L`APOPTOSI LINFOCITARIA NELL`INFARTO MIOCARDICO ACUTO

L’apoptosi linfocitaria nell’infarto miocardico acuto
senza sopraelevazione del tratto ST
Anna Laura Pasqui, Michela Di Renzo, Giovanni Bova, Luca Puccetti, Fulvio Bruni, Marco Saletti,
Marcello Pastorelli, Maria Serena Verzuri, Alberto Auteri
It is well known that lymphocytes play a major role in coronary plaque destabilization in acute
coronary syndromes. The aim of this study was to evaluate circulating lymphocyte apoptosis in
patients with non-ST elevation myocardial infarction (NSTEMI) in comparison with subjects with
stable angina and with healthy controls. We considered spontaneous lymphomonocyte apoptosis (evaluated by ELISA), interleukin (IL)-2 production (evaluated by ELISA), Fas expression on
T cells (evaluated by flow cytometry) and Fas ligand mRNA (evaluated by reverse transcriptase
polymerase chain reaction), as well as Fas functionality. To evaluate T-cell activation, we also investigated T-cell subpopulations (CD4/CD8 ratio), T-cell surface HLA-DR and CD69 expression (evaluated by flow cytometry) in blood taken within 6 hours from onset of NSTEMI.
Spontaneous apoptosis was significantly increased in NSTEMI patients in comparison with the
two control groups and it was associated with an increased expression of Fas, an increased susceptibility to the Fas agonist (CH-11) and a normal production of IL-2 in cell cultures. We also
found a significant increase of HLA-DR+ CD3+ and CD69+ CD4+ cells in NSTEMI patients.
These data suggest that the enhanced apoptosis is due to a mechanism of “active” antigen-driven
death, induced by the expression of death cytokines and not by the failure of cell growth factors.
We conclude that in case of NSTEMI peripheral lymphocytes are activated and undergo an
enhanced programmed cell death due to activation mechanisms. It is likely that lymphocyte
activation occurs before the onset of acute ischemia and contributes to the plaque rupture and
to the myocardial ischemic insult.
(Ann Ital Med Int 2003; 18: 154-161)
Key words: Apoptosis; Non-ST elevation myocardial infarction; T lymphocytes.
ca hanno evidenziato aree ricche in macrofagi e linfociti
T attivati significativamente più alte nei pazienti con angina instabile rispetto a quelli con angina stabile7,8. In arterie coronarie trombizzate di soggetti deceduti per infarto
miocardico entro 2 giorni dall’esordio, nonostante la variabilità morfologica delle placche sottostanti la trombosi, macrofagi e linfociti T costituivano gli elementi dominanti nel sito di rottura della placca e queste regioni erano particolarmente ricche di antigeni HLA-DR9. In corso di angina instabile è stato evidenziato un incremento di
linfociti CD4+ e CD8+ produttori di interferone-γ quali segni di attivazione linfocitaria che sembra precedere l’insorgenza dell’ischemia miocardica10.
Scopo di questo studio è stato quello di valutare l’attivazione dell’apoptosi in corso di infarto miocardico acuto (IMA) correlato con i segni dell’attivazione linfocitaria. Abbiamo pertanto considerato un gruppo omogeneo
di soggetti affetti da infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST (NSTEMI), secondo recenti criteri
dell’American College of Cardiology/American Heart
Association11, che sono stati confrontati con due gruppi
di controllo di pazienti con angina stabile e soggetti normali. Abbiamo cercato di chiarire i possibili meccanismi
coinvolti nella morte cellulare programmata che potevano costituire un’ulteriore definizione dei fenomeni di at-
Introduzione
L’apoptosi è un meccanismo di morte cellulare programmata caratterizzato dalla fagocitosi della cellula senza il rilascio del suo contenuto e di conseguenza senza reazione infiammatoria. È ampiamente documentato come
l’apoptosi di linfociti B e T rappresenti un meccanismo di
primaria importanza nello sviluppo e nell’omeostasi del sistema immunitario e risulti sempre coinvolta quando è presente un’attivazione della risposta immunitaria linfomonocitaria. Vari sono i meccanismi cellulari e umorali coinvolti nell’apoptosi con attivazione di mediatori e recettori
cellulari che trovano varia modulazione e che arrivano a configurare diversi tipi e modalità del processo apoptotico ma
che comunque risultano sempre collegati ai fenomeni di attivazione o di inibizione dei linfomonociti1-4.
In corso di aterosclerosi i linfociti sono ampiamente coinvolti nei processi di destabilizzazione della placca. Varie
evidenze esistono riguardo alla loro presenza nelle placche coronariche e al loro ruolo in corso di sindromi coronariche acute5,6. Analisi di immunoistochimica su placSezione di Semeiotica Medica (Direttore: Prof. Alberto Auteri),
Dipartimento di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche,
Università degli Studi di Siena
© 2003 CEPI Srl
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Anna Laura Pasqui et al.
Parametri infiammatori ed immunologici
tivazione dei linfomonociti nella destabilizzazione della
placca e nella conseguente emergenza delle manifestazioni
cliniche.
Tipizzazione linfocitaria e marker di membrana. Le sottopopolazioni linfocitarie e i marker di superficie sono
stati analizzati in citofluorimetria usando le metodiche
standard per la simultanea, diretta, doppia colorazione in
immunofluorescenza. Sono stati usati gli anticorpi monoclonali coniugati con isotiocianato di fluoresceina (FITC)
e con ficoeritrina (PE, Becton Dickinson Immunocytometry
System, San Jose, CA, USA) ed in particolare: controllo
isotipico, CD3 FITC/CD4 PE, CD3 FITC/CD8 PE, CD3
FITC/HLA-DR PE, CD69 FITC/CD4 PE, CD69 FITC/
CD8; 20 µL di ogni anticorpo monoclonale erano aggiunti
a 100 µL di sangue fresco trattato con EDTA. La miscela
di sangue intero e anticorpo monoclonale veniva agitata e
quindi incubata a temperatura ambiente per 20 min al
buio. Successivamente 2 mL di soluzione lisante (FACS)
erano aggiunti ed incubati per altri 10 min nelle stesse condizioni ambientali. Quindi la sospensione cellulare veniva centrifugata per 5 min a 300 g, il sopranatante aspirato e il pellet risospeso in paraformaldeide all’1% per la
fissazione. Per l’acquisizione dei dati era impiegato un citofluorimetro Facstar plus (Becton Dickinson
Immunocytometry System); erano acquisiti un minimo di
10 000 eventi totali e veniva usato il software LYSIS II e
il reagente LeucoGATE (CD45/CD14) per ottenere un
gate di analisi che includeva almeno il 95% di linfociti e
non più del 5% di monociti per campione.
Materiali e metodi
Caratteristiche dei pazienti
Sono stati studiati 30 soggetti di età media 68 ± 5 anni
affetti da IMA con le caratteristiche di NSTEMI. La scelta dei pazienti con NSTEMI è stata motivata dalla selezione
di un gruppo omogeneo di soggetti che sono stati confrontati con 24 pazienti affetti da cardiopatia ischemica cronica (angina stabile) e 15 volontari sani di analoghe caratteristiche (Tab. I). Tutti i pazienti sono stati sottoposti
all’ingresso a valutazione clinica, elettrocardiogramma a
12 derivazioni, radiogramma del torace, ecocardiogramma, prelievo di sangue venoso periferico.
La diagnosi di IMA era posta in base alla positività di
criteri clinici, elettrocardiografici e laboratoristici. Come
criterio clinico era considerato la presenza da almeno 20
min di dolore localizzato in regione mediosternale o senso di costrizione toracica con possibile irradiazione al
giugulo, alla spalla, all’arto superiore sinistro o a entrambe le braccia. Dal punto di vista elettrocardiografico
i soggetti presentavano sottolivellamento del tratto ST
< -0.1 mV (-1 mm) in due o più derivazioni contigue con
inversione dell’onda T. Erano considerati indici laboratoristici positivi: troponina T > 0.2 µg/L, creatinfosfochinasi (CPK) > 190 mg/dL con isoforma miocardio-specifica (CPK-MB) > 10% del totale.
Tutti i pazienti non presentavano infezioni acute o croniche batteriche o virali. Tutti infine hanno dato il consenso
informato allo studio in oggetto.
I prelievi per lo studio delle funzioni linfomonocitarie
sono stati eseguiti al momento dell’ingresso in clinica
che corrispondeva ad un periodo entro 6 ore dall’emergenza clinica dell’infarto.
Colture cellulari. I linfomonociti erano isolati da sangue intero eparinizzato mediante centrifugazione su gradiente di densità in Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala,
Svezia). Quindi le cellule erano messe in coltura in terreno
di coltura RPMI 1640 con aggiunta di siero bovino fetale (10%), L-glutamina (2 mM), penicillina-streptomicina
(100 U/mL, 100 µg/mL, rispettivamente, Gibco, Paisley,
Gran Bretagna). In alcuni esperimenti era aggiunta alle cellule IL-2 umana ricombinante (100 UI/mL, Pharmingen,
San Diego, CA, USA).
TABELLA I. Caratteristiche dei pazienti.
Età media (anni)
Sesso (M/F)
Diabete (n =)
Dislipidemia (n =)
Fumatori (n =)
Ipertensione (n =)
Troponina T (µg/L)
CPK-MB (U/L)
NSTEMI
(n = 30)
Angina stabile
(n = 24)
Controlli
(n = 15)
68 ± 5
16/14
6
9
9
6
0.24 ± 0.6
57 ± 16
67 ± 4
13/11
7
8
8
6
< 0.06
10 ± 6
69 ± 4
9/6
0
2
6
5
< 0.06
10 ± 6
CPK-MB = creatinfosfochinasi isoforma miocardio-specifica; NSTEMI = infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST.
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Ann Ital Med Int Vol 18, N 3 Luglio-Settembre 2003
ta l’amplificazione della β-actina nelle stesse condizioni.
La sequenza dei primers (Pharmacia) era la seguente (in
un orientamento 5’-3’): β-actina: 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA e 3’-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG; Fas ligando
(FasL): 5’-ATTCTTTGTTACAGGCACCG e 3’GAGTTGATTGTCAGGAAGCA.
I prodotti amplificati erano analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1.5% e visualizzati con raggi ultravioletti dopo colorazione con bromuro di etidio. Il
FasL era 696 bp, la β-actina era 661 bp. Le bande erano
quantificate con il programma Imagequant e veniva calcolato il rapporto β-actina/FasL.
Apoptosi. L’apoptosi spontanea dei linfomonociti era valutata dopo 72 ore di coltura dopo aver controllato le condizioni di vitalità cellulare mediante Trypan blue. Veniva
impiegato il metodo ELISA secondo le istruzioni fornite
nel kit (Cell Death Detection ELISAPLUS, Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Germania). In breve, un pellet di 20 000 cellule era ottenuto dalle colture,
quindi le cellule erano lisate e nel sopranatante erano valutati i frammenti apoptotici di DNA associati agli istoni;
la densità ottica a 405 nm indicava il grado della frammentazione del DNA.
Espressione del Fas (CD95). La determinazione dei
linfociti Fas positivi veniva eseguita con metodo citofluorimetrico mediante doppia e simultanea colorazione
in immunofluorescenza. Dopo due fasi di lavaggio in
phosphate buffer solution (PBS) le cellule erano incubate con gli anticorpi monoclonali anti-CD3 marcato con
FITC e con anti-Fas marcato con PE (Becton Dickinson)
per 30 min a 4°C al buio. Immunoglobuline (Ig)G di topo marcate con gli stessi fluorocromi erano usate come
controllo isotipico. Dopo l’incubazione le cellule erano lavate due volte in PBS; l’acquisizione al citofluorimetro veniva effettuata su campioni di 5000 cellule: veniva disegnato il gate di analisi sui linfociti in base alle loro caratteristiche fisiche e veniva valutata la percentuale di cellule con doppia positività (CD3+ Fas+).
Apoptosi indotta da Fas. I linfomonociti appena isolati erano stimolati per 16 ore con 1 µg/mL di CH-11
(Upstate, Lake Placid, NY, USA), un anticorpo IgM anti-Fas o con un IgM di controllo (Upstate). L’apoptosi dei
linfomonociti era valutata in ELISA (Cell Death Detection
ELISAPLUS, Roche Molecular Biochemicals) come sopra
descritto.
Sintesi di interleuchina-2. Il sopranatante del terreno di
coltura raccolto dopo 16 ore di stimolazione con PHA (5
µg/mL, Sigma, Milano, Italia) è stato testato per la produzione di IL-2 in ELISA usando piastre da ELISA
(Corning Easy Wash) ricoperte per tutta la notte con 2
µg/mL di anticorpo monoclonale anti-IL-2 capture
(Pharmingen) in tampone Na2HPO4 0.1 M a pH 9 e bloccate con PBS/Tween. Era usato un anticorpo anti-IL-2 legato con la biotina (Pharmingen) alla concentrazione di 1
µg/mL in PBS con 10% di fetal calf serum. Le piastre sono state sviluppate adoperando avidina-HRP (Vector,
Burlingame, CA, USA) e come substrato 2.2 azino-bis
(Sigma). La concentrazione di IL-2 più bassa dosabile era
15.6 pg/mL.
Analisi del Fas ligando con metodica di reazione polimerasica a catena a transcriptasi inversa. L’RNA totale
era estratto dai linfociti immediatamente dopo la separazione cellulare usando Trizol (Gibco): 1 µg di RNA era
sottoposto a trascrizione inversa mediante incubazione a
42°C per 45 min in 20 µL di buffer contenente Tris 10 mM
pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 10 mM, dATP,
dCTP, dGTP e dTTP 1 mM ciascuno, 0.5 µg di oligo(dT)
15 (Gibco) e 200 U/mL di transcriptasi inversa M-MLV
(Gibco). La reazione era bloccata da inattivazione al calore a 99°C per 5 min e raffreddamento in ghiaccio.
Successivamente 1 µL dei prodotti del cDNA erano amplificati con la reazione polimerasica a catena (PCR) in 25
µL di Tris 10 mM pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM,
dATP, dCTP, dGTP e dTTP 200 mM ciascuno, in presenza
degli specifici primers di sequenza alla concentrazione di
6.5 pmol ciascuno e di 1.25 U di Taq polimerasi (FastTaq,
Roche Molecular Biochemicals). L’amplificazione era
eseguita per 32 cicli dopo denaturazione per 10 min a 95°C.
Ogni ciclo di PCR comprendeva 1 min di denaturazione
a 95°C, 1 min di annealing a 58°C e 1 min di estensione/sintesi a 72°C in termociclizzatore (Omn-E). Tutti i cicli di PCR erano conclusi con un’ulteriore fase di estensione a 72°C per 10 min. Come controllo veniva esegui-
Analisi statistica
In relazione alla distribuzione non parametrica dei dati, per comparare i dati ottenuti nei pazienti con infarto con
quelli ottenuti nei pazienti con coronaropatia stabile e
controlli l’analisi statistica è stata eseguita con il Test U
di Mann-Whitney.
Risultati
Sottopopolazioni linfocitarie, espressione di HLA-DR
e di CD69
L’analisi delle sottopopolazioni linfocitarie nei tre gruppi di soggetti in esame (pazienti con NSTEMI, angina stabile e controlli) non ha evidenziato differenze statistica-
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Anna Laura Pasqui et al.
mente significative per quanto riguarda le percentuali di
CD3+, CD4+, CD8+ e del rapporto CD4/CD8 anche se nei
pazienti con NSTEMI a differenza degli altri due gruppi
era presente una notevole variabilità del rapporto CD4/CD8
con aumento o diminuzione di tale rapporto per variazioni
o dei CD4 o dei CD8 (Tab. II).
L’espressione della molecola di attivazione HLA-DR sui
CD3+ è risultata aumentata significativamente e analogamente la molecola CD69 sui linfociti CD4+ era significativamente aumentata nei confronti dei pazienti con angina stabile e nei controlli (Tab. II).
Apoptosi linfomonocitaria
FIGURA 1. L’apoptosi linfocitaria risulta aumentata nei pazienti
con infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST
(NSTEMI) in confronto ai pazienti con angina stabile (SA) e ai
controlli (media ± DS).
DO = densità ottica.
* p < 0.05.
Esperimenti preliminari eseguiti nel nostro laboratorio
avevano dimostrato che sia nelle colture linfomonocitarie dei normali che dei pazienti la migliore determinazione
dei frammenti apoptotici di DNA valutati con il metodo
ELISA era ottenibile dopo 72 ore di coltura. Abbiamo pertanto eseguito la quantizzazione dei frammenti intracellulari di DNA a questo tempo e abbiamo riscontrato che
l’apoptosi spontanea delle cellule non aderenti prelevate
dai soggetti con NSTEMI era significativamente aumentata in confronto con gli altri due gruppi. Non si riscontravano invece differenze significative tra il gruppo di
soggetti con angina stabile e quello dei normali (Fig. 1).
Espressione del Fas e Fas ligando
Allo scopo di chiarire i meccanismi coinvolti nell’accelerata apoptosi da noi riscontrata, abbiamo eseguito
l’analisi del sistema Fas/FasL, che risulta normalmente coinvolta nei meccanismi di morte cellulare programmata.
L’espressione del Fas (CD95) eseguita a fresco sui
linfociti isolati con metodo citofluorimetrico è risultata significativamente aumentata nei soggetti con NSTEMI rispetto agli altri due gruppi di soggetti con angina stabile
e nei controlli (Fig. 2).
FIGURA 2. I linfociti dei pazienti con infarto miocardico senza
sopraelevazione del tratto ST (NSTEMI) esprimono più elevati
livelli di Fas in confronto ai pazienti con angina stabile (SA) e
ai controlli (media ± DS).
* p < 0.05.
TABELLA II. Sottopopolazioni linfocitarie e marker di membrana nei tre gruppi di soggetti in esame.
NSTEMI
(n = 30)
Linfociti T CD3+ (%)
Linfociti T CD4+ (%)
Linfociti T CD8+ (%)
CD4/CD8 ratio
HLA-DR+ CD3+ (%)
CD69+ CD4+ (%)
CD69+ CD8+ (%)
Angina stabile
(n = 24)
68.1 (58-79)
46.7 (39-60)
25.6 (11-63)
2.4 (0.6-6.1)
15 (4-29)*
3 (0.4-9)*
5.8 (0.2-9)
69.2 (61-80)
49.1 (42-51)
30 (21-38)
1.86 (0.9-3.6)
3.4 (2-10)
1.3 (0.4-3)
4.6 (0.6-5)
I valori sono espressi come mediana e range.
NSTEMI = infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST.
* p < 0.05 pazienti NSTEMI vs pazienti con angina stabile e vs controlli.
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Controlli
(n = 15)
70.4 (60-82)
48.7 (41-52)
29.1 (20-37)
1.87 (0.9-3.4)
3.2 (1.2-8.9)
1.2 (0.4-2.6)
4.2 (0.6-5)
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Invece per quanto riguarda l’espressione del FasL, eseguita con metodica PCR semiquantitativa (a transcriptasi inversa), non abbiamo riscontrato differenze significative nei soggetti con NSTEMI rispetto agli altri (Fig. 3).
citi dei pazienti con NSTEMI era una molecola funzionalmente attiva.
Produzione di interleuchina-2
I linfociti isolati dai pazienti con NSTEMI e messi in coltura producevano normali quantità di IL-2 dopo stimolazione con fitoemoagglutinina. Inoltre l’aggiunta di IL-2 al
medium all’inizio della coltura non riduceva l’apoptosi
spontanea (Fig. 5).
Morte cellulare indotta da Fas
In relazione al riscontro dell’aumentata espressione del
Fas nei soggetti con NSTEMI, abbiamo voluto determinare se i linfociti di questi soggetti presentassero un’aumentata sensibilità ad andare incontro alla morte cellulare indotta da Fas. Abbiamo pertanto trattato i linfociti in
coltura di 12 dei pazienti con NSTEMI con CH-11 (1
µg/mL), che è un anticorpo monoclonale specifico antiFas, e per controllo con un anticorpo dello stesso isotipo.
Nello stesso esperimento abbiamo usato cellule di Jurkat
come controllo positivo perché sicuramente sensibili.
Abbiamo riscontrato che il trattamento con l’anticorpo anti-Fas era capace di indurre l’apoptosi dei linfociti da pazienti con NSTEMI, laddove invece non era presente alcun effetto da parte dell’anticorpo di controllo (p < 0.05;
Fig. 4). Ambedue le sostanze non inducevano apoptosi nei
linfociti prelevati dagli altri due gruppi di soggetti (dati non
mostrati).
Pertanto il fatto che l’anticorpo specifico per il Fas inducesse la morte cellulare era indice che il Fas sui linfo-
FIGURA 4. Il cross-linking del Fas con il CH-11, un anticorpo
immunoglobulina (Ig)M-specifico anti-Fas, induce la morte
cellulare nei linfociti prelevati dai soggetti con infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST, mentre l’IgM di controllo non ha effetto. L’apoptosi era valutata su 12 pazienti dopo 16 ore di coltura con il CH-11 con il consueto metodo ELISA. L’esperimento era eseguito in duplicato. I dati rappresentano i valori medi.
DO = densità ottica.
* p < 0.05.
FIGURA 3. Espressione del mRNA del Fas ligando nei linfociti dei tre gruppi di soggetti (pazienti con infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST-NSTEMI, con angina stabileSA e controlli). L’espressione del Fas ligando mRNA era valutata con reazione polimerasica a catena a transcriptasi inversa. Era valutata anche l’espressione della β-actina e calcolato
il rapporto β-actina/Fas ligando. Non erano riscontrate differenze nei tre gruppi in esame. Le immagini mostrano i dati che
si riferiscono a 3 pazienti con NSTEMI, 3 con SA e 2 controlli,
ma lo studio è stato eseguito su tutti i soggetti dei tre gruppi.
C = controllo negativo; MW = marker del peso molecolare.
FIGURA 5. L’aggiunta di interleuchina (IL)-2 alle colture cellulari non riduce l’apoptosi spontanea nei pazienti con infarto
miocardico senza sopraelevazione del tratto ST. I dati rappresentano i valori medi.
DO = densità ottica.
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Anna Laura Pasqui et al.
Tali riscontri ci chiariscono che la morte cellulare non
può essere avvenuta per deprivazione citochinica.
zioni in letteratura che suggeriscono un ruolo importante dell’apoptosi nella malattia aterosclerotica e soprattutto nella fase delle complicanze trombotiche della placca
aterosclerotica21. A livello miocardico è riportato che i fenomeni di ipossia-riperfusione inducono apoptosi dei cardiomiociti, come dimostrato anche dal fatto che cardiomiociti apoptotici sono stati ritrovati su reperti bioptici nella zona periferica dei tessuti infartuati umani22,23.
Nei nostri esperimenti abbiamo riscontrato modificazioni
importanti dell’apoptosi linfomonocitaria in corso di infarto miocardico, nel senso di un aumento significativo della morte cellulare e con particolari meccanismi coinvolti, il cui chiarimento può fornire ulteriori indicazioni anche riguardo all’attivazione linfomonocitaria.
L’apoptosi dei linfociti T avviene sostanzialmente in
due forme distinte: un’apoptosi conseguente alla cessazione dello stimolo antigenico e alla carenza delle citochine la
cui produzione è indotta dall’antigene stesso, prima fra
tutte l’IL-2, e che per questo viene definita “passiva”; viceversa l’apoptosi cosiddetta “attiva” è indotta dall’espressione di specifiche citochine e recettori correlati con successiva attivazione a cascata di sistemi enzimatici. Tra i vari sistemi coinvolti in questa forma di apoptosi sono da ricordare il FasL ed il fattore di necrosi tumorale che si legano a specifici recettori presenti sulla membrana linfocitaria rappresentati dal Fas (CD95) e dal recettore per il fattore di necrosi tumorale24,25. Nell’ipotesi di un’apoptosi “attiva”, collegata all’attivazione linfocitaria, abbiamo esaminato nei nostri pazienti il sistema Fas/FasL e la produzione di IL-2 da parte dei linfomonociti. Nei pazienti infartuati l’espressione del Fas è risultata significativamente aumentata mentre non abbiamo riscontrato modificazioni del FasL; tuttavia quando siamo andati a stimolare le
cellule con un anticorpo specifico per il Fas abbiamo notato un aumento dell’apoptosi, dimostrando così che tale recettore si trova in uno stato funzionalmente attivo; la specificità di tale reazione è stata confermata da controlli positivi e negativi e riscontrata solo sui pazienti infartuati e non
sui gruppi di controllo. Nello stesso modo i linfociti in coltura dei soggetti infartuati mostravano una produzione di IL2 analoga a quella di soggetti di controllo e l’aggiunta di IL2 al medium non riduceva la morte cellulare. Tali dati ci indicavano che non era una carente produzione di IL-2 a
provocare l’apoptosi che sarebbe stata contrastata dall’aggiunta di IL-2 e ci hanno confermato che i meccanismi coinvolti erano riferibili ad un processo apoptotico indotto da
cellule attivate e da mediatori prodotti e non mancanti.
Il ruolo dell’apoptosi linfocitaria può essere importante nel determinare l’instabilità della placca e l’innesco di
fenomeni trombotici. È stato dimostrato che le cellule
apoptotiche espongono sulla membrana cellulare molecole
Discussione
I nostri dati hanno dimostrato che nei pazienti con
NSTEMI è presente un aumento dell’apoptosi associata
a segni di attivazione dei linfociti T che non è possibile
riscontrare nei due gruppi di controllo dei pazienti con angina stabile e nei soggetti normali. L’attivazione dei linfociti era dimostrata dall’aumento significativo delle molecole di superficie HLA-DR sui CD3+ e CD69 sui CD4+
che sono indici di un importante coinvolgimento funzionale. Abbiamo anche riscontrato alterazioni quantitative
delle sottopopolazioni linfocitarie ma le modificazioni
del rapporto CD4/CD8 non risultavano univoche e non tali da farci trarre conclusioni se non quella di generiche alterazioni quantitative associate a più importanti alterazioni
funzionali.
I nostri dati trovano riscontro con i dati della letteratura che riporta osservazioni contrastanti riguardo alle modificazioni numeriche sia delle cellule CD4 che del rapporto CD4/CD810,12-14, mentre c’è accordo riguardo ai
segni di attivazione linfocitaria in corso di cardiopatia
ischemica acuta che è evidenziata sia dalla positività delle molecole di superficie che dalla produzione di citochine e dalla positività dei recettori di membrana ad esse correlate. In particolare, in corso di angina instabile è stata riscontrata un’aumentata espressione di HLA-DR sui linfociti CD4 e CD8 insieme ad aumentati livelli sierici di IL2, recettore solubile circolante di IL-2 e IL-615-17. Sempre
nell’angina instabile sono state riscontrate alterazioni funzionali dei linfociti T con espansione della sottopopolazione che produce interferone-γ. Tale shift cellulare sarebbe
indotto da antigeni specifici localizzati a livello della
placca aterosclerotica coronarica e la risposta linfocitaria
sarebbe specificamente rivolta verso questi determinanti
antigenici10. Analogamente in corso di infarto cardiaco sono stati evidenziati segni di attivazione dei linfociti T
rappresentati da aumento dei livelli plasmatici periferici
di sIL-2R, IL-1β, IL-6 e sIL-6R, mentre a livello del seno coronarico sono emersi aumenti di IL-6 e IL-818-20.
Altre importanti considerazioni riguardano le osservazioni relative all’apoptosi linfomonocitaria.
È un dato ormai acquisito che la morte cellulare programmata rappresenta un importante meccanismo di
omeostasi del sistema immunitario e viene ad essere sempre coinvolta quando è messa in atto una risposta immunitaria linfocito-mediata. Era quindi ipotizzabile che i fenomeni apoptotici avessero luogo anche in corso di ischemia miocardica in presenza della suddetta attivazione
delle cellule T. In questo senso, esistono recenti osserva-
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Ann Ital Med Int Vol 18, N 3 Luglio-Settembre 2003
come la fosfatidilserina che inducono reazioni procoagulanti in vari modelli animali e umani26. Nello stesso modo il sopranatante di cellule apoptotiche contiene sostanze fosfatidilserino-simili con attività procoagulante rilasciate dalle cellule stesse27. A livello istologico dei siti della rottura di placca sono riscontrabili particelle apoptotiche derivate da macrofagi e linfociti che sembrano presentare un ruolo determinante nell’innesco della cascata
coagulativa22. Il nostro riscontro di un’aumentata apoptosi
dei linfomonociti periferici in corso di infarto ci ha fatto
supporre che lo stesso meccanismo fosse operante anche
a livello della placca coronarica tanto più se si considera
che le malattie sistemiche caratterizzate da attivazione
dell’apoptosi e da presenza in circolo di particelle apoptotiche (lupus eritematoso sistemico, sindrome da anticorpi
antifosfolipidi) si accompagnano ad un aumentato rischio
di trombosi coronarica28.
Un’ultima considerazione è di ordine temporale. Il processo apoptotico è regolato da un programma genetico specifico che induce la morte delle cellule o ne promuove la
sopravvivenza e che richiede per la sua esecuzione una latenza di alcuni giorni. Nei nostri pazienti l’aumento
dell’apoptosi è stato riscontrato entro poche ore dall’insorgenza dell’infarto laddove l’attuazione del programma
genetico apoptotico richiede un intervallo di tempo più lungo di quello intercorso tra l’insorgenza dell’infarto e l’esecuzione dei test di laboratorio; tale fatto ci porta a concludere che l’attivazione linfocitaria non è conseguente
all’insulto miocardico ma è avvenuta prima dell’ischemia
miocardica e quindi può essere stata un fattore importante nel suo determinismo.
In conclusione, nei pazienti con infarto miocardico, a differenza dei soggetti con angina stabile e dei controlli, sono presenti modificazioni quantitative delle sottopopolazioni linfocitarie e soprattutto è possibile riscontrare i segni dello stato di attivazione dei linfociti rappresentato
dall’aumento dei marker di membrana HLA-DR, CD69 e
Fas. L’apoptosi linfocitaria è aumentata con le caratteristiche di un processo attivo e quindi strettamente collegata
con l’attivazione cellulare e da questa indotta.
Per i fenomeni intrinseci all’attivazione cellulare e al realizzarsi dell’apoptosi, l’attivazione dei linfociti deve essere
antecedente all’evento coronarico acuto e quindi è ipotizzabile che sia un fattore primario nell’induzione dell’instabilità della placca e nell’emergenza clinica dell’infarto.
ria in pazienti con infarto miocardico senza sopraelevazione
del tratto ST (NSTEMI) in confronto a pazienti con angina
stabile e soggetti sani. Abbiamo considerato l’apoptosi
linfocitaria (metodo ELISA), la produzione di interleuchina-2 (metodo ELISA), l’espressione del Fas sui linfociti T (metodo citofluorimetrico), l’mRNA per Fas ligando (metodo di reazione polimerasica a catena a transcriptasi inversa) e la funzionalità del Fas. Abbiamo anche
valutato i segni di attivazione dei linfociti T come espressione delle molecole di membrana HLA-DR e CD69 e il
rapporto CD4/CD8 (metodo citofluorimetrico), il tutto
in campioni di sangue periferico prelevati entro 6 ore
dall’esordio dell’infarto.
Abbiamo riscontrato un aumento significativo dell’apoptosi linfocitaria nei pazienti con infarto in confronto agli
altri due gruppi, associato ad un’aumentata espressione del
Fas, un’aumentata risposta ad agonisti del Fas (CH-11) e
una normale produzione di interleuchina-2 nelle colture
cellulari. Anche i marker di membrana HLA-DR+ CD3+
e CD69+ CD4+ erano aumentati significativamente nei pazienti infartuati.
È possibile concludere che l’apoptosi è aumentata in corso di infarto con i caratteri di un’apoptosi “attiva” indotta dall’attivazione cellulare e dalla produzione di citochine
e non dalla carenza di fattori di crescita. È verosimile
che l’attivazione dei linfociti preceda l’insorgenza dell’infarto e rappresenti quindi un meccanismo importante nel
suo determinismo.
Parole chiave: Apoptosi; Infarto miocardico senza sopraelevazione del tratto ST; Linfociti T.
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Manoscritto ricevuto il 4.6.2003, accettato il 3.9.2003.
Per la corrispondenza:
Prof.ssa Anna Laura Pasqui, Sezione di Semeiotica Medica, Dipartimento di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Università degli Studi,
Policlinico “Le Scotte”, Viale Bracci, 53100 Siena. E-mail: [email protected]
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