Lezione 18 maggio 2011 CTF I anno - Dr. S. Forte
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Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 – La trascrizione nei procarioti I meccanismi della trascrizione Il modello dell’operone L’attenuazione Batteri nucleo eucarioti mitoc. Polimerasi Geni Trascritti RNA Polimerasi Tutti i geni batterici Polimerasi Geni Trascritti RNA Polimerasi I Geni rRNA RNA Polimemerasi II mRNA, snoRNA, alcuni snRNA, miRNA RNA Polimerasi III tRNA, 5s rRNA, alcuni snRNA Polimerasi Geni Trascritti RNA Polimerasi mitocondrale Geni mitocondriali Il confronto fra sequenze, nucleotidiche o aminoacidiche, è uno dei compiti fondamentali della bioinformatica. Perché è possibile confrontare sequenze? Perché generalmente in natura le strutture molecolari non vengono create ex-novo ma per modificazione di modelli preesistenti. Obiettivi del confronto: Filogenesi molecolare Evoluzione dei singoli genomi Caratterizzazione di proteine con funzione sconosciuta Tra due o più sequenze può esserci un certo grado di similarità. Tale similarità può essere misurata in modi diversi, anche a seconda del tipo di sequenze in esame (Nucleotidiche o aminoacidiche). A volte una similarità tra sequenze implica una similarità strutturale e, conseguentemente, una similarità funzionale. L’omologia tra sequenze indica invece una comune origine evolutiva tra di esse. Due sequenze si dicono omologhe quando discendono entrambe da una sequenza ancestrale comune. Due o più sequenze simili tra loro possono quindi essere omologhe o meno. Allineando un certo numero di sequenze a monte dei geni batterici è possibile individuare, a posizioni specifiche, la presenza “preferenziale” di alcune basi Una sequenza che contiene ad ogni posizione la base più frequente è chiamata sequenze consenso Non tutti i promotori hanno usa sequenza uguale alla sequenza consenso, ma tutti hanno sequenze che “gli somigliano” Lettera maiuscola > 50% dei promotori Lettera minuscola < 50% dei promotori Fattore sigma Induttore Geni bersaglio σ70 Requisiti normali durante la crescita esponenziale Geni “housekeeping” generali σS Segnali di stress, radiazioni UV, shock da calore, iperosmolarità, pH acido, etanolo, transizione da crescita a fase stazionaria Geni generali che regolano lo stress (>70 geni) σ32 Shock da calore e altri stress: proteine non ripiegate nel citoplasma Proteine dello shock da calore: proteine chaperone e proteasi che ripiegano e degradano le proteine danneggiate σE Proteine non ripiegate nell’involucro cellulare Geni che ripristinano l’integrità dell’involucro σF Condizioni che promuovono le produzione di flagelli multipli Assemblaggio del flagello e chemiotassi σ54 Mancanza di azoto Metabolismo di fonti di azoto alternative Il fattore sigma stimola un forte legame della RNA polimerasi al promotore La polimerasi completa si dissocia più lentamente dal DNA Le sequenze a -10 e -35 sono necessarie per il riconoscimento da parte di σ70, la regione a -10 è il punto di contatto con il nucleo. Inizio Allungamento Riconoscimento del promotore da parte dell’oloenzima Formazione di un complesso aperto Formazione di un complesso chiuso Clearance del promotore Dopo 9-12 nuecleotini cambiamento conformazionale del nucleo Terminazione Terminazione Rho-indipendente Terminazione Rho-dipendente Legame al -10 e -35 Formazione complesso chiuso (reversibile) Formazione complesso aperto (18 bp) Clearance del promotore prevede rottura legami tra nucleo e σ Mentre la bolla di trascrizione procede viene denaturato il DNA a valle e rinaturato il DNA a monte il NTP entra nel sito catalitico della RNA polimerasi e si lega al sottosito di legame del substrato. La catena nascente è legata al sottosito di legame del prodotto L’idrolisi del PPI fornisce l’energia necessaria per la formazione del nuovo legame covalente I meccanismi della trascrizione Il modello dell’operone L’attenuazione La regolazione dell’espressione genica è di grandissima importanza anche nei procarioti. Non tutti gli enzimi della cellula devono essere sintetizzati contemporaneamente e non tutti devono essere sintetizzati nella stessa quantità. La regolazione è fortemente influenzata dall’ambiente proprio per permettere al batterio di rispondere in maniera efficace alle variazioni nel mezzo in cui il batterio si trova. L’induzione e la Repressione rappresentano due efficaci meccanismi di regolazione dell’espressione genica operati dal batterio. Essi permettono al batterio di sintetizzare gli enzimi necessari soltanto quando servono. Gli enzimi che catalizzano la sintesi di un prodotto non vengono sintetizzati se questo prodotto è già presente nel mezzo. La repressione dei sistemi enzimatici deputati alla sintesi di un dato composto è effettuata dal composto stesso che, se presente nel mezzo, assume il ruolo di repressore. La repressione è un fenomeno estremamente diffuso, ed è altamente specifico. Il vantaggio della repressione è ovvio: l’organismo non spreca la propria energia per la sintesi degli enzimi non necessari. L’induzione enzimatica, o semplicemente induzione, rappresenta il fenomeno attraverso il quale la sintesi di un enzima è attivata soltanto quando il suo substrato è disponibile. Un esempio è dato dagli enzimi per la degradazione di sostanze energetiche. Questi vengono prodotti esclusivamente se le sostanze da degradare sono presenti nel mezzo, e possono quindi essere utilizzate. La sostanza che inizia l’induzione enzimatica è chiamata induttore La sostanza che reprime la produzione di enzimi è chiamata corepressore (perché richiede l’intervento di una proteina addizionale chiamata repressore) Queste sostanze, che di solito sono piccole molecole, vengono collettivamente definite effettori Come fanno gli effettori ad influenzare i geni bersaglio in maniera così specifica? Legando combinandosi con proteine di regolazione specifiche Quando un corepressore lega una proteina di regolazione (repressore) la rende capace di legarsi in una specifica regione di DNA a valle del promotore detta operatore. Il legame di questo complesso impedisce alla polimerasi di proseguire e di sintetizzare l’mRNA dei geni a valle. I geni bersaglio sono tutti posizionati a valle della regione operatore, vengono quindi controllati simultaneamente. Questo tipo di organizzazione viene chiamata operone. Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 Trascrizione RNA polimerasi repressore Promotore RNA polimerasi Operatore repressore corepressore Gene 1 Gene 2 Trascrizione Bloccata Promotore RNA polimerasi Promotore Operatore repressore Operatore Gene 1 Trascrizione Bloccata Gene 1 Trascrizione RNA polimerasi repressore Gene 2 induttore Gene 2 La repressione e l’induzione sono meccanismi di controllo negativo dell’espressione in quanto in entrambi i casi è coinvolta una proteina regolatrice specifica, chiamata repressore, che impedisce la sintesi dei geni di un operone. Nel controllo positivo una proteina regolatrice promuove il legame della RNA polimerasi agendo così in modo da incrementare la sintesi degli mRNA regolati. Le proteine regolatrici che intervengono in questo processo sono chiamate attivatori (o proteine di attivazione) I siti di legame per gli attivatori possono talvolta essere localizzate a distanza dai promotori. In questo caso la loro azione è mediata dal ripiegamento del DNA (secondo un modello simile a quello incontrato per gli enhancer eucariotici) Promotore Operatore Gene 1 Gene 2 La trascrizione non ha inizio RNA polimerasi Promotore attivatore Operatore RNA polimerasi induttore attivatore Gene 1 Trascrizione Gene 2 I meccanismi della trascrizione Il modello dell’operone L’attenuazione Un’altra modalità di controllo nota come attenuazione è utilizzata in alcuni operoni che controllano la sintesi degli aminoacidi. Il caso più conosciuto è quello della via biosintetica dell’aminoacido triptofano. L’operone del triptofano possiede diverse modalità di regolazione, una di queste è appunto l’attenuazione che prevede la presenza di una particolare sequenza, chiamata sequenza guida, all’interno della quale è presente una regione codificante per un polipetide. Questo polipeptide ha tre codoni per il triptofano consecutivi. L’attenuazione, nell’operone triptofano, è possibile soltanto perché nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiate: la traduzione inizia prima che la sintesi dell’mRNA sia terminata. Lo spostamento del ribosoma sull’mRNA in formazione può influenzare il ripiegamento dell’mRNA stesso nascondendo delle regioni complementari. La terminazione prematura della trascrizione è influenzata proprio dalla formazione di strutture secondarie tipiche • L’operone del triptofano è sempre acceso. • La polimerasi comincia a produrre mRNA messaggero. • Il ribosoma si attacca e comincia a produrre il polipeptide codificato dalla sequenza dell’attenuatore • Se vi è una elevata presenza di triptofano la velocità del ribosoma è elevata, il ribosoma raggiunge la regione 2 e le impedisce di legarsi, per complementarietà, alla regione 3. In questo modo la regione 3 si appaia con la regione 4 formando una struttura che induce la terminazione della trascrizione • Se il triptofano è scarso, quando il ribosoma arriverà in corrispondenza dei tre codoni per il triptofano effettuerà una pausa. La diffusione degli aminoaciltRNA per il triptofano è infatti più lenta e il ribosoma deve aspettare che questi arrivino. • La sosta del ribosoma nella zona 1 non impedisce alla zona 2, che questa volta è libera, di appaiarsi con la regione 3. Non potendosi più formare la struttura di terminazione (perché la regione 3 è impegnata e non disponibile per l’appaiamento con la regione 4) la trascrizione continua a valle producendo un mRNA con i geni per la biosintesi del triptofano.
