Corso di Immunologia
A.A. 2011-12
Antigeni
1
Cosa dobbiamo conoscere al termine della lezione
• La differenza tra: immunogeno, antigene, aptene
• I fattori che influenzano l’immunogenicità
• La natura chimica degli immunogeni
• La differenza tra le strutture di antigeni T-indipendenti e Tdipendenti
• Il concetto di coniugati aptene-carrier
• La caratterizzazione dei determinanti antigenici
• Il concetto di superantigeni
KEYWORDS:
• Immunogen, Antigen, Hapten, Epitope, Antigenic determinant,
Antibody, T-independent antigen, T-dependent antigen,
Hapten-carrier conjugate, Native determinant, Haptenic
determinant, Superantigen
2
Definitions
• Immunogen - A substance that induces a specific immune response.
• Antigen (Ag) - A substance that reacts with the products of a specific
immune response.
• Hapten - A substance that is non-immunogenic but which can react
with the products of a specific immune response. Haptens are small
molecules which could never induce an immune response when
administered by themselves but which can when coupled to a carrier
molecule. Free haptens, however, can react with products of the immune
response after such products have been elicited. Haptens have the
property of antigenicity but not immunogenicity.
• Epitope or Antigenic Determinant - That portion of an antigen that
combines with the products of a specific immune response.
• Antibody (Ab) - A specific protein which is produced in response to an
immunogen and which reacts with an antigen.
3
Antigeni (1)
Il riconoscimento antigenico da parte di linfociti T e B e` un aspetto fondamentale
nell'induzione della RI. Nel riconoscimento bisogna considerare almeno 3
aspetti: 1) cosa viene riconosciuto, e 2) quale linfocita e 3) quale recettore
riconosce l'antigene.
Il nome "Antigene" deriva dal greco e significa: "qualcosa che genera una sostanza
contro….".
Possiamo definire come antigene (Ag) qualsiasi molecola che reagisce con
gli elementi del sistema immunitario, comprendendo sia sostanze esogene che
endogene (nel caso di patologie autoimmuni).
Secondo una definizione molto generale, un Ag:
·
È in grado di indurre una risposta immunitaria (ovvero di provocare la
produzione di anticorpi o l'instaurarsi di una risposta cellulo-mediata)
·
È in grado di reagire col sistema immunitario (S.I.)
4
Antigeni (2)
Però, per essere più precisi, qualunque sostanza in grado di suscitare una risposta
immune si definisce IMMUNOGENICA, e viene detta IMMUNOGENO. Bisogna
quindi fare una netta distinzione operativa tra ANTIGENE e IMMUNOGENO:
l'antigene è quella sostanza in grado di legarsi ad uno specifico anticorpo
(oppure a un linfocita T): tutti gli antigeni sono potenzialmente in grado di
stimolare la produzione di anticorpi specifici, ma solo alcuni sono in grado di
farlo realmente, perché la maggior parte si comportano da APTENI, ovvero ci
riescono solo se legati ad una molecola (CARRIER) che li fa diventare
immunogeni.
Quindi, una molecola può essere antigenica (cioè può reagire con i
prodotti o componenti del S.I.) ma non essere immunogenica (cioè non
essere in grado DA SOLA di indurre una risposta immunitaria).
Quindi: "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI ANTIGENI
SONO IMMUNOGENI".
5
Antigeni (3)
EPITOPO o DETERMINANTE ANTIGENICO: parte di un antigene che entra in
contatto con il sito di legame di un Ac o col recettore per l’Ag delle cellule T. (Gli
epitopi sono praticamente le porzioni più importanti dell’antigene, capaci di
evocare la risposta immunitaria).
APTENE: molecola a basso peso molecolare (< 4 kD) in grado di agire come epitopo
ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta anticorpale.
L’aptene è quindi una molecola antigenica ma non immunogena, a meno che non
sia legata ad un CARRIER; induce una risposta immunitaria solo nel caso in cui
il S.I. sia venuto precedentemente a contatto col complesso aptene–carrier.
6
Antigeni (4)
Un antigene possiede normalmente piu` di un epitopo, quindi la risposta che
indurra` sara` policlonale, cioe` verranno attivati piu` cloni linfocitari. Vi
sono tuttavia alcune molecole antigeniche che posseggono uno o pochi
epitopi immunodominanti, e sono in grado quindi di indurre una risposta
monoclonale (se un solo clone viene attivato) od oligoclonale (quando
vengono attivati pochi cloni). All'interno di una molecola antigenica puo`
vigere
una
gerarchia
nell'immunodominanza
degli
epitopi,
con
conseguente attivazione preferenziale di alcuni cloni confronto ad altri.
7
Antigeni (7)
Attraverso prove di sostituzione aminoacidica e cross-reattività Landsteiner ha
stabilito l’importanza di alcune caratteristiche:
·
POSIZIONE degli aminoacidi con cui reagisce l’Ac
·
GRANDEZZA
·
CARICA
·
STEREOISOMERIA (stereoisomeri diversi danno risposte diverse )
8
Caratteristiche antigeni (1)
CARATTERISTICHE CHE DEVE AVERE UNA PROTEINA AFFINCHE’ FUNZIONI
DA ANTIGENE:
·
Peso molecolare (superiore a 5.000Da). Infatti, più una proteina è grande e
complessa, più verrà spezzettata e frammentata (come vedremo, le molecole
MHC hanno preferenza a legare e presentare frammenti peptidici, e non
proteine intere).
·
Complessità chimica
·
Solubilità (necessaria per il trasporto)
·
Estraneità (infatti l’Ag deve differenziarsi il più possibile dalla forma delle
proteine self, altrimenti si ha l’instaurarsi di patologie autoimmuni)
·
Dose di somministrazione: sotto certe dosi, molte proteine non sono in grado
di provocare una risposta immune. A dosi molto alte, d’altra parte, la risposta
immunitaria è inibita. In alcuni casi, dosi troppo alte o troppo basse possono
indurre stati irresponsivi noti come "Tolleranza acquisita da bassa o alta dose".
Le Risposte Secondarie in genere necessitano di una dose più bassa di Ag,
come conseguenza dell’instaurarsi della Memoria Immunologica.
·
Via di somministrazione: di solito la Via Sottocutanea è la più potente.
9
Caratteristiche epitopi (1)
1.
I determinanti antigenici devono essere accessibili agli anticorpi
(Ac)
Nel 1960 SELA & ARNON studiarono l’immunogenicità di diverse catene
laterali aminoacidiche legate ad uno scheletro polilisinico (il S.I. non
reagisce contro polimeri di molecole identiche ripetute): se il
determinante antigenico delle catene (dato da residui di ac. Glutammico
o tirosina legati a polialanina ) risulta inaccessibile agli Ac non si ha
risposta immunitaria, risposta che compare invece in seguito allo
smascheramento degli epitopi (aumentando ad esempio la distanza fra
catene)
10
Caratteristiche epitopi (2)
2.
I determinanti antigenici possono essere continui o discontinui
Negli anni ’60 A. Tassi fece degli studi su mioglobina di balena e trovò che in
questa molecola di 153 a.a. erano presenti 5 regioni in grado di provocare
una risposta anche dopo la frammentazione della molecola e che tali
regioni risultavano essere su zone esposte e flessibili. Questi tipi di
determinanti antigenici sono detti continui (o lineari) poiché dati da a.a.
disposti in modo lineare, cioè uno dopo l’altro nella sequenza primaria
della proteina. Esistono però altri tipi di determinanti, la cui esistenza è
stata dimostrata successivamente utillizzando molecole di lisozima, detti
discontinui (o conformazionali) formati da a.a che erano discontinui nella
sequenza primaria, ma che diventano contigui nella struttura terziaria,
perché sono portati ad unirsi grazie al ripiegamento tridimensionale della
proteina. (ad es. 2 regioni legate da ponti disolfuro). Alla luce di ciò
possiamo probabilmente attribuire il successo degli esperimenti di Tassi
alla relativa semplicità strutturale della globina.
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Caratteristiche epitopi (3)
Gli epitopi lineari, in particolare, sono riconosciuti sia dai linfociti T che dai
linfociti B mentre quelli conformazionali solo dai linfociti B.
ATTENZIONE: gli epitopi lineari sono anche conformazionali, ma non è
vero il contrario; infatti l’immunogenicità di una porzione proteica
dipende da come essa è presentata (potenzialmente qualsiasi porzione
di una molecola può essere immunogena se presentata correttamente).
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Caratteristiche epitopi (4)
3.
I Determinanti Antigeni possiedono alcuni residui più importanti
di altri (EPITOPI IMMUNO-DOMINANTI).
Durante l’ ipermutazione somatica gli Ac ad affinità maggiore sono quelli
diretti contro epitopi dominanti (epitopi immunodominanti) mentre quelli
meno affini contro epitopi più nascosti.
Nel corso di una risposta immunitaria si ha quindi una sorta di "Selezione
Darwiniana" tra gli epitopi più importanti, verso i quali vengono prodotti
Ac più "forti".
Da qui deduciamo che gli Ag hanno porzioni più o meno importanti e che gli
epitopi immuno dominanti si trovano su porzioni idrofiliche degli Ag
(perché piu’ facilmente raggiungibili dagli Ac) piuttosto che idrofobiche.
Essendo questi epitopi quelli contro cui, con maggiore probabilità,
reagiranno gli Ac, anche in individui diversi, sono solitamente utilizzati
per la preparazione di vaccini.
13
Caratteristiche epitopi (5)
4.
Mobilità del sito antigenico:
L’antigene è dotato di una certa mobilità strutturale in modo da permettere
all’anticorpo di "incastrarsi" bene (ricordando un po’ un meccanismo
chiave-serratura, in cui però la chiave è fatta di gomma!).
Le forze in gioco nel legame Ag-Ac (non covalente):
•
Ponti idrogeno
•
Interazioni elettrostatiche
•
Forze di Van der Waals
•
Interazioni idrofobiche
14
Factors Influencing Immunogenicity
Contribution of the Immunogen
• Foreigness
- The immune system normally discriminates between self
and non-self such that only foreign molecules are immunogenic.
• Size
- There is not absolute size above which a substance will be
immunogenic. However, in general, the larger the molecule the more
immunogenic it is likely to be.
• Chemical Composition
–
–
–
–
Primary Structure
Secondary Structure
Tertiary Structure
Quarternary Structure
Sequence determinants
Conformational
determinants
In general, the more complex the substance is chemically the more
immunogenic it will be. The antigenic determinants are created by the primary sequence of
residues in the polymer and/or by the secondary, tertiary or quaternary structure of the
molecule.
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Factors Influencing Immunogenicity
Contribution of the Immunogen
•
•
•
•
Foreigness
Size
Chemical Composition
Physical Form
– Particulate > Soluble
– Denatured > Native
In general particulate antigens are more immunogenic than soluble
ones and denatured antigens more immunogenic than the native
form.
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Factors Influencing Immunogenicity
Contribution of the Immunogen
•
•
•
•
•
Foreigness
Size
Chemical Composition
Physical Form
Degradability
– Ag processing by Ag Presenting Cells (APC)
Antigens that are easily phagocytosed are generally more immunogenic. This
is because for most antigens (T-dependent antigens, see below) the
development of an immune response requires that the antigen be
phagocytosed, processed and presented to helper T cells by an antigen
presenting cell (APC).
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Factors Influencing Immunogenicity
Contribution of the Biological System
• Genetics
– Species
– Individual
• Responders vs Non-responders
Some substances are immunogenic in one species but not in another.
Similarly, some substances are immunogenic in one individual but not
in others (i.e. responders and non-responders). The species or
individuals may lack or have altered genes that code for the receptors
for antigen on B cells and T cells or they may not have the appropriate
genes needed for the APC to present antigen to the helper T cells.
• Age -
This can also influence immunogenicity. Usually the very
young and the very old have adiminished ability to mount and immune
response in response to an immunogen.
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Factors Influencing Immunogenicity
Method of Administration
• Dose -
The dose of administration of an immunogen can influence its
immunogenicity. There is a dose of antigen above or below which the immune
response will not be optimal.
• Route
– Subcutaneous > Intravenous > Intragastric
Generally the subcutaneous route is better than the intravenous or intragastric
routes. The route of antigen administration can also alter the nature of the
response
• Adjuvant
– Substances that enhance an immune response to an Ag
Substances that can enhance the immune response to an immunogen are called
adjuvants. The use of adjuvants, however, is often hampered by undesirable
side effects such as fever and inflammation.
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Chemical Nature of Immunogens
• Proteins -
The vast majority of immunogens are proteins. These
may be pure proteins or they may be glycoproteins or lipoproteins. In
general, proteins are usually very good immunogens.
• Polysaccharides
-
Pure
lipopolysaccharides are good immunogens.
polysaccharides
and
• Nucleic Acids -
Nucleic acids are usually poorly
immunogenic. However they may become immunogenic when single
stranded or when complexed with proteins.
• Lipids -
In general lipids are non-immunogenic, although they may
be haptens.
20
Types of Antigens
T-independent
• T-independent
Antigens
-
T-independent
antigens
are
antigens which can directly stimulate the B cells to produce
antibody without the requirement for T cell help In general,
polysaccharides are T-independent antigens. The responses to
these antigens differ from the responses to other antigens.
21
Properties of T-indipendent antigens
• Polymeric structure - These antigens are characterized by the
same antigenic determinant repeated many times.
• Polyclonal activation of B cells - Many of these antigens can
activate B cell clones specific for other antigens (polyclonal
activation). T-independent antigens can be subdivided into
Type 1 and Type 2 based on their ability to polyclonally activate
B cells. Type 1 T-independent antigens are polyclonal activators
while Type 2 are not.
• Resistance to degradation - T-independent antigens are
generally more resistant to degradation and thus they persist for
longer periods of time and continue to stimulate the immune
system.
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Types of Antigens
T-independent
• Polysaccharides
• Properties
– Polymeric structure
– Polyclonal B cell
activation
• Yes -Type 1 (TI-1)
• No - Type 2 (TI-2)
– Resistance to
degradation
• Examples
– Pneumococcal polysaccharide, lipopolysaccharide
– Flagella
23
Types of Antigens
T-dependent
• T-dependent Antigens - T-dependent antigens are those that
do not directly stimulate the production of antibody without the
help of T cells. Proteins are T-dependent antigens. Structurally
these antigens are characterized by a few copies of many
different antigenic determinants
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Types of Antigens
T-dependent
• Proteins
• Structure
• Examples
– Microbial
proteins
– Non-self or
Altered-self
proteins
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Hapten-carrier conjugates
• Definition - Hapten-carrier conjugates are immunogenic molecules
to which haptens have been covalently attached. The immunogenic
molecule is called the carrier.
• Structure
Haptenic determinants
– native determinants
– haptenic
determinants
Native determinants
The actual determinant created by the hapten consists of the hapten and a few
of the adjacent residues, although the antibody produced to the determinant will
also react with free hapten. In such conjugates the type of carrier determines
whether the response will be T-independent or T-dependent.
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Riconoscimento dell’antigene (1)
I linfociti T e B hanno il recettore per l'antigene strutturalmente correlato e
codificato da una famiglia di geni simili (supergene family). Nonostante
questo,
il
loro
meccanismo
di
riconoscimento
antigenico
varia
considerevolmente. Una prima differenza e` data dal fatto che il linfocita T
riconosce il determinante antigenico associato a molecole codificate dal
MHC sulla superficie di cellule accessorie, mentre il linfocita B riconosce
il solo determinante antigenico e non richiede strettamente la presenza di
una cellula accessoria. Inoltre, e` stato osservato che i linfociti T, a
differenza dei B, per riconoscere l'antigene su di una cellula accessoria
richiedono che l'antigene sia processato o degradato o, come piu`
recentemente dimostrato, sia almeno modificata la sua conformazione.
Una differenza che ne consegue e` che il linfocita T, a differenza del B,
non discrimina tra conformazioni native e denaturate dell'antigene.
27
Riconoscimento dell’antigene (2)
I linfociti T, e piu` precisamente il loro recettore, riconoscono una sequenza
lineare di aminoacidi (circa 5-12 a.a. della struttura primaria di una
proteina) presenti in una struttura secondaria (alpha elica). Al contrario, i
linfociti B, o piu` propriamente il loro recettore immunoglobilinico, legano
sia sequenze di amminoacidi primarie o secondarie (sequenziali) che
sequenze terziarie (conformazionali).
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Riconoscimento dell’antigene (3)
Ulteriori analisi utilizzando peptidi sintetici hanno dimostrato che i linfociti T
riescono a discriminare differenze al livello anche di un solo
amminoacido. Per esempio, linfociti T regolatori specifici per il lisozima di
pollo riconoscono una modificazione di un singolo amminoacido in
posizione 3 della molecola. Inoltre, e` stato osservato che una sequenza
di 24 aminoacidi della parte carbossiterminale dell'emoagglutinina del
virus influenzale puo` attivare o indurre tolleranza a livello di cloni T
specifici (a seconda delle dosi): tuttavia, se un loop viene inserito nel
peptide, nascondendo cosi` alcuni aminoacidi, non e` piu` possibile
"tollerizzare" i cloni T in assenza di cellule accessorie: l`aggiunta di
cellule accessorie con conseguente processazione e distruzione del loop,
ripristina la possibilita` di indurre tolleranza.
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Riconoscimento dell’antigene (4)
Questa grande specificita` dei linfociti T di discriminare pochi aminoacidi
viene ulteriormente aumentata dall'associazione con le molecole MHC:
per esempio e` stato osservato che la sostituzione di un singolo
amminoacido sulla catena alpha di DR (una molecola di classe II umana)
altera il riconoscimento associativo. Cio` dimostra la fine specificita`
discriminativa del recettore del linfocita T e da` un'idea della variabilita`
del suo repertorio recettoriale.
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Antigenic Determinants
Recognized by B cells and Ab
• Composition
- Antigenic determinants recognized by B cells
and the antibodies secreted by B cells are created by the primary
sequence of residues in the polymer (linear or sequence determinants)
and/or by the secondary, tertiary or quaternary structure of the molecule
(conformational determinants).
– Proteins, polysaccharides, nucleic acids
– Sequence (linear) determinants
– Conformational determinants
• Size
- In general antigenic determinants are small and are limited to
approximately 4-8 residues. (amino acids and or sugars). The
combining site of an antibody will accommodate an antigenic
determinant of approximately 4-8 residues.
– 4-8 residues
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Antigenic Determinants
Recognized by B cells and Ab
• Composition
• Size
• Number
– Limited
– Located on the
external surfaces
of the Ag
Fe
Although, in theory, each 4-8 residues can constitute a separate antigenic determinant,
in practice, the number of antigenic determinants per antigen is much lower than what
would theoretically be possible. Usually the antigenic determinants are limited to those
portions of the antigen that are accessible to antibodies as illustrated in the Figure
(antigenic determinants are indicated in blu).
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Antigenic Determinants
Recognized by T cells
• Composition -
Antigenic determinants recognized by T cells are created
by the primary sequence of amino acids in proteins. T cells do not recognize
polysaccharide or nucleic acid antigens. This is why polysaccharides are
generally T-independent antigens and proteins are generally T-dependent
antigens. The determinants need not be located on the exposed surface of the
antigen since recognition of the determinant by T cells requires that the antigen
be proteolytically degraded into smaller peptides. Free peptides are not
recognized by T cells, rather the peptides associate with molecules coded for by
the major histocompatibility complex (MHC) and it is the complex of MHC
molecules + peptide that is recognized by T cells.
– Proteins
– Sequence determinants
• Processed
• MHC presentation
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Antigenic Determinants
Recognized by T cells
• Size - In general antigenic determinants are small and are limited to
approximately 8-15 amino acids.
– 8 -15 residues
• Number -
Although, in theory, each 8-15 residues can constitute
a separate antigenic determinant, in practice, the number of antigenic
determinants per antigen is much less than what would theoretically be
possible. The antigenic determinants are limited to those portions of the
antigen that can bind to MHC molecules. This is why there can by
differences in the responses of different individuals.
– Limited to those that can bind to MHC
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Superantigeni
Alcuni antigeni microbici (tossine batteriche, proteine retrovirali) hanno la
caratteristica di attivare molti cloni mediante una medesima sequenza
amminoacidica. Tale sequenza non si lega a molecole MHC ed al
recettore T nel sito classico di legame (assenza di restrizione genetica
nella RI), ma si lega al TCR nella zona ipervariabile comune a diversi
TCR. In tal caso si parla di superantigeni.
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Superantigens
• Definition -
When the immune system encounters a conventional T-
dependent antigen, only a small fraction (1 in 10 -105) of the T cell population is
able to recognize the antigen and become activated (monoclonal/oligoclonal
response). However, there are some antigens which polyclonally activate a large
fraction of the T cells (up to 25%). These antigens are called superantigens.
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Superantigens
Conventional Antigen
Monoclonal/Oligoclonal
T cell response
Superantigen
Polyclonal T cell response
1:4 - 1:10
1:104 - 1:105
37
Superantigens
• Definition
• Examples
– Staphylococcal enterotoxins - (food poisoning)
– Staphylococcal toxic shock toxin - (toxic shock
syndrome)
– Staphylococcal exfoliating toxin - (scalded skin
syndrome)
– Streptococcal pyrogenic exotoxins - (shock)
Although the bacterial superantigens are the best studied there are superantigens
associated with viruses and other microorganisms as well. The diseases
associated with exposure to superantigens are, in part, due to hyper activation of
the immune system and subsequent release of biologically active cytokines by
activated T cells.
38
