Università degli Studi di Brescia
Dottorato di ricerca in Neuroscienze XXVII° ciclo
Anno accademico 2012-2013
Dottoranda: Michela Zaltieri
Coordinatore: Prof.ssa Cristina Missale
Tutor: Dott.ssa Arianna Bellucci
Relazione dell’attività svolta durante il secondo anno di corso:
Alfa-sinucleina e Sinapsina III:
nuovi scenari nella sinapsi dopaminergica
INTRODUZIONE
La malattia di Parkinson (MP) è il disordine neurodegenerativo a sintomatologia motoria più
diffuso. Da un punto di vista istopatologico il cervello dei pazienti affetti da MP è caratterizzato
dalla perdita dei neuroni dopaminergici nel sistema nigro-striatale e dalla presenza di inclusioni
proteiche intraneuronali e intraneuritiche denominate rispettivamente Corpi di Lewy (CL) e neuriti
di Lewy (NL), il cui principale costituente proteico è alfa-sinucleina (α-sin) (Spillantini et al., 1998).
Questa proteina è implicata nella regolazione di numerosi processi neuronali attraverso
l’interazione con componenti citosolici, citoscheletrici, sinaptici e di membrana (Bellucci et al.,
2012a). In condizioni fisiologiche α-sin non assume una struttura terziaria definita ma si trova in
forma “unfolded” e possiede pertanto un’elevata plasticità conformazionale (Weinreb et al., 1996).
Alterazioni quali mutazioni puntiformi o modificazioni post-traduzionali come fosforilazione,
nitrosilazione, ubiquitinizzazione e taglio C-terminale rendono α-sin maggiormente propensa ad
assumere una conformazione a foglietto β (Smith et al., 2005; Uversky et al., 2005; Tofaris et al.,
2003; Liu et al., 2005; Bellucci et al., 2012b), una struttura che induce e/o favorisce l’aggregazione
di α-sin in forma patologica fibrillare. Recenti studi, che hanno dimostrato che il “core” dei CL è
costituito da α-sin tronca a livello C-terminale (Prasad et al., 2012), suggeriscono che il taglio Cterminale di α-sin rappresenti una alterazione patogenetica fondamentale per la formazione di
queste inclusioni che potrebbero essere alla base dell’induzione dei processi neurodegenerativi
che caratterizzano la MP. In linea con questa ipotesi è stato osservato che mutazioni o
moltiplicazioni del gene di α-sin sono correlate all’insorgenza di forme familiari di MP ad esordio
giovanile (Polymeropoulos et al., 1997; Singleton et al., 2003). Inoltre, è stato osservato che α-sin
è in grado di interagire e regolare l’espressione, l’attività e la distribuzione subcellulare di
numerose proteine nei neuroni dopaminergici sia in condizioni fisiologiche che patologiche
(Bellucci et al., 2012b) e in particolare di quelle coinvolte nella modulazione delle sinapsi tra cui il
trasportatore della dopamina (DA) (DAT) (Bellucci et al., 2008). In linea con questi studi è stato
osservato che topi knockout (ko) o che presentano un delezione spontanea del locus di α-sin (null)
(Spech and Schoepfer, 2001) mostrano sia una diminuzione dell’espressione del DAT sia una
diminuzione della ricaptazione di DA a livello striatale (Chadchankar et al., 2011). Inoltre, topi che
overesprimono la forma tronca a livello C-terminale di α-sin presentano una marcata ridistribuzione
dei complessi DAT/ α-sin nelle terminazioni striatali (Bellucci et al., 2011). I risultati di studi condotti
su topi ko e null per α-sin indicano che questa proteina può funzionare da modulatore negativo del
rilascio di DA (Abeliovich et al., 2000; Yavich et al., 2004). Il metilfenidato, una molecola che regola
il rilascio di DA modulandone i pools vescicolari e bloccandone il reuptake, attenua il rilascio di DA
in topi null e ko per α-sin, suggerendo che la proteina sia implicata in vari meccanismi che
controllano il pool di riserva di DA (Chadchankar et al., 2012). L’α-sin dunque regola non solo la
ricaptazione sinaptica di DA, ma gioca anche un ruolo nel controllo del riciclo delle vescicole
sinaptiche e nel mantenimento dei diversi pools vescicolari. Inoltre, α-sin modula la formazione del
complesso delle proteine della famiglia soluble NSF Attachment Protein Receptor (SNAREs) a
livello sinaptico sia in condizioni fisiologiche che patologiche (Garcia-Reitbock et al., 2010; Sharma
et al., 2011). Queste proteine sono coinvolte nei meccanismi di rilascio di neurotrasmettitori in
quanto modulano il legame delle vescicole sinaptiche alla membrana e la loro successiva fusione.
L’overespressione della forma tronca di α-sin determina una ridistribuzione delle SNAREs nei
neuroni dopaminergici nigro-striatali a cui si associa una riduzione del rilascio di DA (GarciaReitbock et al., 2010). Tutti questi risultati indicano che a livello dei terminali sinaptici
dopaminergici α-sin interagisce con numerose proteine modulandone la localizzazione e la
funzionalità. Pertanto, alterazioni conformazionali di α-sin e la sua conseguente perdita di funzione
e aggregazione patologica porterebbero ad una ridistribuzione delle proteine sinaptiche
compromettendo così la funzionalità dei neuroni dopaminergici. In particolare, diversi studi
suggeriscono che l’aggregazione e la deposizione di α-sin a livello sinaptico potrebbe determinare
specifiche modificazioni patologiche che, partendo dalla sinapsi causerebbero in via retrograda
prima degenerazione assonale nello striato e infine perdita neuronale nel mesencefalo (GarciaReitbock et al., 2010; Stoica et al., 2012; Lundbald et al., 2012). Recentemente è stata identificata
un’altra proteina sinaptica che, in modo simile ad α-sin, agisce come regolatore negativo del
rilascio di DA a livello striatale: Sinapsina III (Kile et al., 2010). Le sinapsine sono una famiglia di
fosfoproteine neuronali che legano reversibilmente le vescicole sinaptiche al citoscheletro di actina
e ne mediano l’ancoraggio, la fusione e il riciclo regolando così il rilascio di neurotrasmettitori nei
terminali pre-sinaptici (Cesca et al., 2010). Tutti questi processi sono mediati dalla penetrazione
della porzione C-terminale delle sinapsine nel doppio strato lipidico e dalla regione di omoeterodimerizzazione che promuove il clustering di vescicole sinaptiche dimerizzando con altre
molecole di sinapsina (Benfenati et al.,1993; Stefani et al., 1997). Le vescicole sinaptiche infatti
sono organizzate in clusters nei terminali nervosi, i principali sono: il pool di riserva, il pool di
riciclaggio e il pool di rilascio (Betz et al., 1993). Quest’ultimo è composto da vescicole in grado di
rilasciare neurotrasmettitori in seguito ad uno stimolo e comprende tutte le vescicole coinvolte nelle
vie di eso-endocitosi. Infine il pool di riserva include vescicole che vengono mobilizzate solo in
seguito a stimolazione intensa. La transizione tra questi pools e il loro mantenimento dinamicospaziale sono regolati dalle sinapsine (Fornasiero et al., 2012; Vasileva et al., 2012). Queste, nella
loro forma defosforilata, trattengono le vescicole alla matrice citoplasmatica, mentre la
stimolazione nervosa comporta la dissociazione delle sinapsine dalle vescicole seguita dalla
mobilizzazione di queste verso la zona attiva del terminale nervoso (Greengard et al., 1993). La
fosforilazione delle sinapsine (da parte di CaMKII oltre a PKA, MAPK e tirosina chinasi Src) ne
comporta un cambio conformazionale e diminuisce l’affinità sia per le vescicole (Schiebler et al,
1986) che per l’actina (Bahler et al., 1987). Infine le sinapsine sono coinvolte nei meccanismi di
crescita assonale, di formazione delle sinapsi e delle dimensioni dei coni di crescita nei neuroni in
via di sviluppo (Ferreira et al., 2000). Infatti, nei topi ko per Sinapsina III la neurogenesi è
notevolmente alterata suggerendo un ruolo della proteina nei primi stadi dello sviluppo neuronale
(Feng et al., 2002). La Sinapsina III durante lo sviluppo neuronale è altamente concentrata nei coni
di crescita e non co-localizza con marker sinaptici (Ferreira et al., 2000) mentre nei neuroni maturi
si localizza nei terminali neuronali e la sua distribuzione è simile a quella delle proteine delle
vescicole sinaptiche (Pieribone et al., 2002), sebbene sia primariamente localizzata al di fuori delle
sinapsi nel cervello adulto (Porton et al., 2011). A differenza di Sinapsina I e II, che sono
localizzate esclusivamente a livello dei terminali pre-sinaptici, Sinapsina III è presente anche nel
corpo cellulare. Topi ko per Sinapsina III mostrano un aumento del rilascio di DA senza presentare
deficit della sua ricaptazione (Kile et al., 2010) suggerendo quindi che questa proteina possa
essere un regolatore negativo del rilascio di DA e sia coinvolta nel controllo del pool di rilascio del
neurotrasmettitore condividendo così una funzione simile a quella di α-sin. Sinapsina III sembra
essere l’unica sinapsina rilevante per la regolazione dei pool vescicolari di DA in quanto, seppur
Sinapsina I sia stata dimostrata essere uno dei membri del proteoma del DAT, Sinapsina I e II
mislocalizzano con il trasportatore vescicolare per le monoamine di tipo 2 (VMAT2) nello striato
(Bogen et al., 2006). In funzione del fatto che il DAT è in grado di interagire con Sinapsina I e α-sin
(Maiya et al., 2007) e Sinapsina I condivide una forte omologia strutturale con Sinapsina III, è
ipotizzabile prevedere una specifica interazione di quest’ultima con il DAT che non è però ancora
nota. Sinapsina III potrebbe dunque essere un altro membro del proteoma sinaptico di α-sin che
quindi ne regolerebbe la localizzazione e la funzionalità. Inoltre α-sin e Sinapsina III regolano
similmente le sinapsi dopaminergiche nigro-striatali in senso inibitorio, quindi un accumulo o
un’alterazione di α-sin potrebbe a sua volta alterare la funzionalità di Sinapsina III, modificando i
suoi livelli e la sua distribuzione. In particolare, un aumento e una ridistribuzione dei complessi αsin-Sinapsina III nelle sinapsi dopaminergiche striatali potrebbero essere associati alla deregolazione del rilascio di DA dato che entrambe queste proteine sono regolatori negativi di questo
evento. Recenti studi hanno dimostrato che la cocaina è in grado di indurre un aumento dei livelli
di DA extracellulare attraverso meccanismi che sono indipendenti dalla sua azione inibitoria sul
DAT, ma che comportano la mobilitazione di un pool di rilascio di DA che è sinapsina-dipendente
(Venton et al., 2006). Inoltre, è stato osservato che la cocaina è in grado di contrastare la
ridistribuzione indotta da α-sin del DAT in aggregati intracellulari (Bellucci et al., 2008). Ciò porta a
supporre una reciproca interazione modulatoria tra α-sin, DAT e le sinapsine nei terminali
dopaminergici. Perciò a livello dei terminali pre-sinaptici un’alterazione della Sinapsina III dovuta
all’aggregazione patologica di α-sin potrebbe essere un evento chiave nella compromissione delle
funzioni sinaptiche così come dei corretti meccanismi di rilascio delle vescicole portando ad
alterazioni della funzionalità dei neuroni dopaminergici.
SCOPO DEL LAVORO
Lo scopo delle ricerche effettuate in questo studio è stato identificare i meccanismi molecolari
attraverso i quali α-sin modula l’assetto sinaptico dei neuroni dopaminergici valutando come la
mancanza di α-sin possa influenzare l’espressione e la distribuzione subcellulare di diverse
proteine sinaptiche quali DAT, Sinapsina III e Sinapsina I durante lo sviluppo neuronale e in
neuroni dopaminergici maturi. Inoltre abbiamo voluto valutare se le eventuali alterazioni nei livelli e
nella localizzazione delle suddette proteine riflettano una particolare organizzazione delle vescicole
sinaptiche a livello dei terminali dopaminergici con conseguenze sulla funzionalità neuronale. In
particolare gli obiettivi specifici sono stati:
Studiare la distribuzione ed espressione di Sinapsina III, del DAT e di Sinapsina I in colture
primarie di neuroni mesencefalici dopaminergici preparate da embrioni di topi di controllo
C57BL/6J e null per α-sin quali C57BL/6J Ola/Hsd.
Valutare se il silenziamento del gene codificante per α-sin e insulti in grado di indurre la sua
aggregazione quali la deprivazione di glucosio (GD) fossero in grado di alterare
l’espressione di Sinapsina III, del DAT e di Sinapsina I in colture primarie di neuroni
mesencefalici.
Studiare la distribuzione di Sinapsina III e del DAT a livello dello striato in sezioni coronali di
topi C57BL/6J Ola/Hsd e C57BL/6J di 12 mesi tramite tecniche di immuno-istochimica.
Valutare se le alterazioni della distribuzione delle suddette proteine determinassero
modificazioni della risposta locomotoria al trattamento con cocaina o con il composto 1(2(di(4-fluorophenyl)-methoxy)-ethyl)-4-(3-phenyl-propyl)piperazine (GBR-12935) valutate
mediante l’utilizzo del test dell’ “open field”.
Studiare la funzionalità dei neuroni dopaminergici attraverso la valutazione dei livelli
extracellulari di DA e dei suoi metaboliti in condizioni basali e in seguito a depolarizzazione
a livello striatale in topi C57BL/6J Ola/Hsd e C57BL/6J di 12 mesi attraverso la tecnica
della microdialisi verticale accoppiata a dosaggi in HPLC.
Valutare se le alterazioni osservate tramite immunocito- ed immunoisto-chimica fossero
associate ad un modificato assetto delle vescicole sinaptiche. In particolare sono state
utilizzate le tecniche dell’immunogold e della morfometria associate all’utilizzo di un
microscopo elettronico a trasmissione per fare un’analisi ultrastrutturale della localizzazione
delle diverse proteine e delle vescicole a livello dei terminali pre-sinaptici dopaminergici.
MATERIALI E METODI
Animali da esperimento
Come modelli “in vivo” sono stati utilizzati topi wilde type C57BL/6J (Charles River, Margate, UK)
e topi C57BL/6J Ola/Hsd (C57BL/6J Ola/Hsd, Harlan, Udine, Italia) che presentano una delezione
spontanea del gene che codifica per α-sin. I topi del ceppo C57BL/6J Ola/Hsd sono
fenotipicamente comparabili a topi ko per α-sin (Chadchankar et al., 2011;2012) e rappresentano
dunque un modello ottimale per la valutazione degli effetti ascrivibili alla mancanza di -sin nei
neuroni dopaminergici e in generale nelle sinucleinopatie. I topi sono stati stabulati presso lo
stabulario del Dipartimento di Medicina Molecolare e Traslazionale dell’Università degli Studi di
Brescia e mantenuti in gabbie di plexiglas dove avevano libero accesso ad acqua e cibo con un
ciclo luce/oscurità di 12 h e temperatura costante di 23°C. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti
in accordo con le linee guida del European Community’s Council for Animal Experiments (DL
116/92) e adottando ogni accorgimento per rendere minima la sofferenza animale.
Colture cellulari
Per gli studi “in vitro” sono state utilizzate colture primarie di neuroni mesencefalici preparate
secondo il protocollo descritto in Bellucci et al., (2008) con minime modificazioni. In breve, il
mesencefalo ventrale è stato prelevato da embrioni murini al tredicesimo giorno e mezzo di
gestazione e posto in terreno di coltura completo composto da Neurobasal Medium (Gibco, Milano,
Italia) contenente glutammina 2 mM, Penicillina/Streptomicina 100 μg/mL e B27 1X (Gibco, Milano,
Italia). In seguito alla dissociazione meccanica eseguita con micropipette sterili, le cellule sono
state risospese in terreno completo e centrifugate. Il test del Trypan Blue è stato utilizzato per
valutare la conta cellulare e il saggio di vitalità. Le cellule sono state piastrate in terreno completo
su coating di Poly-D-lisina a diverse concentrazioni (80000 cell/well in piastre multi pozzetto da 24
e 800000 cell/dish 3 cm ø) e sono state mantenute ad una temperatura di 37°C in un’atmosfera
caratterizzata dal 5 % CO2 e 95% O2. Le colture cellulari utilizzate per i trattamenti sono state
fissate o pellettate all’undicesimo giorno in vitro (DIV 11). Analisi di immuno-citochimica hanno
dimostrato che le colture primarie di neuroni mesencefalici erano composte per il 99.1 % da
neuroni, di cui il 10 % dopaminergici e per il restante 0.9 % da astrociti.
Deprivazione di glucosio (GD)
La deprivazione di glucosio (GD) è un insulto in grado di indurre l’aggregazione di α-sin e la
formazione di inclusioni intracitoplasmatiche in colture primarie di neuroni mesencefalici murini
(Bellucci et al., 2008). I neuroni primari mesencefalici (DIV 9) sono stati incubati per 1 h a 37°C
con una soluzione di HBSS (Sigma Aldrich, Milano, Italia) addizionata con glutammina 2 mM e 1 %
B27. In seguito questo terreno è stato rimosso e sostituito con terreno completo. Per eseguire
esperimenti di immuno-citochimica o western blot le cellule sono state pellettate o fissate dopo 48
h dal trattamento di GD. Per valutare gli effetti delle semplici sostituzioni di terreni i neuroni di
controllo sono stati sottoposti ai medesimi cambi di terreno ma utilizzando sempre quello completo.
Silenziamento genico di α-sin
Il silenziamento genico di α-sin è stato effettuato con la tecnica di “RNA interference” al DIV 7
utilizzando una sequenza di RNA silenziante (siRNA) (Dharmacon-Thermo Scientific, Chicago,
USA). Una sequenza scramble non silenziante (SCR) è stata inoltre utilizzata in ogni esperimento
come controllo negativo. I siRNA e lo SCR sono stati risospesi in H2O RNAsi free (20 µM
concentrazione finale) e agitati per 30 min a temperatura ambiente (R.T.). La concentrazione dei
siRNA e la loro purezza è stata saggiata grazie alla misura della loro assorbanza a 260 nm. Tutte
le sequenze di siRNA sono state testate a diverse concentrazioni per identificare i parametri
sperimentali più opportuni per limitare i fenomeni di tossicità e ottenere contemporaneamente un
silenziamento genico elevato. I risultati ottenuti ci hanno portato a determinare che la
concentrazione ottimale di siRNA da utilizzare per i nostri esperimenti era di 25 nM (dati non
mostrati). Sono stati veicolati 25 nM di siRNA (Bellucci et al., 2011) diluiti in Optimem (Gibco,
Milano, Italia) fino alla concentrazione desiderata. In breve, è stato aggiunto INTERFERin
(Polyplus-transfection, Illkirch, Francia) alle concentrazioni indicate dalla casa produttrice che sono
state stimate in rapporto al volume totale di terreno usato in pozzetto e in dish da 3 cm Ø. La mix
ottenuta è stata immediatamente sottoposta ad agitazione tramite vortex per 10 sec e incubata per
10 min a R.T.. Il terreno delle cellule è stato parzialmente sostituito con terreno fresco e dei
quantitativi standard della suddetta mix sono stati aggiunti in dish o pozzetto secondo le istruzioni
della casa produttrice. Dopo 4 h di incubazione il terreno è stato parzialmente sostituito con terreno
fresco per limitare i fenomeni di cito-tossicità. Gli effetti del silenziamento genico sull’espressione
proteica sono stati saggiati dopo 96 h di trattamento tramite western blot.
Anticorpi
L’α-sin è stata visualizzata usando l’anticorpo monoclonale SYN-1 (BD-Bioscence, Milano, Italia)
che riconosce i residui 91-99 della forma umana e murina (Perrin et al., 2003) della proteina. Gli
anticorpi policlonali anti-Sinapsina Ia-b (Merck Millipore, Darmstadt, Germany ) e anti-Sinapsina III
(Abcam, Cambridge, UK) sono stati utilizzati per visualizzare i rispettivi substrati. Il DAT è stato
visualizzato tramite l’anticorpo policlonale anti-DAT che riconosce i residui 541-620 del
trasportatore (Santa Cruz Biotecnology, Santa Cruz, CA, USA). Gli anticorpi secondari utilizzati
negli esperimenti di immuno-citochimica sono anti-mouse coniugato con Cy3 (Jackson
ImmunoResearch, Baltimore, USA), anti-rabbit coniugato con fluoresceina FITC (Jackson
ImmunoResearch, Baltimore, Usa). Per analisi di western blot sono stati utilizzati anticorpi
secondari coniugati con la horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotecnology, Santa Cruz, CA,
USA).
Immuno-citochimica (ICC)
Al termine degli esperimenti le cellule sono state fissate grazie all’incubazione per 10 min in una
soluzione 4% paraformaldeide / 3% saccarosio preparata in tampone fosfato salino (PBS) 1 M pH
7.4 e poi conservate in PBS 1 M contenente 0.05% di Na-azide. I vetrini sono stati incubati per 10
min in una soluzione permeabilizzante contenente metanolo al 20% e in seguito incubati per 30
min in una soluzione di blocco contenente 3% (w/v) di BSA (albumina serica bovina) con 2% (v/v)
di NGS (normal goat serum) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) in PBS 1 M + TritonX-100 0.1%. I
vetrini sono stati mantenuti over night (O.N.) a 4°C con l’anticorpo primario opportunamente diluito
in soluzione di blocco. Il giorno seguente le cellule sono state incubate per 1 h a R.T. con
l’anticorpo secondario fluorescente diluito in PBS 1 M TritonX-100 0.1% con l’aggiunta di 1% (w/v)
di BSA. Per i protocolli di doppia marcatura alla fine di questa incubazione le cellule sono state
sottoposte ad un secondo ciclo di marcatura con un ulteriore anticorpo primario. I nuclei cellulari
sono stati infine contro colorati con HOECHST 2495 (Sigma Aldrich, Milano, Italia). I vetrini sono
stati infine montati su vetrini coprioggetto mediante l’utilizzo del montante specifico per
fluorescenza vectashield (VECTOR Laboratories, Burlingame, CA, USA) e osservati tramite un
microscopio confocale Zeiss (Carl Zeiss S.p.a., Milano, Italia).
Immuno-istochimica (IHC)
Gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato (350 mg/kg, i.p.) e successivamente perfusi
per via transcardiaca con paraformaldeide fredda al 4% in PBS 1 M pH 7.4. Dopo la rimozione dal
cranio, i cervelli sono stati post-fissati per 4 h nella medesima soluzione e in seguito sono stati
posti in una soluzione contenente 18% di saccarosio per la criopreservazione. Il giorno seguente
sono state tagliate sezioni coronali di 30 μm di spessore con l’utilizzo di un criostato (Leica) che in
seguito sono state conservate a -20°C in una soluzione contenente glicerolo 60% (Sigma-Aldrich)
in PBS ad alta concentrazione salina (PBS A) (Normal Salina 1.54 M + PO4 Buffer 2x (NaOH 0.2
M, NaH2PO4 0.2 M). In breve, le fettine “free floating”, dopo essere state lavate in una soluzione di
PBS 1 M con Triton X-100 0.3%, venivano incubate per 30 min a R.T. in una soluzione
permeabilizzante contenente metanolo al 20% in PBS 1 M. In seguito le sezioni sono state trattate
per 30 min in una soluzione di blocco contenente 3% (w/v) di BSA con 2% (v/v) di NGS in PBS 1 M
+ Triton X-100 0,3% e poi venivano incubate O.N. alla temperatura di 4°C con gli specifici anticorpi
primari diluiti sempre in soluzione di blocco. Il giorno successivo dopo i lavaggi in PBS 1 M + Triton
X-100 0,3%, le sezioni sono state incubate per 1 h a R.T. con gli anticorpi secondari opportuni
coniugati con fluorocromi fluorescenti diluiti in PBS 1M Triton X-100 0.3% contenente 1% (w/v)
BSA. Per i protocolli di doppia marcatura, le sezioni sono state sottoposte ad un secondo ciclo di
colorazione e, infine, dopo un ulteriore lavaggio con PBS 1 M Triton X-100, le fettine venivano
lavate in H2O e incubate con HOECHST 2495 per marcare i nuclei cellulari (Sigma-Aldrich, Milano,
Italia). Infine le sezioni sono state montate su vetrino e coperte con coprioggetto mediante l’utilizzo
del montante vectashield (VECTOR Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Western blot (WB)
Il pellet di neuroni primari mesencefalici è stato lisato utilizzando RIPA buffer (Tris-HCl 50 mM, pH
7.4, NaCl 150 mM, Na deossicolato 0.5%, Na dodecilsolfato 0.1%, EDTA 2 mM, PMSF 0.1 mM, Nethylmaleimide 1 mM, Na Ortovanadato 1 mM, Nonidet P40 1%, NaF 1 mM più un mix completo di
inibitori delle proteasi (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)). La concentrazione proteica dei
diversi campioni è stata misurata grazie alla metodica di Bradford (Pierce, Rockford, IL). Uguali
quantità di proteine (30 μg) sono state caricate e corse su un gel 4-12% Nu-PAGE Novex Bis-Tris
(Invitrogen, Milano, Italia), trasferiti su membrane di PVDF (polyvinylidene difluoride) ed esaminati
con gli opportuni anticorpi. In seguito sono state eseguite analisi densitometriche delle bande
ottenute grazie al software Gel Pro Analyzer versione 6.0 (MediaCybernetics, Bethesda, MD,
U.S.A). Tutte le bande ottenute sono state normalizzate utilizzando α-tubulina come controllo del
caricamento di una uguale quantità di campioni.
Microdialisi verticale e dosaggi in HPLC
I topi C57BL/6J, utilizzati come controllo, e C57BL/6J Ola/Hsd, sono stati previamente trattati con
analgesico (Carprofen 5 mg/Kg i.p.) e dopo 30 min anestetizzati mediante somministrazione di
Tiletamina/Zolazepam (75 mg/Kg i.p.). L’animale anestetizzato veniva fissato su un apparato
stereotassico e in seguito la cute della testa veniva incisa lungo la linea mediana in modo da
esporre la superficie periostale della calotta cranica. In questo modo era possibile identificare i due
punti di riferimento: lambda (punto di incontro fra la sutura sagittale mediana e lamboidea) e
bregma (fra la sutura sagittale mediana e quella coronarica). Posizionato il cranio in maniera
perfettamente orizzontale, sono state determinate le coordinate spaziali in riferimento al punto
bregma : antero-posteriorità (AP), lateralità (L) e altezza (H) (Paxinos and Franklin, 2001). Tramite
l’utilizzo di un trapano chirurgico è stato praticato un foro unilaterale a livello dello striato dorsale
(AP= -0.62mm; L= -1.6mm). Tramite questo foro era possibile inserire una canula guida all’altezza
dello striato dorsale (H= -1.9mm) che veniva fissata alla superficie ossea tramite cemento acrilico
dentistico per ottenere una struttura resistente. Dopo aver suturato l’incisione, l’animale veniva
stabulato singolarmente in un’apposita stanza post-operatoria. Il giorno seguente all’impianto, la
membrana di cuprofano da microdialisi veniva inserita tramite la canula guida e perfusa ad un
flusso costante di 2 ul/min, inizialmente con una soluzione di aCSF basale (NaCl 140 mM, CaCl2
1.2 mM, KCl 3 mM, NaH2PO4 0.27 mM, Na2HPO4 1.2 mM MgCl2 1 mM e glucosio 7.2 mM). Sono
stati raccolti campioni da 40 ul ciascuno ad intervalli di 20 min in provette contenenti 5 ul di HCl 10
mM per evitare l’ossidazione della DA raccolta. I primi 5 campioni erano rappresentativi del rilascio
basale di DA e in seguito la soluzione di perfusione è stata sostituita con aCSF-K+ per indurre la
depolarizzazione (NaCl 93 mM, CaCl2 1.2 mM, KCl 50 mM, NaH2PO4 0.27 mM, Na2HPO4 1.2 mM
MgCl2 1 mM e glucosio 7.2 mM). Dopo due campioni di lavaggio per eliminare la soluzione di
aCSF-K+, la membrana è stata infusa con aCSF addizionato con 1uM del bloccante dei canali Na+
voltaggio-dipendenti tetrodotossina (TTX) per valutare se il segnale misurato corrispondesse a
quello inerente alla DA rilasciata e non a quella intracellulare. Gli animali terminata la procedura
sono stati sacrificati tramite dislocazione cervicale. I loro cervelli sono stati prelevati, fissati in
formalina al 37% per 24h e successivamente è stato verificato il corretto inserimento della
membrana da dialisi mediante analisi istologica. Gli eluati raccolti sono stati spediti presso il
laboratorio della Prof.ssa Laura della Corte nel dipartimento NEUROFARBA dell’Università degli
Studi di Firenze. I dati ottenuti sono stati analizzati tramite il software GraphPad Prism 4 e sono
stati ricavati i grafici relativi.
Studi di comportamento
Il test dell’ “open field” prevedeva l’osservazione e la valutazione del comportamento di topi
introdotti in un’arena (misure 50X50X50 cm) le cui pareti erano oscurate. L’attività degli animali
introdotti nell’arena è stata visualizzata e registrata grazie ad una telecamera associata ad un
software specifico (ANY-MAZE, Stoelting, USA). Ogni singolo animale è stato inserito nell’arena
per un periodo di abituazione di 5 min prima di iniziare la fase vera e propria di registrazione. Ogni
intervallo di registrazione (stage) era pari a 2 min e 30 secondi duranti i quali venivano misurati
diversi parametri tra cui la distanza percorsa dall’animale espressa in metri (m). Dopo quattro
stages basali veniva somministrato il farmaco cocaina (10 mg/Kg i.p.) o GBR-12935 (10 mg/Kg
i.p.), e come controllo soluzione salina (NaCl 0.9% i.p.). In seguito si eseguivano altri 10 stages per
un totale di 35 min di registrazione. Per valutare l’influenza di α-sin nel processo di rilascio sono
stati sottoposti a questo protocollo sperimentali topi di controllo (ceppo C57BL/6J) e null per la
proteina (C57BL/6J Ola/Hsd).
Microscopia elettronica a trasmissione
I neuroni primari mesencefalici sono stati piastrati in dish da 6 cm ø alla concentrazione di
2000000 cell/dish e mantenuti in coltura fino al DIV 11 giorno in cui sono stati fissati. In breve, le
cellule sono state incubate per 10 min in glutaraldeide al 2.5% in PBS 0.1 M pH 7.4 e in seguito
raccolte con uno scraper. La sospensione è stata centrifugata ( 5 min a 3000 rpm) e il pellet
risospeso in glutaraldeide al 1% in PBS 1 M pH 7.4. Dopo un’ulteriore centrifuga il pellet veniva
risospeso in PBS 1 M e conservato a 4°C per le diverse applicazioni.
Analisi morfometrica
I pellet ottenuti venivano incubati con una soluzione di tetrossido di osmio 1% (Electron
Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) fino a quando il pellet non assumeva una colorazione
scura e in seguito venivano lavati in PBS 1 M. Grazie ad una serie di incubazioni in una scala di
acetoni (70%, 95%, 100%) che permettono la disidratazione completa dei pellet, i campioni
venivano inclusi grazie all’utilizzo di una resina apposita (EMbed-812 che sostituisce la Epon-812)
(Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) secondo la metodica descritta da Luft et al., (1961)
addizionata ad un catalizzatore 2,4,6-tris (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-30) (Electron
microscopi Science, Hatfield, PA). In seguito venivano tagliate sia sezioni semifini (1 µm) e
ultrasottili (80 nm) grazie all’utilizzo di un microtomo (Ultracut E, Reichert-Jung, Germania) usando
rispettivamente lame di vetro o di diamante (Microstar, USA). Le sezioni semifini erano in seguito
contro-colorate con blu di toluidina per valutare le condizioni del pezzo mentre le sezioni ultrasottili
ottenute erano montati su retini appositi di nickel e contro colorate con acetato di uranile 3% e con
citrato di piompo in modo da rendere visibile la struttura cellulare completa.
Immunogold
I pellet per questa applicazione non necessitano di venire disidratati completamente perciò i
campioni venivano solo incubati con Etanolo al 70%. Questa parziale disidratazione permette di
mantenere gli epitopi proteici intatti garantendo un’ottima affinità di legame degli anticorpi di
interesse. In seguito i pellet venivano inclusi grazie ad una serie di incubazioni sia con resina pura
(resina LR White) (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) e in seguito con la medesima resina
addizionata ad un catalizzatore. Il campione ottenuto veniva tagliato in sezioni ultrassotili come per
l’analisi morfometrica. Le sezioni venivano lavate con una soluzione TBS 1X + BSA 1% + Tween
10% che era anche utilizzata per preparare tutte le altre soluzioni necessarie. In seguito, le sezioni
erano incubate in una soluzione di blocco (NGS diluito 1:5) in cui in seguito venivano diluiti 1:500
gli opportuni anticorpi primari. Dopo una incubazione O.N. a 4°C le sezioni con la soluzione
venivano fatte acclimatare per 1 h a R.T.. Dopo un lavaggio con TBS 1X + BSA 1% + Tween 10%
i retini venivano incubati con anticorpi secondari coniugati con particelle d’oro per 2 h a 37°C.
Dopo aver lavato e fatto asciugare i retini ogni sezione veniva contro colorata con acetato di
uranile 3% e con citrato di piompo in modo da rendere visibile la struttura cellulare.
RISULTATI
La distribuzione del DAT, di Sinapsina I e di Sinapsina III era modulata da α-sin in
neuroni mesencefalici primari dopaminergici.
La distribuzione del DAT, di Sinapsina I e III è stata valutata nelle colture primarie di neuroni
mesencefalici di topi C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd null per α-sin (DIV 11) mediante ICC in
doppia fluorescenza. Nei neuroni mesencefalici di topi C57BL/6J (FIG.1a) la marcatura per
Sinapsina III era molto intensa nei corpi cellulari e nei coni di crescita mentre la sua distribuzione
era uniforme e meno intensa nei processi dendritici. Il DAT presentava invece una distribuzione
puntiforme più diffusa nei corpi cellulari e nei processi dendritici mentre non era presente nei coni
di crescita. Inoltre le due proteine colocalizzavano solo parzialmente a livello dei corpi cellulari
(FIG.1a) ma non nei processi come mostrato nel merge. Nei neuroni primari di topi null per α-sin la
distribuzione di Sinapsina III era abbastanza uniforme sia nei corpi cellulari che nei processi.
Inoltre, in queste cellule, la distribuzione del DAT era molto diversa e non presentava un aspetto
puntiforme con una localizzazione non più uniforme a differenza di quanto osservato nei controlli.
Inoltre Sinapsina III e DAT colocalizzavano solo parzialmente all’interno dei corpi cellulari come
mostrato dal merge (FIG.1a). Risultati ottenuti dal nostro laboratorio hanno dimostrato che insulti
quali la GD sono in grado di modificare la distribuzione subcellulare del DAT e di α-sin
inducendone la traslocazione in inclusioni intracellulari in neuroni primari dopaminergici (Bellucci et
al., 2008). Abbiamo pertanto voluto valutare l’influenza della GD sulla distribuzione subcellulare di
Sinapsina III nei neuroni primari dopaminergici di controllo e null per α-sin. La GD influenzava in
modo significativo sia la distribuzione di Sinapsina III che quella del DAT nei neuroni primari
dopaminergici da topi C57BL/6J (FIG.1a). Infatti la GD induceva una aumentata immunoreattività
di Sinapsina III nei processi dendritici DAT-immunopositivi (FIG.1a). Un elevato grado di
colocalizzazione di Sinapsina III e DAT era visibile sia nei corpi cellulari che nei processi dendritici
(FIG.1a) rispetto alle cellule non sottoposte a GD. Il trattamento di GD invece non modificava la
distribuzione di Sinapsina III e del DAT nelle colture primarie da topi null per α-sin (FIG.1a). Sono
state ripetute le stesse analisi mediante ICC in doppia fluorescenza su colture primarie di neuroni
mesencefalici da topi C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd per valutare Sinapsina I. La distribuzione di
Sinapsina I nei neuroni primari dopaminergici da topi C57BL/6J mostrava un aspetto puntiforme
localizzato nella membrana cellulare e nei processi dendritici con un alto grado di colocalizzazione
con il DAT (FIG.1b). Nei neuroni dopaminergici dei topi C57BL/6J Ola/Hsd la Sinapsina I era
distribuita in modo più uniforme e colocalizzava con il DAT sia nei corpi cellulari che nei processi
dendritici come mostrato nel merge (FIG.1b). Come osservato per Sinapsina III anche la
distribuzione del DAT e di Sinapsina I era influenzata dalla GD nei neuroni primari mesencefalici
dopaminergici da topi C57BL/6J (FIG.1b). Nelle cellule sottoposte a GD la Sinapsina I era
concentrata in aree più immunoreattive e colocalizzava con il DAT come mostrato nel merge
(FIG.1b). Invece nei neuroni primari dopaminergici da topi null per α-sin né la distribuzione di
Sinapsina I né quella del DAT erano influenzati dalla GD (FIG.1b). Questi risultati suggeriscono
che la modulazione di Sinapsina I e del DAT era α-sin-mediata e che, in seguito alla sua
aggregazione, Sinapsina I era presente in inclusioni intracellulari DAT e α-sin immunopositive.
Per escludere che le alterazioni nella distribuzione di DAT e Sinapsina III osservate in topi
C57BL/6J Ola/Hsd fossero correlate a meccanismi compensatori e non alla semplice mancanza di
α-sin è stato eseguito il silenziamento genico di α-sin su colture primarie di neuroni mesencefalici.
Inoltre i neuroni sono stati sottoposti a GD per verificare se l’aggregazione di α-sin coincidesse
con la perdita di funzione della proteina e pertanto influenzasse la distribuzione di Sinapsina I e III
in modo analogo al silenziamento genico della proteina. Il silenziamento genico di α-sin alterava la
distribuzione subcellulare di Sinapsina III (FIG.1c), infatti era presente una immunopositività più
intensa e compatta se comparata con i neuroni di controllo dove Sinapsina III mostrava una
distribuzione puntiforme e colocalizzava parzialmente con α-sin. Il singolo trattamento di GD
induceva una compattazione dell’immunoreattività sia di α-sin che di Sinapsina III (FIG.1c). Infine
nei neuroni mesencefalici sottoposti sia a silenziamento genico che a GD, la distribuzione di
Sinapsina III era compatta similmente ai neuroni silenziati che non sono stati esposti alla GD
(FIG.1c). La distribuzione di Sinapsina I nelle cellule trattate con il siRNA (FIG.1d) non era
differente dai neuroni di controllo. Invece nelle cellule sottoposte a GD sia α-sin che Sinapsina I
mostravano una distribuzione più compatta e densa (FIG.1d) in confronto ai neuroni di controllo.
La GD non aveva effetti sulla distribuzione subcellulare di Sinapsina I nei neuroni primari
mesencefalici trattati con il siRNA (FIG.1d). Questa evidenza suggerisce che α-sin non modulava
significativamente la distribuzione di Sinapsina I in condizioni fisiologiche. Probabilmente
l’aggregazione di α-sin è in grado di influenzare la localizzazione di Sinapsina I attraverso
meccanismi indiretti.
Figura 1: Doppia marcatura in fluorescenza in colture primarie embrionali di neuroni mesencefalici
di controllo e sottoposti a GD di topi C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd per le seguenti combinazioni
di anticorpi: Sinapsina III e DAT (pannello a); Sinapsina I e DAT (pannello b) . Nei pannelli c e d
invece è mostrata la doppia marcatura in fluorescenza per Sinapsina III (pannello c) o Sinapsina I
(pannello d) associate ad α-sin nelle colture primarie di neuroni mesencefalici trattati con siRNA
(C57BL/6J siRNA), sottoposti a GD (C57BL/6J GD) e al siRNA + GD (C57BL/6J siRNA+GD).
Barra di calibrazione:60 µm (mostrata nel pannello a).
Il silenziamento genico di α-sin e insulti pro-aggreganti inducevano una alterata
espressione del DAT, Sinapsina I e Sinapsina III.
Tramite WB è stato valutato se il silenziamento del gene per α-sin e la GD alterassero non solo la
distribuzione ma anche i livelli del DAT (FIG.2a-c), Sinapsina I (FIG.2a-d) e Sinapsina III (FIG.2ae). Il silenziamento del gene per α-sin, confermato tramite WB (FIG.2a-b), induceva una
diminuzione statisticamente significativa dei livelli del DAT (FIG.2c) e un aumento significativo di
Sinapsina III (FIG.2e) (ANOVA ad una via con turkey post test: *P< 0.05). La GD induceva un
aumento statisticamente significativo dei livelli di Sinapsina III (FIG.2e) e di α-sin (FIG.2b)
(ANOVA ad una via con turkey post test: *P< 0.05). Il silenziamento del gene per α-sin seguito
dalla GD induceva un aumento statisticamente significativo dei livelli di Sinapsina III (FIG.2e)
(ANOVA ad una via con turkey post test: *P< 0.05). Il trattamento di GD, il silenziamento di α-sin e
la combinazione di entrambi i trattamenti invece non inducevano alcuna variazione statisticamente
significativa nei livelli di Sinapsina I (FIG.2d). I risultati ottenuti confermano che l’aggregazione di
α-sin coincideva con la perdita di funzione della proteina la quale induceva alterazioni significative
del traffico subcellulare e dei livelli di espressione sia di Sinapsina III che del DAT. I risultati
mostrati fino ad ora indicavano che α-sin modulava in modo statisticamente significativo il DAT e
Sinapsina III mentre l’effetto su Sinapsina I era dovuto a meccanismi indiretti. Perciò ci siamo
focalizzati sull’andamento di DAT e Sinapsina III.
Figura 2: WB indicativo dei livelli di α-sin, del DAT, di Sinapsina III e di Sinapsina I in estratti
proteici di neuroni mesencefalici di topi C57BL/6J, trattati con siRNA (C57BL/6J siRNA), sottoposti
a GD (C57BL/6J GD) e al siRNA + GD (C57BL/6J siRNA+GD) (pannello A). L’immunoblotting per
α-tubulina è riportato come controllo per un uguale caricamento dei differenti campioni di proteine.
In grafico (pannelli b,c,d,e) sono rappresentati i livelli medi delle quattro proteine.
La distribuzione e la densità di DAT e Sinapsina III erano differenti nello striato di
topi null per α-sin rispetto ad animali di controllo.
Studi di IHC associati ad analisi densitometriche a livello dello striato in topi C57BL/6J e C57BL/6J
Ola/Hsd hanno mostrato una ridistribuzione della marcatura relativa al DAT (FIG.3a) e Sinapsina
III (FIG.3b). I risultati ottenuti hanno dimostrato una diminuzione statisticamente significativa
dell’immunoreattività del DAT in topi null per α-sin di 12 mesi rispetto a animali di controllo come
confermato da analisi sensitometriche (ANOVA a due vie con Bonferroni post test: P<0.05)
(FIG.3c) . La presente osservazione è in linea con studi presenti in letteratura che indicano una
diminuzione di espressione del DAT in animali null per α-sin (Chadchankar et al., 2011). Inoltre la
distribuzione di Sinapsina III era più compatta nello striato di topi C57BL/6J Ola/Hsd di 8 e 12 mesi
rispetto ad animali di controllo mentre a 3 mesi la proteina risultava distribuita in modo simile tra i
due ceppi (FIG.3b). Questa osservazione è stata confermata da analisi densitometriche (FIG.3d)
che hanno dimostrato un aumenta densità di Sinapsina III in topi null per α-sin di 8 e 12 mesi
(ANOVA a due vie con Bonferroni post test: P<0.001). Invece animali C57BL/6J Ola/Hsd di 3 mesi
non mostravano differenze statisticamente significative nella densità di Sinapsina III rispetto ai
controlli (FIG.3d).
Figura 3: Doppia marcatura in fluorescenza per α-sin con DAT (pannello a) o Sinapsina III
(pannello b) in topi C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd di 3 (3mo), 8 (8mo) e 12 mesi (12mo). Barra di
calibrazione: 100 µm (mostrate nei pannelli a e b). Inoltre sono riportati i grafici relativi alle analisi
quantitative (espresse come % di densità ottica) dell’immunoreattività del DAT (pannello c) e di
Sinapsina III (pannello d) nello striato di topi C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd.
Topi C57BL/6J Ola/Hsd di 12 mesi mostravano una riduzione dei livelli di DA a
livello striatale.
Grazie ad esperimenti di microdialisi verticale accoppiati a dosaggi in HPLC è stato possibile
misurare i livelli striatali di DA nei topi C57BL/6J Ola/Hsd null per α-sin e nei topi di controllo
C57BL/6J (FIG.4). Si noti come i livelli di DA rilasciati in seguito a depolarizzazione aumentino
rispetto ai livelli basali in entrambi i ceppi indicando un corretta risposta alla depolarizzazione. I
livelli medi extracellulari di DA, rilasciata in seguito ad uno stimolo depolarizzante, erano superiori
in topi C57BL/6J rispetto ad animali null per α-sin. In entrambi i ceppi il wash out riportava i livelli
rilasciati a quelli in condizioni basali e infine il trattamento con TTX spegneva correttamente il
segnale. Questi esperimenti dimostravano che l’assenza di α-sin influenzava in modo negativo i
meccanismi di rilascio di DA a livello dei terminali pre-sinaptici portando ad una riduzione della
funzionalità dei neuroni dopaminergici nigro-striatali. Ciò confermerebbe l’importanza della proteina
nei processi di controllo del rilascio vescicolare. Inoltre i livelli medi dei principali metaboliti di DA
quali acido diidrossifenilacetico (DOPAC) e acido omovanillico (HVA) erano aumentati, sia in
condizioni basali sia dopo uno stimolo depolarizzante, in topi null per la proteina (FIG.4). Questo
risultato potrebbe indicare che oltre ai meccanismi di rilascio anche il metabolismo della DA
potrebbe subire delle alterazioni in mancanza di α-sin.
Figura 4: Livelli extracellulari di DA (nM), DOPAC e HVA (% di variazione) misurati nello striato di
topi di controllo C57BL/6J e null per α-sin C57BL/6J Ola/Hsd (in questo grafico nominati come
C57BL/6S). I livelli sono stati misurati in condizioni basali (BASALE), in seguito a depolarizzazione
indotta da aCSF-K+ (K+ ), durante il wash out (BASALE) e in seguito al trattamento con
tetrodotossina 1uM (TTX).
I topi null per α-sin mostravano una differente risposta locomotoria al trattamento
con cocaina o GBR-12935.
Per valutare se le alterazioni osservate nei livelli e nelle distribuzione di DAT e Sinapsina III
associate alla mancanza di α-sin, potessero indurre delle alterazioni nella risposta locomotoria a
stimolanti specifici abbiamo utilizzo il paradigma dell’ “open field”. Sono stati testati due diversi
bloccanti del DAT quali la cocaina e il GBR-12935 in animali di 3-8-12 mesi. La cocaina è stata
dimostrata aumentare i livelli extracellulari di DA attraverso un meccanismo indipendente dal
semplice blocco del reuptake e che coinvolge la mobilizzazione di un pool di riserva di vescicole
contenenti DA che sono sinapsine-dipendenti (Venton et al., 2006). La somministrazione di
cocaina in animali di 3 mesi non induceva un aumento significativo della risposta locomotoria in
animali null per α-sin (FIG.5) mentre il trattamento di animali di 12 mesi ha dimostrato che il picco
di risposta locomotoria acuta di topi C57BL/6J Ola/Hsd era superiore e più duraturo rispetto a
quella di topi di controllo (FIG.5). La differente risposta osservata in topi C57BL/6J Ola/Hsd
potrebbe essere dovuta alla minore espressione del DAT presente nei topi C57BL/6J Ola/Hsd (dati
non mostrati) che porterebbe ad una minore ricaptazione di DA. Inoltre i bassi livelli di DA rilasciata
nei topi C57BL/6J Ola/Hsd (come mostrato precedentemente dagli esperimenti di microdialisi)
potrebbero aver indotto dei meccanismi di compensazione quali una supersensitività
dopaminergica post-sinaptica. Nei topi null per α-sin, il trattamento con cocaina potrebbe inoltre
indurre una maggiore risposta locomotoria grazie alla mobilizzazione dei pools vescicolari
sinapsina-mediati e questo effetto potrebbe essere superiore in questo ceppo in quanto mostra
una maggiore espressione di Sinapsina III. In seguito al blocco del DAT cocaina-mediato, la DA
rilasciata si accumulerebbe a livello sinaptico e agirebbe su un numero superiore di recettori
dopaminergici presenti nel terminale post-sinaptico. Infine è stata valutata anche la risposta
locomotoria acuta al GBR-12935 (FIG.6) che, a differenza della cocaina, blocca in modo selettivo il
DAT senza agire sui pools vescicolari. In questo modo è possibile valutare in maniera più precisa
l’influenza del trasportatore sui meccanismi sinaptici in assenza di α-sin e l’eventuale
coinvolgimento delle sinapsine. In questo caso non erano presenti differenze statisticamente
significative in topi C57BL/6J Ola/Hsd rispetto ad animali di controllo (FIG.6). Il blocco selettivo del
DAT in associazione ai suoi bassi livelli di espressione potrebbero appiattire la risposta
locomotoria al GBR-12935. Quest’ultimo risultato dunque non conferma l’ipotesi di una
supersensitività post-sinaptica. In realtà questo è solo un dato preliminare che deve essere ripetuto
perciò gli esperimenti di open field proseguiranno per confermare i risultati ottenuti.
Figura 5: Grafico che rappresenta la distanza totale percorsa da topi C57BL/6J Ola/Hsd e
C57BL/6J di 3, 8, 12 mesi. L’esperimento è stato svolto in condizioni basali (periodo di abituazione
di 10 min) ed in seguito alla somministrazione di cocaina (10 mg/Kg i.p.) o, come controllo, di
soluzione salina (NaCl 0.9% i.p.). Si noti la maggiore risposta dei topi null per α-sin rispetto ai
controlli.
Figura 6: Grafico che rappresenta la distanza totale percorsa da topi C57BL/6J Ola/Hsd e
C57BL/6J di 12 mesi. L’esperimento è stato svolto in condizioni basali (periodo di abituazione di 10
min) ed in seguito alla somministrazione di GBR-12935 (10 mg/Kg i.p.) o, come controllo, di
soluzione salina (NaCl 0.9% i.p.). Non era visibile una differenza statisticamente significativa nella
risposta locomotoria in seguito a somministrazione di GBR-12935 tra i due ceppi osservati.
Risultati preliminari relativi ad esperimenti di microscopia elettronica confermavano
la presenza di differenze nell’assetto dei pools vescicolari sinaptici in animali null
per α-sin.
Per confermare la nostra ipotesi circa una modulazione α-sin mediata nella localizzazione ed
espressione di Sinapsina III e dunque nei meccanismi di rilascio vescicolare sono in corso di
svolgimento esperimenti di microscopia elettronica tramite la tecnica dell’immunogold e di analisi
morfometriche in collaborazione con la Prof.ssa Rita Rezzani e la Dott.ssa Stefania Castrezzati
(Sezione di Anatomia, Dipartimento di Scienze Cliniche e Sperimentali, Università degli Studi di
Brescia). Oltre all’analisi di neuroni mesencefalici dopaminergici di controllo relativi ad animali
C57BL/6J e C57BL/6J Ola/Hsd, i campioni analizzati comprendono neuroni sottoposti a GD e/o
silenziamento per α-sin. Grazie all’utilizzo di tutte queste condizioni sperimentali sarà possibile
valutare l’assetto delle vescicole sinaptiche e la reale localizzazione subcellulare delle proteine di
interesse in condizioni di controllo e in seguito alla mancanza e/o alla aggregazione di α-sin. I dati
preliminari raccolti fino ad ora ci hanno permesso di visualizzare una differenza nella
localizzazione di Sinapsina III a livello delle vescicole sinaptiche in topi C57BL/6J Ola/Hsd che
mostravano inoltre un diverso assetto dei pools vescicolari (dati non mostrati). Per valutare se
questo diverso assetto potesse avere un effetto sulla funzionalità dei neuroni dopaminergici le
colture primarie sono state anche trattate con cocaina (10 µM) o GBR-12935 (20 nM) per valutare
in modo diretto i meccanismi di rilascio e movimento delle vescicole sfruttando un approccio simile
a quello mostrato nel lavoro di Tao-Cheng et al. (2006).
DISCUSSIONE
I risultati ottenuti mostrano che α-sin è in grado di regolare l’assetto dei terminali pre-sinaptici nei
neuroni dopaminergici modulando in maniera diversa l’espressione e la localizzazione subcellulare
di due proteine chiave: Sinapsina III e DAT che sono rispettivamente coinvolte nella regolazione
dei pool vescicolari e della ricaptazione della DA. Le alterazioni dei livelli di espressione e di
distribuzione del DAT, di Sinapsina I e di Sinapsina III sono state osservate sia in colture primarie
di neuroni mesencefalici, un buon modello di sviluppo neuronale, sia nel cervello di topi C57BL/6J
di controllo e topi null per α-sin C57BL/6J Ola/Hsd. I risultati ottenuti indicano che gli animali null
per α-sin mostravano una ridistribuzione ed un aumento statisticamente significativo della densità
di Sinapsina III. Allo scopo di escludere che le alterazioni nell’espressione e distribuzione di DAT e
Sinapsina III osservate in topi C57BL/6J Ola/Hsd fossero strettamente correlate alla mancanza di
α-sin e non ad altri meccanismi compensatori che potrebbero essere presenti in questi animali, è
stato eseguito il silenziamento genico di α-sin nelle colture primarie di neuroni mesencefalici.
Utilizzando studi di ICC e WB su colture primarie di neuroni mesencefalici in condizioni basali e
sottoposti a silenziamento abbiamo potuto osservare che la mancanza di α-sin modificava la
distribuzione e l’espressione di Sinapsina III e del DAT, confermando il suo ruolo modulatorio su
queste proteine. Per valutare se oltre alla semplice mancanza della proteina anche una sua perdita
di funzione potesse regolare Sinapsina III, i neuroni di topi di controllo C57BL/6J sono stati
sottoposti a GD, un insulto in grado di aumentare l’espressione e l’aggregazione di α-sin nonché di
indurne modificazioni post-traduzionali quali il taglio C-terminale (Bellucci et al., 2008; Bellucci et
al., 2011). In seguito all’aggregazione di α-sin in inclusioni DAT-immunopositive a livello dei corpi
cellulari e dei processi dendritici, era visibile una ridistribuzione di Sinapsina III. Ciò suggerisce che
alterazioni specifiche a carico di queste proteine possono verificarsi nei primi stadi della MP in
associazione all’aggregazione e perdita di funzione di α-sin. I risultati ottenuti confrontando le
colture neuronali da topi C57BL/6J Ola/Hsd prive di α-sin con le colture neuronali da topi
C57BL76J e quelle sottoposte a silenziamento, indicano che α-sin interagiva e modulava
l’espressione e la distribuzione subcellulare di Sinapsina III e del DAT nei neuroni dopaminergici.
Nelle medesime condizioni sperimentali è stata valutata l’espressione e la distribuzione di
Sinapsina I, un membro del proteoma sinaptico di α-sin che di conseguenza potrebbe essere
influenzato dalle modificazioni patologiche di quest’ultima. La distribuzione di Sinapsina I non era
significativamente alterata dalla mancanza di α-sin. Ciò potrebbe essere dovuto a meccanismi
compensatori nei topi C57BL/6J Ola/Hsd oppure ad un effetto indiretto esercitato dalla mancanza
di -sin sulla localizzazione subcellulare di Sinapsina I. Inoltre il silenziamento di -sin, a
differenza di quanto osservato per DAT e Sinapsina III, non alterava significativamente la
localizzazione di Sinapsina I. La Sinapsina I dunque non sembra essere specificatamente
implicata nella patofisiologia del deficit dopaminergico. Questa ipotesi è supportata da studi che
hanno mostrato che i livelli di Sinapsina I nello striato di pazienti di MP sono comparabili con quelli
di soggetti di controllo (Girault et al., 1989). In linea con queste osservazioni i nostri studi di WB
non evidenziano effetti significativi sui livelli di Sinapsina I in mancanza di α-sin. In presenza di αsin la localizzazione subcellulare di Sinapsina I è comunque influenzata da insulti quali la GD.
Questa evidenza suggerisce che α-sin non modulava la distribuzione di Sinapsina I in condizioni
fisiologiche nonostante l’aggregazione di α-sin sia in grado di influenzare la distribuzione di
Sinapsina I probabilmente attraverso meccanismi indiretti. A livello delle sinapsi dopaminergiche
sembrerebbe invece avere un significato rilevante l’alterazione di Sinapsina III che è l’isoforma
maggiormente espressa nei terminali dopaminergici striatali. Infatti similmente al DAT,
l’aggregazione patologica di α-sin ne alterava la distribuzione che era più uniforme nei corpi
cellulari e nei processi dendritici dei topi C57BL/6J Ola/Hsd rispetto ai controlli, dove presentava
una distribuzione più puntiforme. L’aumento dell’espressione di Sinapsina III nelle sinapsi
dopaminergiche striatali potrebbe essere associato alla riduzione o alla perdita del rilascio di DA
dato che Sinapsina III, come α-sin, è un regolatore negativo di questo processo (Kile et al., 2010).
Grazie a studi di microdialisi verticale associati a dosaggi in HPLC abbiamo identificato una
riduzione statisticamente significativa dei livelli di DA rilasciata in topi null per α-sin che inoltre
mostravano differenti risposte locomotorie in seguito alla somministrazione di cocaina o di GBR12935. In particolare questi animali rispondevano in modo significativo alla somministrazione di
cocaina che oltre a bloccare il DAT è in grado di stimolare il rilascio di DA mobilizzando un pool
vescicolare di riserva sinapsina-dipendente (Venton et al., 2006). Infatti animali ko per le sinapsine
mostrano una riduzione del rilascio di DA-cocaina indotto (Kile et al., 2010). L’aumento di
Sinapsina III osservato nei terminali striatali di animali C57BL/6J Ola/Hsd potrebbe dunque essere
la causa della loro aumentata risposta al trattamento con cocaina. Inoltre, nonostante la
significativa risposta alla cocaina, i topi null per α-sin non mostravano una risposta locomotoria
significativamente diversa rispetto ad animali di controllo. Questo risultato potrebbe essere
relazionato alla diminuzione dell’espressione di DAT età dipendente in topi C57BL/6J Ola/Hsd che
è stata determinata grazie ad esperimenti di IHC e conferma altri risultati presenti in letteratura
(Chadchankar et al., 2011) che potrebbe correlare con una riduzione del riciclo di DA. Un’altra
possibile causa potrebbe essere l’aumento di Sinapsina III, sempre confermato tramite IHC, che
infatti agirebbe come modulatore negativo del rilascio di DA. Inoltre è stato anche identificato un
aumento dei livelli dei principali metaboliti della DA quali DOPAC e HVA e ciò potrebbe indicare un
aumento del turnover di DA, un fenomeno che è stato precedentemente descritto in animali ko per
DAT (Benoit-Marand, 2000). Le alterazioni osservate negli esperimenti di comportamento e di
microdialisi ci hanno portato ad ipotizzare delle possibili alterazioni a livello dei pool vescicolari e
per valutare ciò sono in corso esperimenti di microscopia elettronica in collaborazione con la
Prof.ssa Rita Rezzani e la Dott.ssa Stefania Castrezzati (Sezione di Anatomia, Dipartimento di
Scienze Cliniche e Sperimentali, Università degli Studi di Brescia) per delineare la localizzazione
delle vescicole e delle proteine ad esse associate. I dati preliminari ottenuti mostrano delle
differenze nell’assetto vescicolare in animali null per α-sin. Tutte queste evidenze supportano
l’ipotesi che la patologia sinaptica α-sin-dipendente abbia importanti implicazioni nella patogenesi
della MP, poiché potrebbe alterare significativamente i meccanismi di rilascio e riciclo della DA nei
neuroni dopaminergici durante lo sviluppo e in età adulta. Infatti, l’aggregazione e la perdita di
funzione di α-sin a livello dei terminali sinaptici dopaminergici potrebbero alterare la corretta
distribuzione subcellulare e i livelli di espressione di molecole sinaptiche chiave, quali DAT e
Sinapsina III e probabilmente in via indiretta anche di Sinapsina I. E’ possibile perciò ipotizzare che
mentre in condizioni fisiologiche α-sin modula la localizzazione e la funzionalità di alcuni membri
del suo proteoma sinaptico tra cui DAT e Sinapsina III, in seguito al suo accumulo o a
modificazioni conformazionali nelle prime fasi della MP che ne inducono l’aggregazione, si
potrebbe verificare un’alterazione di questo meccanismo che porterebbe ad una regolazione
aberrante delle proteine a lei associate ed al conseguente blocco del rilascio di DA con
degenerazione dei terminali sinaptici.
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Elenco delle pubblicazioni:
Bellucci A., Fiorentini C., Zaltieri M., Missale C., Spano PF. The “in situ” proximity ligation
assay to probe protein-protein interactions in intact tissues. To be published in the Book
“Methods in Molecular Biology”, Issue Exocytosis and Endocytosis, Second Edition, edited by
Andrei Ivanov, Springer Science Humana Press, in press.
Zaltieri M., Spano PF., Missale C., Bellucci A. The proximity ligation assay: an high throughput
technique for protein analysis in neuroscience. To be published in the Book “Neural Stem Cell
Research” edited by Kaur Navjot and Mohan Vemury. Wiley Blackwell, Hoboken, NJ, USA, in
press.
Bellucci A., Zaltieri M., Navarria L., Grigoletto J., Missale C. and Spano PF. From alphasynuclein to synaptic dysfunctions: new insights into the pathophysiology of Parkinson's disease.
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pathology and its implications in the development of novel therapeutic approaches to cure
Parkinson's disease. Brain Res. 2012 Jan 13;1432:95-113.
Bellucci A., Navarria L., Falarti E., Zaltieri M., Missale C., Spillantini MG. and Spano PF.
Redistribution of DAT/α-synuclein complexes visualized by "in situ" proximity ligation assay in
transgenic mice modelling early Parkinson's disease. PLoS One. 2011;6(12):e27959.
Bellucci A., Navarria L., Zaltieri M., Falarti E., Bodei S., Sigala S., Battistin L., Spillantini MG.,
Missale C. and Spano PF.Induction of the unfolded protein response by alpha-synuclein in
experimental model of Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry 2011 Feb;116(4):588605.
Abstracts presentati a congressi nazionali e internazionali durante il secondo anno
del corso di dottorato in Neuroscienze:
1) Alpha-synuclein regulates dopaminergic synapse arrangement and functionality by
modulating synapsin III and the dopamine transporter.
Michela Zaltieri1, Jessica Grigoletto1, Laura Navarria1, Cristina Missale1, PierFranco Spano1,2 and
Arianna Bellucci1
1
Division of Pharmacology, Department of Molecular and Translational Medicine and National
Institute of Neuroscience, University of Brescia, Brescia, Italy; 2 IRCCS S. Camillo Hospital, Venice,
Italy
Dopamine 2013, Alghero, Italy, May 24-28, 2013.
2) Reciprocal modulation of alpha-synuclein, synapsins and dopamine transporter in
developing and mature dopaminergic neurons.
Grigoletto J.1, Zaltieri M. 1, Navarria L. 1, Missale C. 1, Spano PF. 1,2 and Bellucci A. 1
1
Division of Pharmacology, Department of Molecular and Translational Medicine and National
Institute of Neuroscience, University of Brescia, Brescia, Italy; 2 IRCCS S. Camillo Hospital, Venice,
Italy
11th AD/PD, International Conference on Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases. Florence,
Italy, March 6-10, 2013.
Elenco delle lezioni-seminari frequentati durante il secondo anno del corso di
dottorato in Neuroscienze:
Brescia, 23 Novembre 2012 , Dr. Antal Rot: “Pathophysiological role of atypical
chemokine receptors”
Brescia, 05 Dicembre 2012, Dr. Roberto Ronca: “Long-pentraxin 3 (PTX3) as a natural
antiangiogenic, antitumor agent”
Brescia, 18 Dicembre 2012, Dr. Stefano Pluchino: “Studying the therapeutic plasticity of
neural stem cells at nanoscale”
Brescia, 23 Gennaio 2013, Dr. Gabriele Candiani “Non-viral gene delivery: a “ménage à
trois” among nucleic acids,materials, and the biological environment”
Brescia, 7 Febbraio 2013, Dr. Mark Slevin “Epigenetic mechanisms for the control of
angiogenesis”
Brescia, 15 Aprile 2013, Dott. Luca Mollica: “NMR-spectroscopy and computer
simulations of biomolecules: an essential handshake between two disciplines”
Brescia, 31 Maggio 2013, Prof.Bruce Yu: “Development of Novel Imaging Agents and
Biomaterials”
Brescia, 20 Giugno 2013, Dott.ssa Emanuela Gobbi, sez Biotecnologie unità
agroalimentare, Università degli Studi di Brescia: “Dalla micologia alle nanotecnologie”
Brescia, 2 Luglio 2013, Prof. Nader G Abraham: “Heme oxygenase: discovery and
clinical significance in diabetes and cardiovascular disease"
Brescia, 19 settembre 2013, Dr Peter Vanhoutte, Universitè Pierre et Marie Curie:
“Dopamine-glutamate receptor interplay modulates striatal signaling and responses
to cocaine”
Elenco dei corsi/aggiornamenti frequentati durante il secondo anno del corso di
dottorato in neuroscienze:
Brescia, 9-10/20-21 Maggio 2013, Prof. Adrian Wallwork: “Corso di inglese scientifico”.
Brescia, 2-6 Settembre 2013, Prof. Angelo Varni, Prof. Fabrizio Benacchi, Prof. Marco Roccetti, Marco
Zanichelli “Summer School: Comunicare la scienza.”
Brescia, 16, 18, 20, (23, 25 in corso) Settembre 2013, Prof. Elisabetta Ceretti, Prof. Claudio Giardini,
Dr. Antonio Fiorentino: “Design of experiments-DOE.”
