PGS 20IZ146.0.0 – MOD. 40IZ329.0.0
PROGETTO DI RICERCA CORRENTE IZS PLV 20/07 RC
Titolo del progetto: Differenziazione dei cloni di Listeria spp. Isolati da materiale biologico,
alimentare, ambientale: loro sub-tipizzazione genetica mediante PFGE e MVLST
Responsabile Scientifico: Dott. Massimo Fornasiero
Ricerca finanziata da: Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali
Dipartimento per la Sanità Pubblica Veterinaria, la Nutrizione e la Sicurezza degli Alimenti
obiettivi: le conoscenze sulla virulenza intrinseca di L.monocytogenes -come patogeno alimentarerimangono per lo più nascoste. I tentativi di classificazione racchiudono la volontà di distinguere i
ceppi epidemici dagli altri meno -o per nulla- virulenti attraverso subtipizzazioni molecolari. Un buon
metodo deve saper collegare epidemiologicamente gli isolati riferibili a un particolare
focolaio/epidemia separando gli isolati non riconducibili a quel focolaio/epidemia. I migliori criteri che
definiscono un buon metodo sono: il potere Discriminatorio (D) e la concordanza Epidemiologica (E).
D descrive le capacità di un sistema di generare informazioni distinte e discrete a partire da isolati mai
messi in relazione reciproca. E descrive la capacità di un sistema di classificare correttamente tutti gli
isolati provenienti da un definito e ben descritto focolaio come appartenenti allo stesso clone.
metodologia: Diversi metodi di sub-tipizzazione hanno come obiettivo marker molecolari diversi.
PFGE analizza le variazioni “entro” e “tra” siti di restrizione e possiede un elevato potere
Discriminatorio; questo la rende il “gold standard” dei metodi per la ricerca e la investigazione
epidemiologica. MVLST, basato sulla analisi/sequenza di sei geni di virulenza ha dimostrato di
possedere un potere Discriminatorio maggiore di quello generato da ApaI-PFGE. 22 ceppi di L.
monocytogenes isolati nel corso degli anni 2007 e 2008 a partire da prodotti alimentari pronti per il
consumo a base di carne suina (insaccati) analizzati presso il laboratorio del Controllo Alimenti
dell’Istituto Zooprofilattico PLVDA, sede di Torino, sono serviti come punto di partenza per le
successive ricerche e approfondimenti lungo la filiera di lavorazione delle carni negli impianti
selezionati. Sei geni di virulenza sono stati analizzati (prfA, InlB, InlC, dal ,cipC, e lisR) per MVLST e
le regioni interne (circa 500 bp) di ogni gene sono state amplificate e sequenziate come descritto da
Chen et al, 2007. I Primers per tutti i geni di virulenza sono stati progettati sulla base delle sequenze
disponibili. Sono state campionate in tutto180 postazioni/macchinari di 12 aziende.
risultati: 60 prelievi sono risultati positivi. I ceppi isolati sono stati riconosciuti come non appartenenti
ai Cloni Epidemici maggiormente diffusi. Infatti: PFGE ha confermato l’appartenenza dei ceppi ai
lineage tipici degli alimenti (1/2a, 1/2c e 1/2b); la sierotipizzazione ha escluso la presenza di ceppi 4b;
la mancanza di focolai o casi di malattia osservati nel periodo di consumo degli alimenti analizzati
depone a favore del fatto che MVLST abbia caratterizzato gli isolati come: ceppi con profili non
riferibili a cloni epidemici.
discussione: Variazioni nella sequenza genica spiegano quanto il genoma di questi ceppi sia
grandemente sintetico e rivelano anche il numero di differenze geniche entro i sierotipi. Queste
differenze possono aiutare a spiegare le nicchie ecologiche. Parecchi geni sembrano essere specifici per
ciascun sierotipo, così come le Internaline associate alla superficie cellulare, in quanto il polimorfismo
nucleotidico presente in isolati di tutti i lineage è stato associato alla differente virulenza. I ceppi isolati
non sono difatti riferibili a eventi epidemici osservati nel periodo.
conclusione: L’identificazione delle condizioni che sottendono l’espressione dei fattori di virulenza
sembra essere, allo stato, propedeutica all’implementazione e allo sviluppo di strategie di controllo
della listeriosi.
Parole chiave: Lineage, L.monocytogenes, Internaline, InlA, PFGE, MVLST, Geni di Virulenza
