H/E IHC FISH Mutazione ? 1 Si vuole valutare la presenza del virus, e tipizzarlo Il protocollo prevede - l’estrazione del DNA - l’amplificazione con primer specifici, sia per il DNA umano (controllo interno), sia il DNA virale - l’ibridazione in situ per la tipizzazione - si valuta solo la presenza - non necessario delimitare l’area, si possono anche unire 2 blocchi differenti (purchè dello stesso paziente, ovviamente!) - attenti alle contaminazioni: nuova lama del bisturi (non è sufficiente la pulizia, anche se accurata, con alcool) Si vuole valutare la presenza di un riarrangiamento, che è oncogenico Non è importante quale riarrangiamento sia, l’importante è che sia dominante: questo è indice della presenza di una popolazione cellulare dominante sulle altre (“neoplastica”) Le dimensioni del riarrangiamento costituiscono la “firma” di quelle cellule neoplastiche FR2-JH FR3-JH 2 Frammento FR2 Frammento FR3 1998: linfonodo cute 1999: linfonodo milza 2007: linfonodo cervicale destro Frammento V1-8 Si vuole valutare la presenza di mutazioni, che sono oncogeniche - si valuta la presenza di un riarrangiamento dominante Le mutazioni sono presenti solo nelle cellule neoplastiche (non è detto in tutte!) Il protocollo prevede - non necessario delimitare l’area, a meno di rare cellule positive dopo IHC l’estrazione del DNA l’amplificazione con primer specifici purificazioni e sequenziamento Il protocollo non è in grado di distinguere tra un frammento con la mutazione e un frammento wild-type - si valuta la presenza di una mutazione, presente solo nelle cellule neoplastiche. - bisogna evitare il piu’ possibile che cellule sane contaminino l’analisi. - la macrodissezione è fondamentale nei casi in cui il tessuto sano e quello tumorale sono frammisti 3 4