Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche Giovanna Franciosa [email protected] Workshop: Focus su Sicurezza d’Uso e Nutrizionale degli Alimenti Roma 21-22 novembre 2005, ISS Listeria monocytogenes Asporigeno Microaerofilo Produce fattori di virulenza Clostridium botulinum Sporigeno Anaerobio obbligato Neurotossigeno Patogenesi della listeriosi umana Meccanismo infettivo di L. monocytogenes Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo di L. monocytogenes Fattore Ruolo InlA Adesione epitelio GI e placentare InlB Adesione epatociti ed altre cellule Hly Citolisina; lisi vacuolo PI-PLC Fattore accessorio lisi vacuolo I ActA Mpl Movimento intra- ed inter-cellulare Attivazione PC-PLC PC-PLC Fattore accessorio lisi vacuolo II PrfA Regolatore positivo trascrizione GENI GENI VIRULENZA VIRULENZA Listeriosi invasiva e gastroenterica Invasiva Gastroenterica SNC e placenta Tratto Gastrointestinale Popolazione ad alto rischio (immuno-compromessi, anziani, donne in gravidanza, neonati) Persone che non presentano fattori di predisposizione Dose infettiva: bassa Dose infettiva: alta Tempo medio d’incubazione 2-3 settimane Tempo medio d’incubazione 12-24 ore Episodi di gastroenterite associati a L. monocytogenes Luogo Anno Numero di casi Veicolo Rif. Giappone 2001 38 Formaggio Kawamoto et al., 2004 Svezia 2001 48 Latticini Carrique-Mas et al., 2003 USA 2001 16 Sandwich tacchino Frye et al., 2002 Australia 2000 31 Carni ready-to-eat Sim et al., 2002 Finlandia 1999 5 Trota Miettinen, 1999 Italia 1997 1566 Insalata di mais Aureli et al., 2000 Canada 1996 1 Polpa di granchio Farber et al., 2000 Danimarca 1996 3 Sconosciuto Heitmann et al., 1997 USA 1994 45 Latte al cioccolato Dalton et al., 1997 Italia 1993 18 Insalata di riso Salamina et al., 1996 USA 1989 10 Gamberi Riedo et al., 1994 Ceppi di L. monocytogenes paragonati per caratteristiche di virulenza 30 CEPPI TOTALI 27 CLINICI 9 di sierotipo 1/2b 6 INVASIVI 1 da un outbreak 5 da casi sporadici 3 GASTROENTERICI 3 NON-UMANI 18 di sierotipo 4b 16 INVASIVI Ceppo ScottA 15 da casi sporadici ATCC 15313, n.s., avirulento 2 GASTROENTERICI ATCC 43248, 1/2a avirulento L 254 (Italia) L 90 (Italia) L 285, n.s. G6006 (USA) F60594 (Danimarca) C1340 (Canada) Valutazione della virulenza dei ceppi di L. monocytogenes Approccio molecolare Test di virulenza in vivo su topini inoculo (i.p.) PCR-RFLP di 8 principali geni associati alla virulenza intra-peritoneale (VAG) tipizzazione PFGE inoculo (i.g.) intra-gastrico M L90 F60594 L645 L864 L958 L959 L448 L599 L349 L337 L339 L340 L344 L335 L67 ScottA L439 L66 M Prodotti PCR di ActA ristretti con DraI Ceppi Ceppi 4b Ceppi 4b 4b 800 bp 700 bp 400 bp Ceppi Ceppi 1/2b Ceppi 1/2b 1/2b 500 bp L285 ATCC43248 C1340 G6006 L254 L941 L330 L364 L312 L310 L2818 M 300 bp Ceppi Ceppi avirulenti Ceppiavirulenti avirulenti Ceppi 4b Ceppi avirulenti Ceppi 1/2b M L364 L941 L254 G6006 C1340 M L2818 L310 L312 L330 M ATCC15313 ATCC43248 F60594 L285 L90 L958 L959 L864 L645 L599 L448 L349 L344 L340 L339 L337 L335 L67 L66 L439 ScottA M Profili PFGE con ApaI Sc ot tA L L 9 (4 28 0 b) 1 L 8 ( (4b 25 1/ ) 4 2b Sc (1/2 ) b ot tA ) L L 9 (4 28 0 b) 1 L 8 ( (4b 25 1/ ) 4 2b Sc (1/2 ) b ot tA ) L L 9 (4 28 0 b) 1 L 8 ( (4b 25 1 / ) 4 2b (1 ) /2 b) Log10 CFU/g organ Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati i.g i.g.. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 p < 0.05 intestine liver spleen Listeria monocytogenes sierotipo 4b Markers per ECII ECI + ECI4b - + Altri Altri 4b - ECII ECII - + - + - - 85M 85M 133 133 Markers per ECI 17B 17B CLONI EPIDEMICI (EC) + - + - - Markers specifici dei cloni epidemici M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M bp 2000 1500 750 250 A ECI-specific markers B ECII-specific markers Distribuzione dei markers epidemici fra i ceppi di L. monocytogenes 4b isolati in Italia 81 ceppi analizzati 14 ECI 34.6% 14 ECII 6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%) 7/44 alimentari (15.9%) 6/44 alimentari (13.6%) 1/5 ambientale (20%) 1/5 ambientale (20%) Studio del fattore di virulenza Internalina (InlA) Internalin-mediated Listeria invasion Internalina Internalina:: forma intera e forma troncata InlA intera InlA troncata Internalina dei ceppi clinici di L. monocytogenes isolati in Italia 65 ceppi analizzati mediante Western blotting 7 producono internalina troncata FARMACO Beauty BOTULISMO TOSSINA TOSSINABOTULINICA BOTULINICA the Beast… and COSMETICO ARMA BIOLOGICA Struttura e meccanismo d’azione della tossina botulinica Tossine botuliniche e targets Cluster genici codificanti per i “complessi tossici” Struttura del cluster genico per la tossina botulinica di tipo A ((bont/A) bont/A) Tipo A1 Tipo A2 ha70 ha17 ha33 botR/A orfX2 orfX1 botR/A p47 ntnh ntnh bont/A1 bont/A2 Prodotti da C. PCR di ha33 e p47 botulinum tipo A bp 62A 1882 2776 3517 1903 588 5277 3054 CL130 CL91 CL29 62A 1882 3517 588 2776 1903 5277 1636 1018 506 ha33 (774 bp) p47 (1236 bp) CL130 CL91 CL29 Pattern di restrizione con XbaI dei prodotti PCR di bont/A bp 62A 1757 1839 1882 1903 3517 2171 588 CL91 S157CL130 CL186 CL127 CL29 CL104 bp 2500 2 000 1500 Tipo A1 Tipo A2 800 Cluster genico di bont/A Strains ha33 gene p47gene bont/A RFLP type bont/A gene cluster + − − − + + A1 A2 A1 1 2 3 + + + + A2 A1 2 3 + + + + A1 A2 3 2 C. botulinum type A 10 (U.S.) 33 (Italy) 2 (U.S.) C. botulinum type Ab 4 (Italy) 1 (U.S.) C. botulinum type A(B) 5 (U.S.) 1 (U.S.) Strategia di Sequenziamento Cluster genico di BoNT/A (CEPPO C. botulinum “MASCARPONE”) K2 Frammento 1: ~ 5Kb K33 NT1 Frammento 2: ~ 5Kb K6 NT1 K2 11 1 12 2 3 13 14 4 6 15 5 16 8 7 18 19 9 10 17 20 K33 K6 Orfs individuati nella sequenza del ceppo “Mascarpone” (10,6 Kb) ORF Nucleotidi Aminoacidi % identità ceppo Kyoto-F (A2) % omologia ceppo Kyoto-F (A2) % identità ceppo NCTC2916 (A1) % omologia ceppo NCTC2916 (A1) ORFX2 (parziale) 631 210 100 100 97 99 ORFX1 429 142 88 90 99 99 botR 537 178 92 96 97 98 p47 1251 416 95 98 81 87 NTNH 3480 1159 95 97 92 95 boNT/A 3891 1296 99 99 89 94 Ruoli delle proteine accessorie • Protezione della tossina nel tratto gastrointestinale • Legame alle pareti intestinali • Interazione con i residui di carboidrati sui globuli rossi • Ruolo nella stabilità dell’agente terapeutico Differenze nella sequenza aminoacidica della tossina botulinica tipo A • Diverse proprietà antigeniche • Diversità nel riconoscimento del recettore? Ringraziamenti Paolo Aureli Francesca Floridi Laura Toti Antonella Maugliani Concetta Scalfaro