Promotori ed elementi di regolazione Elementi cis- e trans- per la regolazione dell’espressione genica Cis-acting elements – Sequenze di DNA nella vicinanza della regione codificante di un gene che sono necessarie per l’espressione genica Trans-acting factors – fattori, di solito proteine, che si legano agli elementi cis- per il controllo dell’espressione genica Struttura e organizzazione di un gene eucariotico Elementi comuni presenti in quasi tutti i promotori: CAAT box. Una sequenza consenso vicino a -80 bp dal punto di inizio della trascrizione (+1). Aumenta la forza del promotore; sembra funzionare in entrambi gli orientamenti. Nelle piante questo box è rimpiazzato da una sequnza consenso chiamata AGGA box. E’ il sito di legame del fattore di trascrizione CTF/NF1; Muller, et al. 1988. Eur. J. Biochem. 176:485 TATA box. Sequenza di solito localizzata intorno a 25 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. In genere tende ad essere circondata da sequenze ricche in GC. E’ il sito di legame per l’RNA polimerasi II e una serie di fattori di trascrizione (TFIIX, dove X è una lettera che indica uno specifico fattore di trascrizione) che formano il complesso di inizio; il primo di questi è il TFIID; Workman & Roeder, 1987. Cell 51:613 GC box. Un sequenza ricca in G e C, di solito è presente in copie multiple , normalmente intorno al TATA Box. E’ il sito di legame del fattore di trascrizione SP1; Anderson & Freytag, 1991. Mol. Cel. Biol. 11:1935 CAP site. Sequenza di inizio della trascrizione definito +1, in cui il processo di trascrizione inizia. Struttura del complesso di trascrizione dell’RNA polimerasi II e sequenza di assemblaggio Le tre principali categorie dei fattori di trascrizione Gli attivatori modulano a distanza la regolazione genica Introni, attivatori (Enhancer) e regioni di attacco (Attached regions) Queste regioni contribuiscono a regolare l’espressione genica. Possono costituire delle porzioni aggiuntive di DNA nel costrutto da utilizzare nella trasformazione genetica di tessuti vegetali per aumentare, modulare o stabilizzare l’espressione genica. Ad esempio le regioni MAR o SAR (Sito di attacco alla matrice, Matrix attachment regions o sito di attacco all’impalcatura, Scaffold attachment Regions) vengono utilizzate per stabilizzare l’espressione genica soprattutto nel caso di trasformazioni genetiche effettuate con il metodo biolistico, dove il numero di copie può essere elevato. MAR o SAR: Regione del DNA che si attacca alla matrice nucleare. Matrice nucleare: Rete di fibre che circonda il nucleo e penetra al suo interno. Nuclear scaffold e MAR Regioni MAR (regioni di attacco alla matrice) possono regolare l’espressione genica Analisi dei promotori, identificazione degli elementi cis- e loro analisi funzionale Identificazione di elementi promotori funzionali mediante analisi footprinting Footprinting: es. Determinazione del sito di legame del repressore lac Espressione con i geni reporter •GUS •GFP Saggio GUS (b-glucuronidasi) •Si esegue 2-3 giorni dopo la trasformazione del tessuto •Il tessuto sottoposto a trasformazione viene immerso per 16-24 ore in una soluzione contenente 5-Bromo-4-Cloro-3indolil-b-D-acido glucuronico (X-gluc). •L’eventuale attività enzimatica viene evidenziata nel tessuto intatto come delle macchie blu. Vantaggi: • Semplicità di esecuzione e non necessità di apparecchiature particolari. • Può essere anche quantitativo. • In tal caso si quantifica l’attività GUS mediante saggio fluorometrico usando come substrato il 4metilumbelliferil b-D-glucuronide (MUG). Questa analisi implica l’estrazione dell’enzima e la successiva analisi dell’attività GUS. Comunque il vantaggio principale risiede nella semplicità del saggio istochimico. Svantaggi: La colorazione istochimica causa la morte del tessuto. Saggio GFP E’ forse il gene reporter attualmente più utilizzato La GFP è una proteina di 238 amminoacidi della medusa Aequorea victoria. I componenti richiesti per la bioluminescenza dell’equorea victoria includono: • Equorina, una fotoproteina attivata dal Ca++ che emette luce blu-verde •Green Fluorescent Protein (GFP), una proteina fluorescente verde, che accetta energia dall’equorina e la riemette come luce verde. La fluorescenza intrinseca della GFP è dovuta a 3 amminoacidi (Ser-65-Tyr-66-Gly-67) che ciclizzano formando un cromoforo che ha due massimi di eccitazione: •con luce UV (396 nm) •luce blu (475 nm). I massimi di emissione della luce sono rispettivamente a 508 e 503 nm. Sono state prodotte diverse versioni modificate della GFP in modo da renderla più adatta come reporter. Una delle modificazioni più efficaci ha riguardato la sostituzione della Ser-65 con una Thr. La GFP’S65T’ possiede: •un solo picco massimo di eccitazione alla luce blu •un più forte segnale fluorescente rispetto alla proteina nativa, rendendo più semplice il suo rilevamento. Localizzazione apoplastica della proteina di fusione BjEXPA1::GFP in cellule epidermiche di cipolla Saggi transienti per l’espressione genica Geni Reporter- sommario I geni reporter sono geni che codificano per proteine facilmente saggiabili. Sono utilizzati da soli o in combinazione con altre regioni codificanti il cui prodotto proteico è difficile da saggiare (proteine di fusione) I più comuni geni reporter sono: GFP (green fluorescent protein): Emissione fluorescente dopo eccitazione (rilevamento in situ mediante i sistemi DIANA, LAS o FLA). GUS (b-glucuronidasi): idrolizza glucuronodi incolori producendo un prodotto colorato. Utilizzo dei geni reporter per: •Attività regolativa di una sequenza di DNA -1 -2000 GUS -1500 GUS -800 GUS -300 GUS Utilizzo dei geni reporter per: •Determinazione della ‘Forza’ dei Promotori Attività di alcuni promotori in saggi transienti con GFP Utilizzo dei geni reporter per: •Determinazione della tessuto-specificità Es: Espressione nello stigma e nel tessuto vascolare del gene Pvpgip1 Utilizzo dei geni reporter per: •Scelta del tessuto per la trasformazione •Embrioni immaturi •Dischi fogliari •Meristemi apicali Utilizzo dei geni reporter per: •Scelta delle condizioni per la trasformazione Tipi di promotori •Promotori costitutivi •Promotori tessuto specifici o stadio di sviluppo specifici •Promotori inducibili •Promotori sintetici Promotori costitutivi Promotore 35S del Virus del Mosaico del Cavolfiore (CaMV 35S) •Subdomain A: -46 10 +1 corrisponde al promotore minimo •Subdomain B: -208 to -46 corrisponde ad una regione enhancer •Può essere usato nella combinazione 35S duplicato, per una maggiore espressione Promotore dell’Ubiquitina di mais (Ubi-1) -214 -204 Jones et al. 2006 Options mediterraneennes 81 Promotori tessuto-specifici Esempi di promotori tessuto specifici brevettati Es: Dx5-Promotore delle glutenine ad alto peso molecolare Radici Foglie Glume Jones et al. 2006 Options mediterraneennes 81 Promotori inducibili Sono indotti in seguito alla presenza o assenza di specifici fattori biotici o abiotici I geni sotto il controllo di questi promotori possono essere attivati o disattivati a specifici stadi di sviluppo o in specifici tessuti Esempio di promotori indotti da fattori chimici o fisici •Promotori regolati da fattori chimici: alcool, tetraciclina, steroidi, metalli ed altri composti •Promotori regolati da fattori fisici: luce e temperatura Caratteristiche ideali di un sistema chimico-inducibile in pianta • Livello di espressione costitutivo basso • Alta inducibilità • Elevata specificità rispetto all’induttore • Elevata variabilità di risposta rispetto alle concentrazioni dell’induttore • Risposta rapida dopo l’induzione • Rapido silenziamento in seguito alla rimozione dell’induttore • Induttore non tossico e privo di effetti fisiologici sulla pianta • Induttore assente nelle piante bersaglio Sistema di espressione indotto dall’etanolo Anche il ferimento meccanico può indurre una specifica espressione genica Pathogenesis-related gene promoters Promotori sintetici Promotori maggiormente usati nella trasformazione di piante coltivate •Promotore 35S dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) •nos 5’: regione regolatrice del gene della nopalina sintetasi (NOS) dal T-DNA di Agrobacterium tumefaciens •Promotore dell’ ubiquitina di mais (Ubi ) •Promotore endosperma specifico: gluteline riso e glutenine frumento Esempio di applicazione di specifici promotori Tecnologia ‘Terminator Chrispeels e Sadava: Genetica, Biotecnologie e Agricoltura Sostenibile. IdelsonGnocchi. Box 9.2 pag. 261 Questa tecnologia consiste nell’uso di una serie di ‘interrutori’ molecolari che possono essere attivati nelle piante transgeniche per uccidere l’embrione e impedire così la germinazione dei semi transgenici. Molecole coinvolte Gene I: Ricombinasi Enzima che riconosce un tratto specifico di DNA lo rimuove e riunisce le due estremità di taglio Gene II: Inibitore della ricombinasi sotto il controllo di un promotore reprimibile Gene III: Tossina La proteina codificata da questo gene è letale per l’embrione ed è sotto il controllo di un promotore tardivo (late promoter, LP) che è attivo soltanto nelle fasi finali dello sviluppo dell’embrione ‘Blocker’: segmento di DNA posto tra il promotore e la regione codificante della tossina composto da sequenze riconosciute dalla ricombinasi. La presenza del ‘blocker’ interferisce con la capacità del promotore di regolare l’espressione del gene per la tossina Induttore: Sostanza con la quale la Ditta Sementiera tratta i semi transgenici Gene Ricombinasi Gene Inibitore Promotore reprimibile Promotore tardivo Blocker Gene Letale Meccanismo di funzionamento Gene Ricombinasi Promotore trardivo Gene Ricombinasi Gene Inibitore Blocker Gene Letale Nei semi non trattati con l’induttore Gene Inibitore Gene Letale Tossina Nei semi trattatti con l’induttore