo studio ha dimostrato la validità del metodo utilizzato, per valutare la circolazione attiva del virus BVD in un’azienda, fornendo uno strumento puntuale per effettuare le scelte più opportune di intervento vaccinale e/o di ricerca ed eliminazione degli eventuali soggetti persistentemente infetti. In particolare i metodi di PCR applicati su pool di 20 sieri hanno consentito in tutti gli allevamenti sottoposti al programma di eradicazione, di individuare tutti i soggetti persistentemente in- 1_Nigrelli_imp_OK autore 198 16-10-2009 9:12 Pagina 198 Prevalenza del virus BVD in allevamenti di bovine da latte in Lombardia e proposta di un protocollo di eradicazione aziendale fetti azzerando la circolazione attiva del virus. Anche se in alcune aziende il numero di persistentemente infetti individuati è risultato particolarmente elevato (fino al 5,8% dei capi presenti), la media è assolutamente in linea con altre ricerche svolte in Italia e negli altri paesi4,6. Analogamente a quanto evidenziato anche nell’ambito dei programmi d’eradicazione degli altri paesi europei19, il nostro lavoro evidenzia la necessità di miglioramento del livello di biosicurezza negli allevamenti bovini, specialmente in quelli da riproduzione, poiché l’ingresso del virus BVD nella mandria comporta il rischio di infezione di bovine gravide e il conseguente rischio di nascita di soggetti persistentemente infetti che perpetuano l’infezione in allevamento. Ricerche eseguite con finanziamento Ministero della Salute – Ricerca Corrente 2005. ❚ Prevalence of BVDV infection in dairy cattle in Lombardy and proposal of a farm eradication program SUMMARY The authors have verified the seroprevalence of BVDV in a stratified random sample of 240 cattle farms in some provinces of Lombardy. In each herd, young (heifers) and adult (cows) animals were sampled and tested for antibodies to BVDV NS 2-3 by ELISA. The prevalence of positivity in groups and the observed ODs allowed to assess: (i) the presence of active circulation of BVDV in 89 herds (37.1%), (ii) responses related to prior infection in 108 herds (45.0%) and (iii) responses probably related to the use of vaccine in 7 herds (2.9%). Another sampling involved 194 farms located in two provinces of Lombardy in the course of 24 months, with quarterly examinations of the tank bulk milk antibodies by ELISA. The high percentage of “seroconversion” (63 of 194 corresponding to 32.5%) strongly suggests the evidence for an high circulation of BVDV among herds in Lombardy. The eradication protocol applied in 14 farms was based on the research of BVDV by PCR of pools of 20 sera to cover the whole herd from one day old calves. Moreover all new-born calves were tested by PCR during the 9 following months. A minimum of 1 to a maximum of 14 (0.1% to 5.8%) persistently infected (PI) animals were identified in the controlled farms. The elimination of PI subjects identified in all herds led to eradication of infection. This was documented by repeated negative antibody response in 6/8 months old subjects and by PCR on the bulk milk samples. KEY WORDS BVD, survey, eradication. Bibliografia 1. Baxi M, McRae D, Baxi S, Greiser-Wilke I, Vilcek S, Amoako K, Deregt D. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses. Vet Microbiol. 2006; 116(1-3):37-44. 2. Brock, K.V., 1995. Diagnosis of bovine viral diarrhoea virus infections. Veterinary Clinics of North America. Food Anim. Pract. 11 3, pp. 549-561. 3. Brownlie J. The pathogenesis of bovine viral diarrhea virus infections. Rev. Sci. Technical. 1990, 9: 43-59. 4. De Mia, G.M., Feliziani, F., Notaris, P., Blasi, G., Mencaroni, G., Controllo dell'infezione da virus BVD in allevamenti di bovine da latte: Nota preliminare, Atti Soc. It. Sci. Vet. 1996: 249-250. 5. Edwards S. 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