Laurea Magistrale: Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari e

Laurea Magistrale: Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari e Industriali.
Nome del corso: Biotecnologie in Neuroscienze
Responsabile del
Corso
Massimo Dal Monte
Altri docenti
Numero CFU e
tipologia
6 (5 frontali + 1 laboratorio)
Obiettivo formativo
generale del corso
Il corso si prefigge di fornire agli studenti le conoscenze relative all’uso
di biotecnologie nella ricerca applicata al campo delle neuroscienze.
Verranno impartiti principi di fisiologia del Sistema Nervoso Centrale,
di Neurobiologia, di Neurofisiologia. Attività ligando-recettore dei
neurotrasmettitori e meccanismi di trasduzione del segnale a livello di
membrana. Tecniche cellulari di interesse neurobiologico. Tecniche
biomolecolari applicate alle Neuroscienze: real-time RT-PCR,
differential display analysis, uso di microarray, RNA interference. Uso
di radiotraccianti nelle Neuroscienze. Uso di modelli animali nello
studio delle malattie neurodegenerative. Biotecnologie per lo sviluppo
di farmaci e di sostanze di interesse per le Neuroscienze.
Elenco degli
argomenti trattati
Presentazione del programma. I recettori sensoriali. I sensi chimici.
Gusto e olfatto. Vie ortonasali e retronasali. Le papille gustative.
Struttura anatomica delle papille gustative. Neurofisiologia delle vie
gustative. La percezione gustative. Le 5 classi di percezioni gustative.
La percezione gustativa a livello molecolare. I recettori per l'aspro e il
salato. I recettori per il dolce e l'umami. I recettori per l'amaro.
Trasduzione del segnale a valle dei recettori per il dolce e per l'amaro.
Uso di topi KO per TRPM5 e per PLCß2. Uso di topi KI condizionali.
Caratteristiche molecolari delle sostanze amare. I recettori umani per il
gusto amaro e la loro localizzazione cromosomica. Aplotipi dei
recettori per il gusto amaro. Il recettore hTAS2R38 e gli aplotipi PAV e
AVI. Taster e non taster. Preferenza per l'alccol nei non taster. La
percezione delle caratteristiche dei vini rossi e bianchi nei taster e nei
non taster. L'aplotipo K172N del recettore hTAS2R16 e la protezione
dalla malaria. Modelli di espressione eterologa per la valutazione
funzionale dei recettori umani per l'amaro. Transfezione delle cellule
HEK293T con chimere della gustducina. Espressione dei recettori per
il gusto amaro sulla membrana delle cellule HEK293T: valutazione
dell'espressione; ruolo della glicosilazione dei recettori. Conduzione di
esperimenti modello: valutazione funzionale di alcuni recettori umani
per il gusto amaro. Composti amari estratti dal luppolo. Purificazione
del gDNA dalla saliva umana. Amplificazione dei recettori hTAS2R1,
hTAS2R14, hTAS2R40. Identificazione di aplotipi dei recettori nei
diversi soggetti. Clonaggio dei recettori. Inserimento in vettori
plasmidici modificati e trasformazione di cellule competenti. Clonaggio
mediante l'uso di linker. Purificazione dei prodotti ottenuti dal
clonaggio. Transfezione di cellule HEK293T. Saggi funzionali
mediante imaging del calcio. Valutazione delle EC50 per i diversi
composti amari estratti dal luppolo. L'olfatto e la sua capacità
discriminatoria. Struttura degli odori. Gli odori e i feromoni. I
comportamenti innescati dagli odori e dai feromoni. L'organo
vomeronasale e la percezione dei feromoni. Struttura anatomica
dell'epitelio olfattivo e delle vie olfattorie. I neuroni sensitivi primari. I
glomeruli. Il tratto olfattorio. I recettori olfattivi nelle diverse specie.
Percezione olfattiva in soggetti anosmici e in soggetti anziani. Cellule
olfattive isolate e valutazione della presenza dei receottori olfattivi sulle
ciglia olfattive. I geni per i recettori olfattivi nelle diverse specie.
Riconoscimento delle strutture essenziali per la percezione olfattive
mediante l'suo di marcatori. Le vie di signalling attivate dai recettori
olfattivi. Uso di topi KO per la valutazione del ruolo delle singole
proteine nelle vie di signalling. I neuroni olfattivi rispondono in maniera
differenziale a stimoli olfattivi distinti. Risposta di singoli neuroni
olfattivi isolati a pattern di stimolazione. Excursus storico sulla ricerca
sui recettori olfattivi. La scoperta di Axel e Buck. I geni per i recettori
olfattivi. Organizzazione dei recettori olfattivi nell'epitelio. Codificazione
degli odori da parte di combinazioni di recettori olfattivi. Esperimenti di
RT PCR su singola cellula. Codificazione degli odori nel bulbo
olfattivo. Attivazione dei glomeruli da parte degli odori e studio con
tecniche di imaging. La corteccia olfattiva e la codificazione degli odori.
Significato della percezione olfattiva nell'uomo e negli animali. Odori
primari e combinazione di odori. Gli aromi. Effetto della concentrazione
degli odoranti e del contesto di presentazione sulla percezione
olfattiva. Il sistema olfattivo dei vertebrati e il sistema olfattivo degli
insetti. Stadi della percezione olfattiva. Le OBP. I recettori olfattivi e la
convergenza del segnale olfattivo dall'epitelio al bulbo olfattivo nei
vertebrati e negli insetti. Presenza dei recettori olfattivi in distretti
diversi dalla mucosa nasale. Le OBP e le PBP. Loro struttura e
funzione. Le lipocaline ela loro funzione nella comunicazione chimica.
Esesmpi di proteine utilizzate nella comunicazione chimica. Esesmpi
di OBP e PBP. Studio del ruolo delle OBP in specie diverse di
Drosophila. Uso di mutanti nulli. Interazione delle OBP con i recettori
olfattivi ed uso di mutanti nella dimostrazione dell'interazione. Le OBP
negli afidi e loro possibile utilizzo nella lotta biologica in agricoltura.
Localizzazione dei recettori per il gusto in tessuti extraorali.
Espressione delle proteine coinvolte nel signalling del sapore dolce in
cellule intestinali. Livelli plasmatici di GLP-1, GIP, insulina e glucosio in
topi gustducina KO. Secrezione di GLP-1 in risposta a stimoli dolci.
Espressione di TAS1R3 in tessuti. Espressione dei recettori per
l'amaro in cellule intestinali. Colocalizzazione dei recettori per l'amaro
con diversi peptidi gastrointestinali. Attivazione dei recettori per
l'amaro espressi in cellule intestinali da parte di sostanze amare.
Possibili ruoli funzionali dei recettori per il gusto e per l'olfatto nel tratto
gastrointestinale.
La malattia di Alzheimer (AD). Caratteristiche e statistiche della AD.
Prevalenza e incidenza della AD nelle popolazioni occidentali.
Caratteristiche delle forme di demenza diverse dalla AD. Uso di
tecniche di imaging nella diagnosi. Fattori di rischio e fattori di
protezione. Il mini mental state examination. Utilità della diagnosi
precoce. Le forme familiari di AD. Aspetti genetici della AD. Le èlacche
senili e i grovigli neurofibrillari. Caratteristiche delle placche senili.
Rilevazione delle placche senili con tecniche di imaging. Le vie
amiloidogenica e non amiloidogenica. APP, alfa-, beta- e gammasecretasi. Le mutazioni genetiche di APP. Caratteristiche strutturali di
APP. Il sorting polarizzato di APP. Produzione di peptide amiolide beta
a 40 o 42 aa nei diversi comparti cellulari. Conseguenze dell'idrolisi di
APP da parte della gamma-secretasi nei diversi comparti cellulari.
Meccanismi di clearance del peptide amiloide beta e ruolo della ApoE.
Cause e conseguenze della formazione delle placche amiloidi e
sviluppo della demenza. I grovigli neurofibrillari e la proteina tau.
Teorie battiste e tausite. Ruolo dei fenomeni di stress ossidativo e
infiammatori nella AD. Strategie nel trattamento della AD. (Massimo
Dal Monte). Marcatori molecolari di AD, loro importanza e possibili
ruoli nella valutazione della malattia. Possibili marcatori della
formazione di placche senili e grovigli neurofibrillari. Possibili
biomarcatori plasmatici e piastrinici. Biomarcatori nella saliva. Modelli
sperimentali per lo studio di AD. Riepilogo sulle vie amiloidogenica e
non-amiloidogenica e sulla formazione dei grovigli neurofibrillari.
Modelli animali di AD: topo, lampreda, caenorhabditis, drosophila.
Vantaggi, svantaggi e aspetti di AD modellizzabili nei diversi animali.
Produzione di topi transgenici PDAPP recanti il gene umano per una
forma mutata di APP sotto il controllo del promotore per il PDGF.
Lesioni cerebrali evidenziabili in diversi topi transgenici per proteine
mutate coinvolte nella AD. Test comportamentali per evidenziare lo
stato di demenza nei modelli murini: Morris water maze; Y-maze;
radial arm maze; novel object recognition test. Uso di topi PDAPP per
la produzione di vaccini contro il peptide amiloide beta.
I nuclei della base. Anatomia generale dei nuclei della base. Le
connessioni afferenti, le interconnessioni e le connessioni efferenti.
Circuiti motori e non motori. Vie eccitatorie ed inibitorie del circuito
motorio. I neuroni spinosi putaminali. Ruolo funzionale delle vie
eccitatorie e inibitorie del circuito motorio. Ruolo delle vie eccitatorie
ed inibitorie ed attivazione sequenziale dei neuroni nel circuito oculomotore. La via motoria diretta, la via motoria indiretta e le loro
interrelazioni. I nuceli della base e le malattie ipocinetiche (Parkinson)
o ipercinetiche (corea di Huntington, ballismo, emiballismo). Il morbo di
Parkinson (PD). Caratteristiche della malattia. Incidenza e prevalenza
del PD. Epidemiologia. Fattori di rischio. Protezione da parte del
tabacco e del caffè. Sintomi della malattia. Neuropatologia. I corpi di
Lewy. Caratteristiche anatomniche dei corpi di Lewy. Proteine presenti
nei corpi di Lewy. Diagnosi di PD. neuroanatomia funzionale del PD.
Le vie dopaminergiche. I parkinsonismi genetici e le proteine coinvolte
nelle forme familiari di PD. Modelli animali di perdita acuta di cellule
dopaminergiche. Modelli animali (transgenici e non transgenici) di
neurodegenerazione progressiva. Caratteristiche della alfa sinucleina.
Ruolo fisiologico e meccanismi patogenetici della alfa sinucleina.
Mutazioni della alfa sinucleina e parkinsonismi genetici. Ossidazione
della dopamina e interazioni con l'alfa sinucleina. Fibrillizzazione della
alfa sinucleina. Meccanismi proposti di tossicità della alfa sinucleina.
La parkina e la via ubiquitina-proteasoma. DJ-1 e la protezione dallo
stress ossidativo. PINK-1 e le sue funzioni intra ed extramitocondriali.
Il PD come malattia mitocondriale. Modelli sperimentali. La scoperta
dell'MPTP. Il modello rotenone. Possibili terapie neuroprotettive.
Le retinopatie proliferative. L'angiogenesi. I fattori proangiogenici. Il
sistema VEGF. HIF-1. Terapie per le retinopatie. La ROP. Fasi della
ROP. Meccanismi molecolari alla base della ROP. Il propranololo negli
emangiomi infantili. Il sistema beta adrenergico e l'angiogenesi.
Modello murino di ROP (modello OIR). Recettori beta adrenergici nella
retina. Effetto del propranololo sulla retina di topi OIR: effetti su fattori
proangiogenici, HIF-1, neovascolarizzazione, vascular leakage. Effetto
del beta blocco specifico su fattori proangiogenici,
neovascolarizzazione e risposte elettrofisiologiche nella retina di topi
OIR. Effetto della stimolazione con isoproterenolo dei recettori beta
adrenergici: desensitizzazione dei recettori beta 2 adrenergici . Ruolo
dei recettori beta 3 adrenergici nei fenomeni di angiogenesi retinica in
un modello ex vivo.
La tomografia ad emissione di positroni (PET). Caratteristiche e
funzionamento della PET: Isotopi utilizzabili. Principio di azione dei
traccianti. Il 18F-FDG, la sua captazione da parte della cellula ed il suo
metabolismo. Il ciclotrone. Principi di fisica sulla produzione di
positroni. Vantaggi e svantaggi della PET. Applicazioni della PET in
neurologia: relazione fra struttura e funzione delle diverse aree
cerebrali; valutazione di malattie neurodegenrative; valutazione dello
sviluppo delle diverse aree cerebrali; individuazione di foci epilettici.
Applicazioni della PET in oncologia. Applicazioni della PET in
cardiologia.
Seminari di 2 ore ciascuno su argomenti attinenti l’applicazione delle
biotecnologia alle neuroscienze tenuti da docenti dell’Università di Pisa
e del CNR.
Testi consigliati
Nueroscienze, a cura di D. Purves et al. Zanichelli.
Illustrazione di
eventuali attività di
laboratorio e/o
esercitazioni
Estrazione di proteine da campioni biologici. Dosaggio delle proteine.
Separazione delle proteine mediante SDS-PAGE. Western blot.
Analisi densitometrica mediante software dedicato.
Modalità di
svolgimento delle
prove d’esame
Orale, con votazione in trentesimi.
Propedeuticità
Conoscenze richieste Fisiologia Generale, Citologia, Biochimica, Biologia Molecolare.