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Contributi scientifici
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Frequenze alleliche e genotipiche
del gene PrP
nelle popolazioni Ovine lucane di
razza Comisana, Merinizzata e Sarda
G. Santagada
C. Laurenza
M. Natale
I.Z.S. della Puglia
e della Basilicata
M. Corvonato
S. Colussi
S. Peletto
F. Zuccon
M.V. Riina
M.G. Maniaci
M. Caramelli
P.L. Acutis
I.Z.S. del
Piemonte, Liguria
e Valle d’Aosta CEA Centro di
Referenza per le
Encefalopatie
Animali
Introduzione
La scrapie è una malattia neurodegenerativa
ad esito fatale della pecora e della capra,
archetipo del gruppo delle Encefalopatie
Spongiformi Trasmissibili (EST).
Le EST, o malattie da prioni, includono l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e la
malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) dell’uomo. Nonostante la scrapie sia una patologia
ad eziologia infettiva, la suscettibilità alla
malattia nella pecora è fortemente influenzata dal polimorfismo del gene codificante
la proteina prionica (PrP), in particolare ai
codoni 136, 154 e 171.
Queste tre triplette nucleotidiche codificano per sette alleli: A136R154Q171 (ARQ),
VRQ, TRQ, ARR, AHQ, ARH e ARK.
Gli alleli VRQ, ARQ e ARH sono associati a
suscettibilità alla scrapie mentre l’allele ARR
conferisce resistenza alla malattia. L’allele
AHQ è associato a resistenza o suscettibi-
lità, a seconda della razza ovina e dei Paesi
considerati: nelle razze italiane risulta conferire suscettibilità.
Gli alleli TRQ e ARK sono molto rari e non è
noto il loro livello di rischio: in Italia è stato
recentemente segnalato un caso di scrapie
naturale in un ovino con genotipo ARK/ARH.
Sulla base di queste conoscenze, l’Unione
Europea ha deciso di controllare le EST
ovine attraverso l’applicazione di piani di
selezione dei soggetti portatori dei caratteri di resistenza genetica.
La legislazione comunitaria ha pertanto introdotto la possibilità di eccezioni all’abbattimento e completa distruzione di tutti gli
animali appartenenti ad un focolaio di EST
ovina per i montoni da riproduzione di genotipo ARR/ARR e per le pecore eterozigoti
ARR, purché non portatrici dell’allele sensibile VRQ. Inoltre, a seguito della Decisione
2003/100/CE, ogni Stato Membro ha introdotto un piano di selezione per la resisten-
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za alle EST ovine con lo scopo di aumentare la frequenza dell’allele ARR e ridurre gli
alleli suscettibili. In particolare si devono
obbligatoriamente selezionare gli ovini di
razza pura iscritti ai libri o appartenenti ad
allevamenti di elevato merito genetico al
fine di aumentare la frequenza dell’allele
ARR, eliminare VRQ e ridurre ARQ. In Italia
il piano di selezione nazionale è disciplinato dal D.M. 17 dicembre 2004 e prevede in sintesi le seguenti modalità esecutive:
• Genotipizzazione di tutti i maschi riproduttori ed eliminazione dei portatori
dell’allele VRQ
• Eventuale genotipizzazione delle femmine con eliminazione di quelle portatrici dell’allele VRQ
• Impiego mirato dei riproduttori in modo tale da arrivare ad una certificazione
delle greggi in base al loro livello di
resistenza genetica alle EST.
I livelli previsti sono i seguenti:
I: greggi con tutti ovini ARR/ARR
II: ovini tutti ARR/--- e montoni ARR/ARR
III: greggi con progenie discendente da
montoni ARR/ARR
IV: greggi con progenie discendente da
montoni ARR/--V: aderenti al piano
I montoni sono raggruppati, in base al genotipo, in classi che indicano agli allevatori quale deve essere la preferenza di
impiego degli stessi (tabella 1).
Il Ministero della Salute intende infatti sollecitare, ma non forzare, l’uso di arieti con
genotipo resistente, in quanto non si vuole
creare, con una selezione troppo spinta e
che tenga conto solo del gene PrP, ripercussioni negative sui caratteri produttivi.
Per lo stesso motivo le razze sono state
divise in base alla frequenza dell’allele ARR
in due gruppi: 1) razze con ARR>40%; 2)
razze con ARR<40%. I due gruppi si differenziano per l’indicazione di una diversa
scala di utilizzo decrescente dei montoni
e per il fatto che è vietato l’utilizzo degli
arieti di classe 3 trascorsi 5 anni dall’adesione al piano per il primo gruppo e 7 anni
per il secondo gruppo. Trascorsi 10 anni,
per entrambi i gruppi è consentito l’uso
solo di arieti di classe 1.
Il Decreto demanda ad ogni Regione la
predisposizione di un proprio piano di
selezione e per questo scopo è importan-
te la conoscenza delle frequenze alleliche
delle razze presenti sul territorio regionale.
La popolazione ovina della Basilicata consta di circa 327.300 capi suddivisi in 2214
allevamenti di soli ovini e 2989 allevamenti
misti ovi-caprini. La razze maggiormente
rappresentate sono la Sarda, la Comisana e
la Merinizzata. Dati sulle frequenze alleliche di queste razze sono riportati in uno
studio condotto dall’ASSO.NA.PA. su base nazionale, che ha compreso complessivamente 17 razze ovine, finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole e Forestali.
Le frequenze dell’allele ARR sono risultate
del 42,2% nella Merinizzata, del 41,3% nella Comisana, del 26,9% negli ovini di razza
Sarda provenienti dalla penisola e del
42,26% negli ovini di razza Sarda provenienti dalla Sardegna.
Sulla base di questi dati la Regione Basilicata ha predisposto un piano che ricalca essenzialmente il piano nazionale.
Scopo del presente lavoro è stato determinare le frequenze alleliche del gene PrP
negli ovini della Basilicata appartenenti alle
tre razze sopra citate, con l’obiettivo di verificare a livello regionale la corrispondenza con le frequenze attese per queste razze e la conseguente idoneità del piano
regionale e determinare quale schema di
selezione debba essere applicato ad ognuna di esse, tenendo conto della soglia
del 40% per l’allele ARR.
Materiali e metodi
Sono stati analizzati 792 campioni di sangue in EDTA provenienti da ovini di razza
Comisana (n = 269, di cui 5 femmine, da
32 allevamenti in provincia di Matera e 5 in
provincia di Potenza), Merinizzata (n = 262,
di cui 24 femmine, da 24 allevamenti in
provincia di Matera e 12 in provincia di Potenza) e Sarda (n = 261, da 13 allevamenti
in provincia di Matera e 14 in provincia di
Potenza). In totale sono stati campionati 62
allevamenti in provincia di Matera e 31 in
provincia di Potenza: in alcuni allevamenti
erano presenti più razze.
Il DNA genomico è stato estratto con un estrattore di tipo semiautomatico KingFisher
96 (ThermoLabsystems), utilizzando il Kit
“NucleoMag 96 Blood” (Macherey-Nagel),
secondo le istruzioni del produttore.
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Parte della sequenza codificante la PrP ovina è stata amplificata mediante reazione di
PCR eseguita in un volume di 50 µl e contenente 0,5-1 µg di DNA genomico, 200 µM
dATP, 200 µM dGTP, 200 µM dCTP, 400 µM
dUTP, 3 mM MgCl2, 1.5 U Taq DNA polimerasi (Platinum Taq DNA Polymerase, Invitrogen), 1 U enzima UDG e 0,3 µM di ciascun
primer, pTaqMan136-F (+) (5’-TGCAGCTGGAGCAGTGG-3’) e pPyroPCR-R-biotinilato
(-) (5’-CCTTGGTGGTGGTGGTGA-3’).
Questi primers si legano al DNA target del
gene PrP ai codoni 119-125 e 198-192, rispettivamente. La reazione di amplificazione è stata eseguita secondo i seguenti parametri: attivazione UDG 2’ a 50°C, attivazione della Taq polimerasi 2’ a 95°C e 40
cicli di 30” a 94°C, 20” a 60°C e 20” a 72°C.
I prodotti di amplificazione sono stati analizzati per la determinazione dei polimorfismi del gene PrP ai codoni 136, 154 e 171
mediante Pyrosequencing.
Risultati
Le frequenze alleliche con relativi intervalli
di confidenza 95% e le frequenze genotipiche sono riportate rispettivamente nel
grafico 1 e nella tabella 2. Le analisi genetiche hanno mostrato una buona frequenza
dell’allele ARR, di poco inferiore al 40%
nelle razze Comisana e Sarda (37,4% e
38% rispettivamente) e superiore al 40%
(46,2%) nella Merinizzata. Di conseguenza
anche il genotipo associato a resistenza
ARR/ARR presenta frequenze soddisfacenti
(13,7% nella Comisana; 14,9% nella Sarda
e 22,1% nella Merinizzata).
I genotipi cosiddetti semi-resistenti (ARR/--,
escluso ARR/VRQ) rappresentano complessivamente il 43,2% (Comisana), 42,0% (Merinizzata) e il 45,6% (Sarda). Nelle razze
studiate è presente anche l’allele VRQ, da
sottoporre a selezione negativa (5,6% nella
Comisana; 7,8% nella Merinizzata e 0,2%
nella Sarda). L’allele wild-type ARQ, che in
Italia conferisce elevata sensibilità alla scrapie, è l’allele più frequente nella Comisana
(50%) e nella Sarda (58%), mentre nella
Merinizzata presenta frequenza (42,8%)
inferiore all’allele ARR.
In totale i genotipi considerati a rischio rappresentano una percentuale variabile dal
29,8 al 39,1%. L’allele ARH non è stato rile-
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vato nella razza Sarda. Nel grafico 2 gli
arieti sono stati raggruppati in base alle
classi di preferenza di impiego previste dal
D.M. 17/12/2004. La razza Sarda, possedendo una frequenza pressoché nulla dell’allele VRQ, non presenta arieti di cui sia
vietato l’impiego. Per le razze Comisana e
Merinizzata le percentuali di arieti di cui è
vietato l’utilizzo sono rispettivamente dell’11% e del 17%. Gli arieti di classe seconda costituiscono la percentuale più elevata
(dal 42 al 46%) e buona è la percentuale
degli arieti di classe prima (14% nella Comisana; 15% nella Sarda e 22% nella Merinizzata).
Analizzando i singoli allevamenti, si è
osservato che nel 63,4% di essi si trova
almeno un ariete di classe prima, nel
90,3% è presente almeno un ariete di classe seconda. Nel 98,9% degli allevamenti
sono presenti arieti di classe prima e/o
seconda e nessuno presenta solo arieti il
cui impiego è vietato.
Discussione
Le frequenze alleliche ottenute in Basilicata
per le tre razze ovine maggiormente rappresentate e analizzate nel presente studio
sono sostanzialmente simili a quelle attese,
in base agli studi effettuati su scala nazionale. La razza Merinizzata presenta frequenze alleliche sovrapponibili a quelle ot-
tenute dall’ASSO.NA.PA.: frequenza dell’allele ARR molto alta, con una presenza
non trascurabile dell’allele VRQ.
Per la razza Comisana in Basilicata si è rilevata una frequenza dell’allele ARR di poco
inferiore (37,4%) a quella riportata dalla
ASSO.NA.PA. (41,3%), che si sovrappone
ad essa con il limite superiore dell’intervallo di confidenza (41,6%) (grafico 1).
Rispetto a quanto segnalato a livello nazionale, in Basilicata anche la Comisana sembra avere una frequenza relativamente alta
dell’allele indesiderato VRQ (5,6% contro
l’1,2% stabilito dall’ ASSO.NA.PA.).
Per quanto riguarda la razza Sarda le frequenza dell’allele ARR in Basilicata (38%) si
avvicina a quella riportata per gli ovini della
Sardegna (43,07%), molto più alta di quella ottenuta dall’ASSO.NA.PA. sugli ovini di
razza Sarda provenienti dal territorio peninsulare (26,9%).
Si conferma invece la presenza, seppur
molto scarsa (0,2%), dell’allele VRQ, a differenza della popolazione insulare in cui
tale allele sembra assente.
La razza Merinizzata in Basilicata rientra
quindi nel gruppo delle razze con frequenza dell’allele ARR >40%, mentre la Comisana e la Sarda si trovano ai limiti tra i
due gruppi, presentando frequenza puntuale dell’allele ARR <40%, ma con i limiti
superiori degli intervalli di confidenza al di
sopra del 40%.
In ogni caso la situazione di tutte e tre le
razze sembra molto favorevole ai fini del
piano di selezione, date le elevate frequenze dei genotipi cosiddetti resistenti e
semi-resistenti e, di conseguenza, la disponibilità di un buon numero di riproduttori maschi di classe 1 e 2 (complessivamente sempre >50% del numero totale
degli arieti analizzati). Tali montoni sono
inoltre ben distribuiti negli allevamenti:
solo il 2,2% degli allevamenti analizzati
non possiede alcun ariete di prima e/o seconda classe e dovrebbe forse ricorrere
all’introduzione di riproduttori da altri allevamenti. La riscontrata assenza di allevamenti con solo montoni di cui è vietato
l’uso mostra inoltre come nessun allevatore
si troverebbe, in caso di adesione al piano,
nella condizione di dover abbattere tutti i
propri riproduttori maschi. Analogamente,
nessun allevamento sarebbe eccessivamente penalizzato dall’applicazione di un
abbattimento selettivo su base genetica, in
caso venisse in esso rilevata la presenza di
scrapie. Si può quindi affermare che il
piano regionale predisposto risulta idoneo, in quanto le razze ovine più rappresentate in Basilicata non necessitano di particolari cautele nell’applicazione del programma selettivo, che può portare ad un
rapido incremento della resistenza genetica alla scrapie senza ripercussioni sui caratteri produttivi.
Tabella 1 - Classificazione dei riproduttori in base al livello di rischio del genotipo
ai fini del loro impiego per il piano di selezione (D.M. 17/12/2004)
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Grafico 1 - Alleli del gene PrP rilevati nelle razze comprese nello studio
e loro frequenze.
Tabella 2 - Genotipi del gene PrP rilevati nelle razze comprese nello studio e loro frequenze (%)
Grafico 2 - Percentuale di arieti nelle diverse classi di preferenza di
impiego
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