Corso di Laurea in Chimica e Tecnologie Farmaceu6che a.a. 2014-­‐2015 Università di Catania La trascrizione e la sua regolazione Stefano Forte Pun6 di controllo dell’espressione genica (negli eucario6) L’espressione genica è controllata a diversi livelli. Questo permette di
ottenere una modulazione più efficace, specifica nel tempo e nello spazio.
La necessità di esprimere GENI DIVERSI in cellule e tessuti diversi nasce
dalla diversità nella specializzazione funzionale di cellule che hanno
comunque lo stesso genoma
L’adattamento a condizioni ambientali in costante mutamento è strettamente
correlato con la regolazione genica.
Il filamento stampo Le tre fasi della trascrizione Cicli di sintesi abor6va (< 9 nucleo6di) Un rallentamento eccessivo porterà alla terminazione precoce È possibile incorporare nucleo6di non correN La fine del processo è la terminazione, causata da sequenze specifiche Confrontare sequenze • Il confronto fra sequenze, nucleo6diche o aminoacidiche, è uno dei compi6 fondamentali della bioinforma6ca. Perché è possibile confrontare sequenze? Perché generalmente in natura le struSure molecolari non vengono create ex-­‐novo ma per modificazione di modelli preesisten6. ObieNvi del confronto: – Filogenesi molecolare – Evoluzione dei singoli genomi – CaraSerizzazione di proteine con funzione sconosciuta Similarità e omologia • Tra due o più sequenze può esserci un certo grado di similarità. • Tale similarità può essere misurata in modi diversi, anche a seconda del 6po di sequenze in esame (Nucleo6diche o aminoacidiche). • A volte una similarità tra sequenze implica una similarità struSurale e, conseguentemente, una similarità funzionale. • L’omologia tra sequenze indica invece una comune origine evolu6va tra di esse. Due sequenze si dicono omologhe quando discendono entrambe da una sequenza ancestrale comune. • Due o più sequenze simili tra loro possono quindi essere omologhe o meno. Individuazione di sequenze consenso • Allineando un certo numero di sequenze a monte dei geni baSerici è possibile individuare, a posizioni specifiche, la presenza “preferenziale” di alcune basi • Una sequenza che con6ene ad ogni posizione la base più frequente è chiamata sequenze consenso • Non tuN i promotori hanno usa sequenza uguale alla sequenza consenso, ma tuN hanno sequenze che “gli somigliano” Altri 6pi di struSura del promotore La struSura del promotore baSerico • LeSera maiuscola > 50% dei promotori • LeSera minuscola < 50% dei promotori La terminazione • La terminazione dipende da specifiche sequenze sul DNA. Si dis6nguono in: • Terminatori intrinseci – Funzionano senza l’ausilio di proteine accessorie • Terminatori Rho-­‐dipenden6 – Funzionano in collaborazione con la proteina Rho Terminatori intrinseci Terminatori intrinseci Terminazione Rho dipendente Terminazione Rho dipendente La regolazione dell’espressione genica La regolazione dell’espressione genica è di grandissima importanza anche nei procario6. Non tuN gli enzimi della cellula devono essere sinte6zza6 contemporaneamente e non tuN devono essere sinte6zza6 nella stessa quan6tà. La regolazione è fortemente influenzata dall’ambiente proprio per perme;ere al ba;erio di rispondere in maniera efficace alle variazioni nel mezzo in cui il ba;erio si trova. L’induzione e la Repressione rappresentano due efficaci meccanismi di regolazione dell’espressione genica opera6 dal baSerio. Essi permeSono al baSerio di sinte6zzare gli enzimi necessari soltanto quando servono. L’organizzazione dei geni nei procario6 • Nei procario6 i geni sono organizza6 in operoni L’organizzazione dei geni nei procario6 • La regolazione degli operoni Controllo nega6vo: la repressione Gli enzimi che catalizzano la sintesi di un prodoSo non vengono sinte6zza6 se questo prodoSo è già presente nel mezzo. La repressione dei sistemi enzima6ci deputa6 alla sintesi di un dato composto è effeSuata dal composto stesso che, se presente nel mezzo, assume il ruolo di repressore. La repressione è un fenomeno estremamente diffuso, ed è altamente specifico. Il vantaggio della repressione è ovvio: l’organismo non spreca la propria energia per la sintesi degli enzimi non necessari. Controllo nega6vo: l’induzione L’induzione enzima6ca, o semplicemente induzione, rappresenta il fenomeno aSraverso il quale la sintesi di un enzima è aNvata soltanto quando il suo substrato è disponibile. Un esempio è dato dagli enzimi per la degradazione di sostanze energe6che. Ques6 vengono prodoN esclusivamente se le sostanze da degradare sono presen6 nel mezzo, e possono quindi essere u6lizzate. • La sostanza che inizia l’induzione enzima6ca è chiamata indu;ore • La sostanza che reprime la produzione di enzimi è chiamata corepressore (perché richiede l’intervento di una proteina addizionale chiamata repressore) • Queste sostanze, che di solito sono piccole molecole, vengono colleNvamente definite effe;ori Induzione e Repressione Come fanno gli effeSori ad influenzare i geni bersaglio in maniera così specifica? • Legando combinandosi con proteine di regolazione specifiche Quando un corepressore lega una proteina di regolazione (repressore) la rende capace di legarsi in una specifica regione di DNA a valle del promotore deSa operatore. Il legame di questo complesso impedisce alla polimerasi di proseguire e di sinte6zzare l’mRNA dei geni a valle. I geni bersaglio sono tuN posiziona6 a valle della regione operatore, vengono quindi controlla6 simultaneamente. Questo 6po di organizzazione viene chiamata operone. Repressione Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Trascrizione RNA polimerasi repressore Promotore RNA polimerasi Operatore repressore corepressore Gene 1 Gene 2 Trascrizione Bloccata Induzione Promotore RNA polimerasi Promotore Operatore repressore Operatore Gene 1 Trascrizione Bloccata Gene 1 Trascrizione RNA polimerasi repressore Gene 2 induSore Gene 2 Il controllo posi6vo La repressione e l’induzione sono meccanismi di controllo nega6vo dell’espressione in quanto in entrambi i casi è coinvolta una proteina regolatrice specifica, chiamata repressore, che impedisce la sintesi dei geni di un operone. Nel controllo posi=vo una proteina regolatrice promuove il legame della RNA polimerasi agendo così in modo da incrementare la sintesi degli mRNA regola6. Le proteine regolatrici che intervengono in questo processo sono chiamate aCvatori (o proteine di aCvazione) I si6 di legame per gli aNvatori possono talvolta essere localizzate a distanza dai promotori. In questo caso la loro azione è mediata dal ripiegamento del DNA (secondo un modello simile a quello incontrato per gli enhancer eucario6ci) Repressione Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 La trascrizione non ha inizio RNA polimerasi Promotore RNA polimerasi aNvatore induSore Operatore aNvatore Gene 1 Trascrizione Gene 2 Funzionamento dell’operone del laSosio La trascrizione nei procario6 • I meccanismi della trascrizione
• Il modello dell’operone
• L’attenuazione
L’aSenuazione Un’altra modalità di controllo nota come aSenuazione è u6lizzata in alcuni operoni che controllano la sintesi degli aminoacidi. Il caso più conosciuto è quello della via biosinte6ca dell’aminoacido triptofano. L’operone del triptofano possiede diverse modalità di regolazione, una di queste è appunto l’aSenuazione che prevede la presenza di una par6colare sequenza, chiamata sequenza guida, all’interno della quale è presente una regione codificante per un polipe6de. Questo polipep6de ha tre codoni per il triptofano consecu6vi. L’aSenuazione L’aSenuazione, nell’operone triptofano, è possibile soltanto perché nei procario6 trascrizione e traduzione sono accoppiate: la traduzione inizia prima che la sintesi dell’mRNA sia terminata. Lo spostamento del ribosoma sull’mRNA in formazione può influenzare il ripiegamento dell’mRNA stesso nascondendo delle regioni complementari. La terminazione prematura della trascrizione è influenzata proprio dalla formazione di struSure secondarie 6piche L’operone del triptofano L’operone triptofano • L’operone del triptofano è sempre acceso. • La polimerasi comincia a produrre mRNA messaggero. • Il ribosoma si aSacca e comincia a produrre il polipep6de codificato dalla sequenza dell’aSenuatore • Se vi è una elevata presenza di triptofano la velocità del ribosoma è elevata, il ribosoma raggiunge la regione 2 e le impedisce di legarsi, per complementarietà, alla regione 3. In questo modo la regione 3 si appaia con la regione 4 formando una struSura che induce la terminazione della trascrizione L’operone triptofano • Se il triptofano è scarso, quando il ribosoma arriverà in corrispondenza dei tre codoni per il triptofano effeSuerà una pausa. La diffusione degli aminoacil-­‐tRNA per il triptofano è infaN più lenta e il ribosoma deve aspeSare che ques6 arrivino. • La sosta del ribosoma nella zona 1 non impedisce alla zona 2, che questa volta è libera, di appaiarsi con la regione 3. Non potendosi più formare la struSura di terminazione (perché la regione 3 è impegnata e non disponibile per l’appaiamento con la regione 4) la trascrizione con6nua a valle producendo un mRNA con i geni per la biosintesi del triptofano. Sequenze regolatrici eucario6che • Elemen6 promotori – Nucleo del promotore – Elemen6 prossimali • Elemen6 regolatori a lungo raggio – Enhancher – Silencer – Isolatori – LCRs – MAR Organizzazione generale delle sequenze regolatrici • LeSera maiuscola > 50% dei promotori • LeSera minuscola < 50% dei promotori Regolazione genica trascrizionale • Gli Enhancer sono specifiche sequenze di DNA in grado di legare faSori proteici capaci di aumentare l'efficacia dei promotori nell'aNvazione della trascrizione • Al contrario, i Silencer sono specifiche sequenze di DNA che legano inibitori proteici della trascrizione Sono entrambi elemen6 distali e per interagire con la regione del promotore è necessario che il DNA si ripieghi a formare un’ansa. La funzione degli enhancer è indipendente da distanza e orientamento Gli Isolatori • Marcatori di confine della croma6na (eterocroma6na/eucroma6na) • ANvità di blocco di sequenze regolatrici distali
