analisi dei polimorfismi del gene della proteina prionica

Large Animals Review, Anno 11, n. 3, Giugno 2005
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ANALISI DEI POLIMORFISMI DEL GENE DELLA
PROTEINA PRIONICA IN RAZZE OVINE
AUTOCTONE DEL PIEMONTE
P.L. ACUTIS, S. PELETTO, L. SBAIZ, M.V. RIINA, M.G. MANIACI,
G. RU, G. MODA°, M. CARAMELLI
CEA (Centro di referenza per le Encefalopatie Animali), Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta,
Via Bologna 148, 10154 Torino
°Regione Piemonte, Direzione di Sanità Pubblica, Corso Stati Uniti 1, 10128 Torino
La suscettibilità degli ovini alla scrapie è primariamente condizionata dal ceppo infettante e dai polimorfismi del gene della
proteina prionica (PrP) ovina a livello di tre codoni corrispondenti agli aminoacidi in posizione 136, 154 e 171. Con la Decisione 2003/100 della Commissione Europea ogni Stato Membro ha introdotto un programma di selezione per la resistenza alle
Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (EST) in tutte le razze ovine. Scopo del presente lavoro è stato di determinare le frequenze alleliche e genotipiche di cinque razze autoctone del Piemonte al fine di acquisire i dati necessari all’introduzione dei
piani di selezione. I polimorfismi del gene della PrP ai codoni 136, 154 e 171 di 1876 arieti puri o incroci, appartenenti alle
razze Biellese (n=1207), Delle Langhe (n=265), Frabosana (n=171), Sambucana (n=197) e Saltasassi (n=36) sono stati determinati mediante sequenziamento diretto e pirosequenziamento. I nostri risultati mostrano che, per le razze Delle Langhe, Frabosana e Sambucana, la frequenza relativamente alta dei genotipi resistenti e semi-resistenti permette l’introduzione di piani
di selezione senza un incremento del rischio di estinzione di queste razze. Al contrario, la selezione per la resistenza alla scrapie nelle razze Biellese e Saltasassi dovrà considerare la bassa frequenza dell’allele ARR, che nella Biellese sembra anche essere soggetto a selezione negativa da parte degli allevatori. In queste ultime due razze, oltre ai cinque alleli più comuni (VRQ,
ARQ, ARR, AHQ e ARH), è stato inoltre rilevato l’allele raro ARK, alle frequenze più alte mai riportate in una razza ovina.
Summary
Susceptibility to scrapie in sheep is primarily conditioned by the infective scrapie strain and by the polymorphisms of the
ovine prion protein (PrP) gene at the codons corresponding to amino acids at position 136, 154 and 171. According to Commission Decision 2003/100/EC, each Member State has introduced a breeding program for resistance to Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE) in all sheep breeds. Aim of this study was to determine PrP allele and genotype frequencies of
five autochthonous sheep breeds in Piedmont, in order to support the development of selection programmes. PrP gene polymorphisms at codons 136, 154 and 171 of 1876 pure-bred and cross-bred rams, belonging to Biellese (n=1207), Delle Langhe (n=265), Frabosana (n=171), Sambucana (n=197) and Saltasassi (n=36) breeds were detected by direct sequencing and
pyrosequencing. Our results show that, for Delle Langhe, Frabosana and Sambucana breeds, the relatively high frequency of
resistant and semi-resistant genotypes allows the introduction of selection programmes without increasing the extinction risk
of these breeds. Nevertheless breeding for scrapie resistance in Biellese and Saltasassi breeds will have to consider the low
frequency of ARR allele, which in Biellese also seems to be submitted to a negative selection by farmers. In these breeds, aside from the five most common alleles (VRQ, ARQ, ARR, AHQ and ARH), the rare ARK allele was also found, with the highest
frequencies reported so far in an ovine breed.
INTRODUZIONE
La scrapie è una malattia neurodegenerativa ad esito fatale della pecora e della capra, archetipo del gruppo delle
Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (EST). Le EST, o
malattie da prioni, includono l’encefalopatia spongiforme
bovina (BSE) e la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) del-
l’uomo. Nonostante la scrapie sia una patologia ad eziologia infettiva, la suscettibilità alla malattia nella pecora è
fortemente influenzata dai genotipi del gene codificante la
proteina prionica (PrP)13, in particolare dalle varianti aminoacidiche ai codoni 136, 154 e 171. Queste tre triplette
nucleotidiche polimorfe codificano per sette alleli:
A 136R 154Q 171 (ARQ), VRQ, TRQ, ARR, AHQ, ARH e
ALTRE SPECIE
Riassunto
40
Analisi dei polimorfismi del gene della proteina prionica in razze ovine autoctone del Piemonte
ARK2,3,4,9,10,12. L’allele VRQ è associato ad alta suscettibilità
alla scrapie3,13 mentre l’allele ARR conferisce resistenza alla malattia. Sulla base di queste conoscenze, l’Unione Europea ha deciso di controllare le EST ovine attraverso l’applicazione di piani di selezione dei soggetti portatori dei
caratteri di resistenza genetica. La legislazione comunitaria
ha pertanto introdotto la possibilità di eccezioni all’abbattimento e completa distruzione di tutti gli animali appartenenti ad un focolaio di EST ovina per i montoni da riproduzione di genotipo ARR/ARR e per le pecore eterozigoti
ARR, purché non portatrici dell’allele sensibile VRQ. Ulteriori deroghe, finalizzate a dilazionare gli abbattimenti
nel tempo, sono previste per le razze in cui la frequenza
dell’allele ARR è troppo bassa per consentire agevolmente
una rapida rimonta. Inoltre, a seguito della Decisione
2003/100/CE8, ogni Stato Membro ha introdotto un piano
di selezione genetica per la resistenza alle EST ovine con
lo scopo di aumentare la frequenza dell’allele ARR e ridurre gli alleli suscettibili. In particolare si dovranno selezionare, su base inizialmente volontaria e quindi obbligatoria
dall’aprile 2005, gli ovini di razza pura iscritti ai libri o di
particolare valore genetico al fine di aumentare la frequenza dell’allele ARR, eliminare VRQ e ridurre ARQ. Tale
obiettivo verrà perseguito attraverso un programma di selezione che fissa i seguenti requisiti minimi:
1. castrazione o macellazione di tutti i riproduttori maschi
portatori dell’allele maggiormente suscettibile (VRQ);
2. divieto di spostamento delle pecore portatrici dell’allele VRQ, eccetto che per l’invio al macello;
3. impiego per la riproduzione dei soli maschi inclusi nel
programma.
Ci si propone in tal modo di arrivare ad una certificazione
delle greggi in base al loro livello di resistenza genetica alle
EST. I livelli minimi previsti dalla Decisione sono i seguenti:
• livello I: greggi composte unicamente da ovini con genotipo ARR/ARR;
• livello II: greggi la cui progenie discende esclusivamente da montoni con genotipo ARR/ARR.
Tali certificazioni avranno ripercussioni sugli scambi
commerciali di animali, seme, ovuli, embrioni, che favoriranno gli ovini ARR/ARR. Deroghe ad alcuni requisiti sono previste nel caso di razze locali minacciate di abbandono o con frequenza dell’allele ARR inferiore al 25%. Per le
razze con frequenza di ARR inferiore al 10% può essere
ottenuta una deroga dall’intero programma di selezione, a
condizione che tali razze siano sottoposte a programmi di
sorveglianza della scrapie. In effetti, l’applicazione dei piani di selezione potrebbe avere un notevole impatto su
quelle razze considerate rare, portando come conseguenze
un “inbreeding” eccessivo o la perdita di caratteri produttivi. Il Centro di Referenza per le Encefalopatie Animali
dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta ha svolto nel presente lavoro, in
collaborazione con la Regione Piemonte ed i Servizi Veterinari delle ASL, un’indagine sulle frequenze alleliche e
genotipiche del gene della PrP delle razze autoctone piemontesi, al fine di acquisire i dati necessari all’introduzione dei piani di selezione. In Piemonte la popolazione ovina è costituita da 3.272 greggi con un totale di 106.000 capi, di cui circa la metà (48.000 capi in 907 greggi) di razza
Biellese. In questa razza fu descritto da Cravero et al. nel
1976 il primo caso di scrapie in Italia5 e ad oggi sono stati
registrati altri 5 focolai. Le altre razze autoctone piemontesi comprese in questo studio sono le razze Delle Langhe
(2600 capi in 59 greggi), Sambucana (3600 capi in 57 greggi), Frabosana (5600 capi in 70 greggi) e Saltasassi (2500
capi negli anni ’60-’70, non vi sono dati recenti).
MATERIALI E METODI
Sono stati analizzati 1876 campioni di sangue in EDTA
provenienti da arieti di razza Biellese (n=1207, da 113 allevamenti), Delle Langhe (n=265, da 67 allevamenti), Frabosana (n=171, da 45 allevamenti), Sambucana (n=197, da 47
allevamenti) e Saltasassi (n=36, da 16 allevamenti). Fra gli
arieti di razza Biellese 251 erano classificati come incroci. Il
DNA genomico è stato estratto mediante kit del commercio
(Qiagen) e parte della sequenza codificante la PrP ovina è
stata amplificata mediante PCR. La reazione di PCR è stata
eseguita in un volume di 50 µl contenente 0,5-1 µg di DNA
genomico, 200 µm dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1 U Taq DNA
polymerase (HotStarTaq; Qiagen) e 1 µm di ciascun primer,
pTaqMan136-F (+) (5’-TGCAGCTGGAGCAGTGG-3’) e
pPyroPCR-R (-) (5’-CCTTGGTGGTGGTGGTGA-3’).
Questi primer si legano al DNA target del gene PrP ai codoni 119-125 e 198-192, rispettivamente. La reazione di amplificazione è stata eseguita secondo i seguenti parametri: 41
cicli di 1 min. a 94°C, 1,5 min. a 58°C e 1 min. a 72°C, con
una fase finale di estensione di 7 min. a 72°C. Per quanto riguarda i soggetti di razza Biellese, i prodotti di amplificazione sono stati analizzati per la determinazione dei polimorfismi del gene PrP mediante sequenziamento diretto su sequenziatore automatico monocapillare ABI Prism 310 (Applied Biosystems) utilizzando come primer di sequenza il
pTaqMan136-F e il pPyroPCR-R. Gli arieti appartenenti alle altre razze incluse in questo studio sono stati genotipizzati
mediante Pyrosequencing, una nuova tecnologia di sequenziamento in tempo reale14,15. Il principio chimico del Pyrosequencing si basa su un sistema di cascata enzimatica:
quattro enzimi e due substrati specifici rivelano, con l’emissione di un segnale luminoso, l’incorporazione del nucleotide complementare alla base del filamento del DNA templato. Il segnale luminoso, rivelato e rappresentato come un
picco in un grafico (pirogramma), è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati. È stata effettuata un’analisi statistica mediante test del “Chi quadro” per paragonare le frequenze alleliche tra arieti Biellesi puri e incroci e, nel gruppo degli animali di razza pura, tra arieti sopra e sotto i 18
mesi di età. Secondo l’uso locale gli arieti sono selezionati
come riproduttori a 18 mesi. L’intervallo di confidenza esatta binomiale del 95% è stato ottenuto per ogni frequenza
allelica.
RISULTATI
Le frequenze alleliche e genotipiche sono riportate rispettivamente nel Grafico 1 e nella Tabella 1. Le analisi genetiche hanno mostrato una soddisfacente frequenza dell’allele
ARR (32,0-36,3%) nelle razze Delle Langhe, Frabosana e
Sambucana, dove il genotipo resistente ARR/ARR è presente ad una frequenza del 9,6-13,1%. I genotipi cosiddetti semi-resistenti (ARR/—-, escluso ARR/VRQ) rappresentano
GRAFICO 1 - Alleli del gene PrP rilevati nelle razze comprese nello studio e loro frequenze.
Tabella 1
Genotipi del gene PrP rilevati nelle razze comprese nello studio e loro frequenze
BIELLESE
FRABOSANA
41
ALTRE SPECIE
Large Animals Review, Anno 11, n. 3, Giugno 2005
GENOTIPO
DELLE LANGHE
SAMBUCANA
SALTASASSI
ARR/ARR
12,0
1,4
9,6
13,1
2,8
ARR/ARQ
41,3
11,4
34,3
36,7
16,7
ARR/ARH
4,3
0,5
3,4
2,1
2,8
ARR/AHQ
1,1
0,7
3,4
2,8
2,8
ARQ/ARQ
32,2
56,3
25,3
26,0
44,4
ARQ/AHQ
0,9
5,5
9,0
4,8
2,8
ARQ/ARH
4,3
5,7
3,4
0,7
5,6
AHQ/AHQ
–
0,2
–
–
–
AHQ/ARH
–
0,4
0,6
–
–
ARH/ARH
0,5
0,2
–
–
–
ARR/VRQ
0,9
1,2
3,9
4,8
–
ARQ/VRQ
2,5
9,9
6,7
6,9
2,8
AHQ/VRQ
–
0,3
0,6
0,3
2,8
ARH/VRQ
–
0,7
–
0,3
2,8
VRQ/VRQ
–
0,7
–
1,4
–
AHQ/ARK
–
0,3
–
–
–
ARH/ARK
–
0,3
–
–
–
ARQ/ARK
–
3,8
–
–
11,1
ARR/ARK
–
0,1
–
–
2,8
ARK/VRQ
–
0,2
–
–
–
ARK/ARK
–
0,2
–
–
–
42
Analisi dei polimorfismi del gene della proteina prionica in razze ovine autoctone del Piemonte
complessivamente il 46,7% (Delle Langhe), 41,1% (Frabosana) e il 41,6% (Sambucana). In queste razze è presente
anche l’allele VRQ associato a massima suscettibilità alla
scrapie (1,7-7,6%). L’allele wild-type ARQ, considerato
molto sensibile in Italia, è presente ad alta frequenza (50,556,7%). In totale i genotipi considerati a rischio rappresentano una percentuale variabile dal 41,3 al 49,3%. Nelle razze Biellese e Saltasassi i dati mostrano una bassa frequenza
dell’allele ARR (8,3% e 15,3%, rispettivamente) e solamente l’1,4% degli arieti Biellesi e il 2,8% degli arieti Saltasassi
esaminati possiede il genotipo ARR/ARR resistente alla
scrapie. I genotipi semi-resistenti sono presenti con bassa
frequenza (12,6% Biellese e 22,3% Saltasassi). Inoltre gli alleli ad alto rischio VRQ e ARQ sono stati rilevati con frequenza piuttosto alta: rispettivamente 6,8% e 74,4% nella
Biellese e 4,2% e 63,9% nella Saltasassi. L’insieme dei genotipi associati a suscettibilità alla scrapie comprende l’81,1%
degli arieti di razza Biellese e il 61,2% degli arieti di razza
Saltasassi. In queste due razze, oltre ai cinque alleli più comuni (VRQ, ARQ, ARR, AHQ e ARH), è stato rilevato l’allele raro ARK ad una frequenza particolarmente alta (2,5%
Biellese; 6,9% Saltasassi). Nella razza Biellese, che risulta
essere quella più campionata e rappresentativa del patrimonio ovino piemontese, è stato possibile approfondire lo studio dei dati ottenuti dalle analisi genetiche. In questa razza
sono stati messi in evidenza tutti i 21 possibili genotipi. L’allele ARK è stato rilevato in tutti i sei possibili genotipi, incluso il genotipo omozigote ARK/ARK e la frequenza totale
di genotipi ARK/—- è del 4,9%. Le frequenze alleliche relativamente agli arieti di razza Biellese pura e agli incroci sono riportate nella Tabella 2. L’analisi statistica effettuata sulle frequenze alleliche di questi due gruppi ha evidenziato
una frequenza di ARR significativamente più bassa fra gli
ovini Biellesi puri. Inoltre, il confronto tra le frequenze alleliche degli arieti Biellesi puri di età superiore ed inferiore ai
18 mesi ha mostrato una diminuzione significativa della frequenza di ARR nei soggetti sopra i 18 mesi, mantenuti in vita per la riproduzione (Tabella 3).
DISCUSSIONE
In questo studio vengono riportate le frequenze dei polimorfismi del gene della PrP delle principali razze autoctone
piemontesi. I risultati rivelano che tutte le razze esaminate
presentano l’allele VRQ, da sottoporre a selezione negativa.
La frequenza dei genotipi resistenti e semi-resistenti
(ARR/—-) è relativamente alta nelle razze Delle Langhe,
Frabosana e Sambucana, anche se l’allele resistente ARR
presenta una frequenza inferiore a quella riscontrata in altre
importanti razze ovine italiane quali la razza Sarda
(ARR=39%), Comisana (ARR=41,1%) e Massese
(ARR=45,9%). Quindi, in queste razze, benché considerate
rare, la selezione genetica per la resistenza alla scrapie è applicabile e non comporterà verosimilmente un aumento del
rischio di estinzione e di inbreeding. Al contrario, programmi di allevamento per la resistenza alla scrapie applicati alle
razze Biellese e Saltasassi dovranno tenere conto della bassa
frequenza dell’allele ARR. Nella razza Biellese tale bassa frequenza è ancora più evidente quando i soggetti di razza pura e gli incroci sono considerati separatamente e la frequenza dell’allele ARR nei due gruppi è messa a confronto. L’al-
Tabella 2
Confronto tra le frequenze alleliche del gene PrP
degli arieti Biellesi puri e degli incroci
Razza pura
Incroci
ALLELE
P value
(I.C. 95%)
N.
FREQ. (%)
N.
FREQ. (%)
ARR
137
7,2
64
12,7
0,0006
ARQ
1452
75,9
345
68,7
0,001
AHQ
52
2,7
39
7,8
0,0000001
ARH
87
4,6
12
2,4
n.s.
VRQ
131
6,9
34
6,8
n.s.
ARK
53
2,8
8
1,6
n.s.
Tot.
1912
100,0
502
100,0
Tabella 3
Confronto tra le frequenze alleliche del gene PrP
degli arieti Biellesi puri sopra e sotto 18 mesi di età
> 18 mesi
< 18 mesi
ALLELE
P value
(I.C. 95%)
N.
FREQ. (%)
N.
FREQ. (%)
ARR
43
5,01
90
8,69
0,002
ARQ
678
79,02
760
73,36
0,004
AHQ
25
2,91
27
2,61
n.s.
ARH
24
2,80
63
6,08
0,0006
VRQ
65
7,58
66
6,37
n.s.
n.s.
ARK
23
2,68
30
2,90
Tot.
858
100,00
1036
100,00
lele di resistenza raggiunge valori superiori negli incroci
(12,7%), mentre risulta significativamente meno frequente
negli animali di razza pura. Il motivo per cui così pochi animali di questa razza siano portatori dell’allele ARR è difficile da spiegare. Una possibile spiegazione è che l’allele resistente sia legato ad un qualche carattere non desiderato e
sia perciò (consciamente o inconsciamente) selezionato negativamente da parte degli allevatori. Un’interessante prova
indiretta a supporto dell’ipotesi che vede l’allele ARR oggetto di pressione selettiva negativa è rappresentata dall’analisi
statistica delle frequenze alleliche degli arieti di età superiore e inferiore ai 18 mesi. La diminuzione significativa della
frequenza dell’allele ARR negli animali sopra i 18 mesi, tenuti in allevamento ai fini della riproduzione, suggerisce che
gli animali portatori del carattere di resistenza siano preferibilmente esclusi dalla rimonta. Si tratterebbe quindi di un
caso di un possibile link tra alleli del gene PrP e caratteri
quali-quantitativi non graditi. In tal caso è plausibile non
tanto un’influenza diretta del gene PrP, quanto un linkage
con un gene sfavorevole, selezionato casualmente. In uno
studio condotto in Germania7, De Vries et al. hanno analizzato l’associazione tra caratteri produttivi e genotipo in sette
razze tedesche. I parametri analizzati comprendevano la
massa muscolare, il tipo e la qualità della lana e l’incremento ponderale giornaliero. In nessuna di queste razze è stata
Large Animals Review, Anno 11, n. 3, Giugno 2005
CONCLUSIONI
In relazione al piano di selezione genetica per la resistenza alla scrapie, i risultati emersi da questo lavoro offrono lo
spunto per alcune considerazioni: la conoscenza accurata
delle caratteristiche genetiche di una razza è un requisito
indispensabile per la programmazione di un adeguato piano di selezione e l’approccio più appropriato alla genotipizzazione di razze poco conosciute è l’uso di metodi in
grado di rilevare anche alleli rari (es. metodiche di sequenziamento). Nel nostro studio è stato rilevato l’allele ARK
nelle razze Biellese e Saltasassi con la più alta frequenza
mai riportata. Quindi, metodi in grado di rilevare questo
allele dovranno essere inclusi nei piani di selezione genetica
per queste razze al fine di evitare di refertare erroneamente
come resistenti (ARR/ARR) genotipi semiresistenti
ARR/ARK. In conformità alla Decisione 2003/100/CE, la
razza Biellese, che ha una frequenza dell’allele ARR inferiore al 10%, potrebbe essere esclusa dall’intero programma
di selezione, presentando in alternativa un programma di
controllo della scrapie. La Regione Piemonte, considerata
l’importanza di questa razza autoctona e le difficoltà di attuazione di piani di controllo della scrapie basati su altri
approcci, ha predisposto un piano di selezione genetica re-
gionale per la razza Biellese. Tale piano prevede la genotipizzazione a tappeto della linea maschile, oltre a quella dei
soggetti di sesso femminile di particolare valore genetico.
Dal momento che, ad oggi, non sono stati riscontrati casi
positivi alla scrapie portatori dell’allele ARK, potrebbe essere presa in considerazione la possibile inclusione di questo allele nei piani di selezione per la resistenza alla scrapie.
Ulteriori studi sono quindi necessari per comprendere se
l’allele ARK sia associato a resistenza alle EST e se possa
essere selezionato per migliorare lo status di resistenza alle
EST nelle razze autoctone del Piemonte.
Parole chiave
Scrapie, selezione genetica, proteina prionica, gene, polimorfismo.
Key words
Scrapie, genetic selection, prion protein, gene, polymorphism.
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ALTRE SPECIE
rilevata associazione significativa tra produttività e presenza
dell’allele ARR e del genotipo resistente, rispettivamente.
Negli Stati Uniti1, Alexander et al. hanno analizzato l’influenza dell’allele ARR sul numero medio di agnelli per parto e sul peso allo svezzamento in quattro razze ovine (Columbia, Hampshire, Rambouillet e Suffolk) ed in pecore
meticce. Nella razza Suffolk, un numero significativamente
inferiore di agnelli per parto è stato osservato nelle pecore
che presentavano l’allele di resistenza.
Nelle razze Biellese e Saltasassi, non solo sono stati rilevati i cinque alleli più comuni (VRQ, ARQ, ARR, AHQ e
ARH), con i relativi 15 genotipi, ma è stato riscontrato anche l’allele raro ARK, alle frequenze più alte mai riportate
in letteratura in una razza ovina. Altri recenti studi hanno
riportato una frequenza di questo allele: nella pecora della
Mongolia (0,6%)11, nella pecora dell’Oklahoma (0,35%)6
e in diverse razze da latte greche (1,6%)4. Il campione
molto ampio di arieti Biellesi compreso nel nostro studio
ha permesso di rilevare in questa razza tutti i sei possibili
genotipi del gene della PrP con l’allele ARK, incluso il genotipo omozigote ARK/ARK. La ragione per cui questo
allele non è raro nelle razze Biellese e Saltasassi, dove è
presente ad una frequenza paragonabile agli alleli AHQ e
ARH, è sconosciuta. L’analisi statistica effettuata sugli
arieti di razza Biellese evidenzia che la frequenza di ARK
negli animali giovani non è significativamente differente
da quella degli adulti, allevati a fini riproduttivi, indicando
che l’allele ARK non è selezionato negativamente dagli allevatori. Attualmente non sono disponibili dati riguardo al
livello di rischio per la scrapie dell’allele ARK. Le analisi
genetiche eseguite dal Laboratorio su 35 ovini colpiti da
scrapie nell’ambito della gestione di un focolaio di razza
Biellese non hanno riscontrato la presenza dell’allele ARK
in alcuno di essi. Inoltre, Billinis et al. hanno riscontrato la
presenza di ARK limitatamente ad ovini sani in uno studio
effettuato recentemente in Grecia su focolai di scrapie4.
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