Corso di LABORATORIO DI BIOCHIMICA II
Il corso si svolgerà con lezioni teoriche seguite da esercitazioni pratiche in laboratorio, che
consentiranno una maggiore comprensione delle tecniche biochimiche e di biologia molecolare in
studio.Durante il corso saranno illustrate in dettaglio le tecniche di DNA ricombinante per la
produzione delle proteine e largo spazio sarà dato allo studio delle più importanti tecniche per la
caratterizzazione strutturale e funzionale delle proteine e degli acidi nucleici (DNA ed RNA).
Pertanto, saranno illustrate le tecniche di DNA ricombinante per il clonaggio dei geni, tecniche
d’estrazione, purificazione, amplificazione degli acidi nucleici (PCR e RT-PCR), sequenziamento
classico ed automatizzato, per poi passare alle tecniche usate per l'espressione di proteine
ricombinanti in differenti tipi di cellule ed in vitro. Saranno quindi illustrate le principali strategie per
l'estrazione delle proteine ricombinanti dalle cellule e le tecniche di purificazione e
caratterizzazione delle proteine ricombinanti. Saranno quindi trattate anche le principali tecniche
per lo studio dell’espressione genica nei vari tessuti e nelle cellule tumorali (es. Western-blott,
Microarray) ed illustrate le principali tecniche per lo studio delle interazione DNA-proteina. In
fine, saranno anche effettuate delle lezioni teorico-pratiche di bioinformatica per lo studio delle
macromolecole biologiche. Lo studente sarà guidato all’utilizzo di banche dati (proteiche e
genomiche), di programmi per la determinazione di omologie di sequenza e predizione delle
strutture secondarie e tridimensionali delle proteine.
Programma Dettagliato del corso di Laboratorio di Biochimica II
- Tecniche di DNA ricombinante per la clonazione dei geni e l'espressione di proteine
ricombinanti
- Tecniche di estrazione e purificazione ed amplificazione degli acidi nucleici
- Tecniche di estrazione e purificazione delle proteine ricombinanti: strategie per l'estrazione delle
proteine ricombinanti dalle cellule, precipitazione frazionata delle proteine, tecniche
cromatografiche, metodi per concentrare le proteine e stimarne la concentrazione.
- Tecniche elettroforetiche per la caratterizzazione di proteine ed acidi nucleici
- Tecniche di sequenziamento delle proteine e del DNA: degradazione automatica di Edman e sequenziamento C-terminale delle proteine; sequenziamento del DNA classico ed automatizzato.
- Principali tecniche per lo studio dell’espressione genica nei vari tessuti e nelle cellule tumorali (es.
Western-blott, Microarray) e per lo studio delle interazione DNA-proteina.
Esercitazioni:
- preparazione di piastre e terreni di coltura per la crescita batterica e la selezione di ceppi
trasformati, estrazione plasmidica da ceppi trasformati, tecniche di amplificazione del DNA- PCR.
- purificazione di una proteina mediante cromatografia di affinità con sistema FPLC, gel-filtrazione,
uso del sistema HPLC applicato per la purificazione di peptidi e proteine. Stima della
concentrazione mediante saggio BCA (ac. bicinconinico). Ultrafiltrazione, salting-out di una
proteina con solfato di ammonio e dialisi.
- SDS-PAGE di proteine ed elettro-trasferimento su membrana, elettroforesi in gel di agarosio del
DNA plasmidico estratto da batteri.
-Strategie per il sequenziamento proteico e del DNA, visione del Sequenziatore automatico del
DNA
- deterimazione di interazioni proteina –peptide e proteina-DNA
- utilizzo banche dati proteiche e degli acidi nucleici, uso di programmi disponibili in rete per la
ricerca e l'analisi di omologie strutturali, per la predizione di strutture secondarie e per
l'identificazione di motivi strutturali conservati
