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Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2 Tossicità di O2 La comparsa di O2 sulla terra ha rappresentato una catastrofe ecologica in quanto organismi anaerobici dovettero trasformarsi in aerobici. • • • • • • • • FeII (solubile) → FeIII (insolubile); CuI (insolubile) → CuII (solubile); S−II (insolubile) → SO42− (solubile); Se−II (insolubile) → SeO32− (solubile); MoSx (insolubile) → MoO42− (solubile); CH4 → CO2; H2 → H2O; NH3 → NO3−, NO2−, NO. Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2 Tossicità di O2 • • Per sopravvivere alla reattività dell'ossigeno e dei suoi derivati gli organismi dovettero sviluppare una moltitudine di antiossidanti biologici ed un processo opposto alla fotosintesi, la respirazione. I batteri anaerobici attuali derivano dai primitivi organismi anaerobici mentre gli attuali organismi aerobici si sono sviluppati adattando il loro metabolismo al potere ossidante del diossigeno. Il diossigeno è essenziale per la vita degli organismi aerobici, le cellule umane usano O2 come accettore finale di elettroni nella respirazione: O2 + 4H+ + 4e → 2H2O Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2 Cenni storici o o o La tossicità del diossigeno fu riconosciuta da Rebecca Gerschman (1954). Irwin Fridowich imputò invece la tossicità allo ione superossido (1968) Attualmente il candidato principale è il radicale idrossile. L’azione lesiva di queste specie reattive riguarda i lipidi, il DNA e le proteine. Il DNA presente all'interno della cellula è vulnerabile all'attacco ossidativo alla base e allo zucchero; L'ossidazione del DNA può portare a mutazioni. Le proteine possono subire un danno ossidativo alle catene laterali amminoacidiche in particolar modo i residui cisteinici e metioninici. Nella cellula sono comunque presenti le difese opportune. Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 I lipidi sono componenti essenziali delle membrane ed il danno ossidativo osservato è dovuto ad autossidazione radicalica. Perossidazione lipidica Variazioni irreversibili della catena fosfolipidica o Lipidi o Proteine o DNA Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2 L'adattamento della vita alla presenza del diossigeno ha potuto realizzarsi, in assenza di catalizzatori, grazie alla lentezza della velocità di reazione del diossigeno. L’utilizzazione del diossigeno comporta la possibilità di formazione di specie reattive quali: diossigeno singoletto, superosso, perosso ed ossidrile. Quest’ultimo, uno dei più potenti radicali conosciuti, è prodotto dalla riduzione monoelettronica dell’acqua ossigenata da Fe3+ e Cu2+ Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Sistemi di difesa dell’organismo contro i danni ossidativi Le reazioni ossidative avvengono in compartimenti cellulari chiusi: mitocondri e cloroplasti Esistenza di specie molecolari capaci di catturare i derivati tossici dell’ossigeno Sistemi che sequestrano ioni metallici con attività redox Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH. Tocoferolo (E) membrane cellulari citosol acido ascorbico (C) Enzimi detossificanti glutatione Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2 Cellula Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Enzimi detossificanti Citocromo P-450 Catalasi Perossidasi Superossidismutasi Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Sono emoproteine il cui sito attivo è molto simile a quello della emoglobina/mioglobina. Appartengono alla famiglia degli enzimi mono-ossigenasi perché catalizzano l’inserzione di un atomo di ossigeno in una grande varietà di substrati C C Idrossilazione di composti alifatici OH OH H O S Epossidazione di alcheni N+_ O- N S O Idrossilazione di composti aromatici Ossidazione di ammine a N-ossidi Ossidazione di solfuri a solfossidi Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Gli enzimi citocromo P450 costituiscono una superfamiglia (CYP) che conta più di 7700 macromolecole. Il nome deriva dalla lunghezza d’onda del picco di assorbimento Fegato Corteccia Surrenale Catalizza reazioni di ossidazione con scarsa selettività dei substrati Metabolismo di sostanze endogene (acidi grassi, steroidi) attraverso reazioni stereospecifiche Sono stati difficili da caratterizzare perché sono legati alle membrane del mitocondrio e del reticolo endoplasmatico e sono poco solubili in acqua. Si è isolato quello presente nel batterio Pseudomonas putida P-450cam Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Questi enzimi consistono di una singola catena polipeptidica (400-530 aa). Il gruppo eme b (Fe-protoporfirina IX) è privo di legami covalenti fra l ’ anello porfirinico e la proteina. L’atomo è un FeIII BS legato solo ad un atomo di S di una cisteina (RS-). L’altra posizione assiale è probabilmente occupata da una molecola di H2O in prossimità di una cavità Il potenziale redox, a pH 7 è – 330 mV. Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Meccanismo Interesse biologico/fisiologico Interesse chimico/sintetico Si è ipotizzato che il meccanismo avvenga attraverso la reazione controllata di O2 e substrato nella sfera di coordinazione dello ione metallico (reazione templata) Orientazione spaziale (stereospecificità) Attivazione elettronica Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Citocromo P-450 Cys: Fe Fe Cys Met donatore σ donatore π Campo Debole Alto Spin Met: donatore σ accettore π Campo Forte Basso Spin Interazione con il substrato genera Fe(III) pentacoordinato ad alto spin. La variazione di spin cambia il potenziale redox a +170 mV L’aumento di potenziale favorisce la riduzione (via FADH2): si ottiene Fe(II) pentacoordinato ad alto spin, del tutto simile alla specie che coordina O2 in emoglobina Fe(III) esacoordinato a basso spin: potenziale redox a -330 mV XOOH Se all’enzima si aggiunge un peracido XOOH (che funge da donatore di O) il ciclo è cortocircuitato (effetto shunt); ne consegue che l’atomo di ossigeno proviene dal perossido -O-OH. XOH O2 si coordina per dare addotto Fe(II)O2 o Fe(III)-superossido Rimane nel ciclo catalitico la specie estremamente reattiva [FeIVPO]+ che ossida il substrato RH: [FeIVPO]++RH→FeIII(P)++ ROH La cattura di un H+ forma un Fe(III) idroperossido, il quale per rottura eterolitica del legame O-O si trasforma in OH- che viene eliminato come H2O per acquisto di un protone. La seconda riduzione forma il complesso perossidico Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Perossidasi Classe di emoproteine che catalizza l’ossidazione di molecole organiche da parte di H2O2 che viene ridotta ad acqua H2O2 + AH2 2H2O + A Il centro metallico è un Fe(III) alto spin coordinato ad un imidazolo di una istidina. Nella sesta posizione coordina l’H2O2: gli aa presenti da questo lato guidano la coordinazione e promuovono la reazione Mn-perossidasi V-perossidasi Mfree-perossidasi Questi enzimi consentono l’eliminazione di H2O2 La riduzione completa avviene solo per 80% di O2 Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Perossidasi Acidi grassi Ammine Fenoli Xenobiotici Tossine Perossidasi R-CH2-COOH + 2H2O2 3 H2O + R-CHO + CO2 ossidazione R-COOH α-ossidazione controllata degli acidi grassi durante la crescita vegetale con formazione di anidride carbonica e di un omologo inferiore Tireoperossidasi Citocromo c perossidasi (CCP) Mieloperossidasi Lignina perossidasi Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Perossidasi L’enzima più studiato nel gruppo delle perossidasi è HRP (Horseradish Peroxidase) Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Perossidasi H2O2 coordina sul Fe(III) e istidina distale media il trasferimento di un H+ in modo che entrambi gli idrogeni siano legati sull’ossigeno non coordinato al ferro Arg polarizza il legame perossidico favorendo la rottura eterolitica di detto legame Si libera una molecola di acqua e si forma un intermedio Fe(IV)=O con il metallo in uno stato di ossidazione elevato. L’anello porfirinco è un radicale catione Composto I è ridotto al Fe(III) di partenza a seguito di due trasferimenti elettronici. Gli elettroni provengono dal substrato che si ossida Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Catalasi È stata determinata la struttura della catalasi presente nel fegato di vitello. H2O2 + H2O2 2H2O + O2 È una perossidasi speciale perché il suo substrato è una seconda molecola di H2O2. Catalizza la reazione disproprozione di H2O2 di Il Ferro (III) alto spin è coordinato assialmente dal gruppo fenolato dell’aminoacido tirosina e da una molecola di acqua che viene spostata dall’H2O2. Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Fe(III)porf + H2O2 Fe(III)porf(OOH) + H+ Fe(III)porf(OOH) Fe(IV)porf+.=O + OH- Fe(IV)porf+.=O + H2O2 O2 + Fe(III)porf + H2O Stesso meccanismo visto per le perossidasi e si forma Composto I con ferro ad alta valenza Usando H2O2 marcata si è stabilito che rottura legame O-O non avviene. Si tratta di una riduzione bielettronica del composto I da parte di H 2O2, con l’ossigeno coordinato al ferro che viene rilasciato in una molecola di acqua Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Perossidasi e citocromo P-450 R-H His + Arg O O Fe(IV)-Por+. Fe(IV)-Por+. S-Cys His Compound I Come è possibile che la stessa specie ipervalente dia due reazioni molto diverse: trasferimento di atomo di ossigeno nel cyt P-450 trasferimento elettronico in perossidasi e catalasi Le cavità in cui si dispone il substrato sono diverse: nel cytP450 RH è molto vicino al ferrile. Nella perossidasi alcuni aminoacidi bloccano di fatto l’avvicinamento del substrato al ferrile, rendendo possibile solo il trasferimento dell’elettrone. Come si effettua la rottura eterolitica del legame perossidico nei due sistemi enzimatici? Nella perossidasi la polarizzazione del legame è raggiunta grazie all’azione degli aminoacidi. Nel citocromo P-450 tali aminoacidi non ci sono perché il complesso si trova in una tasca idrofobica. Probabilmente il legante assiale cisteina, per la sua natura basica, favorisce la rottura eterolitica. Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) Famiglia di metallo proteine che catalizza la disproporzione dello ione superossido attraverso un meccanismo che consiste di due passaggi consecutivi: 1) Mn+ + O2- 2) M(n-1)+ + O2 M(n-1)+ + O2 - Mn+(O22-) 2H+ Mn+ + H2O2 Nello step 1) lo ione superossido riduce lo ione metallico ossidandosi ad ossigeno molecolare Nello step 2) lo ione superossido riossida lo ione metallico riducendosi a perossido La reazione complessiva è: 2O2- + 2H+ SOD O2 + H2O2 Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Cu-Zn (SOD) Si trova nei mitocondri delle cellule eucariote consiste di due subunità identiche tenute insieme da interazioni idrofobiche il rame e lo zinco si trovano sul fondo di uno stretto canale fatto ad imbuto. Le dimensioni di questo canale consentono il passaggio solo a molecole molto piccole (H2O) e a piccoli ioni all’imboccatura del canale sulla superficie esterna della proteina ci sono due aa lisina, che essendo carichi positivamente, attraggono lo ione superossido. lungo le pareti del canale vi è un aa arginina anch’esso positivo che ha la funzione di convogliare l’anione superossido verso il sito catalitico una modifica chimica delle lisine e della arginina comporta una forte diminuzione dell’attività della SOD Struttura della forma ossidata della CuZn-SOD da eritrociti bovini Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Cu-Zn (SOD) His118 His44 Cu2+ è coordinato a 4 imidazoli istidinici e a una molecola di H2O. La geometria è piramidale a base quadrata con acqua nella posizione apicale H2O His 69 Cu Zn Asp 81 His 46 His 78 His 61 Zn2+ è coordinato a 3 imidazoli istidinici e al carbossilato di un aspartato A ponte tra i due centri metallici Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2 Cu-Zn (SOD) His118 H2O His44 His 69 Cu Zn Asp 81 His 46 His 78 Cu2+ è il sito di interazione dello ione superossido. Quindi il Cu2+ è His 61 il sito su cui avviene la disproporzione: Cu2+ + O2Cu+ + O2- Cu+ + O2 Cu2+(O22-) Rimozione dello Zn2+ non altera l’attività della SOD ma rende più instabile la proteina che si denatura a temperatura più bassa della SOD nativa Cu2+ + H2O2 Zn2+ ha ruolo strutturale Attività della SOD è inibita in presenza di specie anioniche piccole come CN-, F-, N3- che competono con lo ione superossido nel sito catalitico.
